高效氯氰菊酯暴露對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響

周永江 方方 李超 高明妃 郭澤莉

摘要：目的? 探討高效氯氰菊酯暴露對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響。方法? 將SPF級(jí)斷奶昆明雌鼠40只隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只，以灌胃方式染毒90 d。對(duì)照組給予玉米油灌胃;實(shí)驗(yàn)組給予10 mg/（kg·bw·d）β-CP+玉米油灌胃。染毒結(jié)束后，隨機(jī)抽取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只發(fā)情期雌鼠分別與雄鼠合攏，次日清晨見陰栓記為孕1 d（D1），于D8 d處死小鼠。各組剩余雌鼠與輸精管結(jié)扎的雄鼠合籠建立假孕模型，于假孕第4天（PD4）小鼠宮角注射玉米油。D8和PD8 d摘取小鼠子宮，觀察胚胎著床情況和蛻膜化誘導(dǎo)情況及鏡下觀察子宮內(nèi)膜厚度。采用RT-PCR和ELISA法分別檢測(cè)檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子dtPRP和BMP2的表達(dá)。結(jié)果? β-CP暴露降低了小鼠蛻膜化誘導(dǎo)成功率，降低了子宮內(nèi)膜厚度及dtPRP和BMP2的表達(dá)（P<0.05）。與對(duì)照組的人工誘導(dǎo)蛻膜化成功率（100.00%）相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的人工誘導(dǎo)蛻膜化成功率（30%）下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=10.77，P<0.05）。結(jié)論? β-CP暴露通過抑制dtPRP和BMP2的表達(dá)影響小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化，降低了子宮內(nèi)膜厚度，影響了胚胎著床。

關(guān)鍵詞：高效氯氰菊酯;子宮內(nèi)膜蛻膜化;小鼠

中圖分類號(hào)：R114;R711.6;? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.03.020

文章編號(hào)：1006-1959（2019）03-0061-04

Abstract：Objective? To study the effect of beta-cypermethrin on deciduation of endometrium in female mice. Methods? 40 female Kunming mice of SPF grade weaning were randomly divided into two groups： control group and contamintated group with 20 each，and were contamintated by the way of lavage for 90 d.The control group was lavaged with corn oil.The contamintated group was lavaged with 10mg/（kg·bw·d）β-CP+corn oil.At the end of contamination， 10 female mice in the control group and 10 mice in the contamintated group were randomly selected to put in a same cage with the male mouse respectively. Early the next morning，Yin suppository was recorded as the first day of pregnancy（D1），and the mice were killed on D8 d.The model of pseudopregnancy was established by putting the remaining female mice in each group and male mice ligated by vasectomy in a same cage.Corn oil was injected into the uterine horn of mice on the 4th day of pseudopregnition（PD4）.The embryo implantation， decidualization induction and endometrial thickness were observed by D8 and PD8 d.The expression of dtPRP and BMP2 were detected by RT-PCR and ELISA，respectively.Results β-CP contamination decreased the success rate of decidualization induction， the thickness of endometrium and the expression of dtPRP and BMP2 in mouse decidua （P<0.05）.Compared with the control group， the success rate of artificial induced deciduation （100.00%） in the experimental group decreased （30%）， and the difference was statistically significant （？字2=10.77， P<0.05）.Conclusion? β-CP contamination affects decidualization of mice endometrium by inhibiting the expression of dtPRP and BMP2，decreases the thickness of endometrium and affects embryo implantation.

Key words：Beta-cypermethrin;Endometrial decidua;Mice

高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin，β-CP）作為一種高效、廣譜、速效的殺蟲劑，被廣泛使用[1]。β-CP是從普通氯氰菊酯（cypermethrin，CP）經(jīng)差向異構(gòu)得到兩對(duì)活性較高的對(duì)映體，即順式氯氰菊酯（α-CP）和反式氯氰菊酯（β-CP），β-CP活性比CP高1倍，且對(duì)光穩(wěn)定[2]。因此，其殘留對(duì)人體健康的潛在危害不容忽視。β-CP主要用于防治果蔬、茶葉、谷物等作物上的食葉或食果害蟲[3]，因其高殘留性使得β-CP在水、土壤中均有殘留，在許多食材中也檢測(cè)出其殘留，如甘藍(lán)、青菜、葉用萵苣、芹菜、韭菜、通心菜等[4，5]。最近的一項(xiàng)調(diào)查指出在定西地區(qū)市售蔬菜擬除蟲菊酯類農(nóng)藥總檢出率為45.0%，超標(biāo)農(nóng)藥主要為氯氰菊酯和β-CP[5]。β-CP具有神經(jīng)毒性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明可能通過降低多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量，導(dǎo)致神經(jīng)毒性[6]。人體接觸中毒后可出現(xiàn)頭疼、頭暈、胸悶、惡心，煩躁、胡言亂語、四肢無力等癥狀[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，β-CP可破壞雄性小鼠的生精小管并且影響精子的發(fā)生，進(jìn)而造成睪丸組織中精母細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，精子畸形[8]。當(dāng)β-CP作用于雄性大鼠后，體重、顯著降低，睪丸和精囊顯著增大[9]，血清和睪丸中的睪酮、黃體生成素、卵泡刺激素水平發(fā)生顯著變化[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠孕期接觸β-CP可使雌性小鼠妊娠時(shí)間延長，隨著β-CP劑量的增加，小鼠分娩率和平均產(chǎn)仔數(shù)均有下降趨勢(shì)[11]。處于染毒早期的大鼠受孕率和胚胎著床數(shù)減少，死胎增多。β-CP暴露是否會(huì)影響子宮內(nèi)膜蛻膜化了，目前還未見報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，β-CP暴露降低了胚胎植入率，使雌鼠的血清雌二醇水平上升、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素的血清水平下降，卵巢結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，各級(jí)卵泡數(shù)量隨染毒濃度的增加而減少[12，13]，但未能揭示β-CP暴露是否會(huì)對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化產(chǎn)生影響。因此，本實(shí)驗(yàn)是在此研究基礎(chǔ)上，通過建立雌性小鼠 β-CP染毒模型對(duì)孕期蛻膜化分子標(biāo)志物dtPRP、子宮內(nèi)膜厚度的觀察測(cè)量以及BMP2的檢測(cè)，探索β-CP對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化建立的影響，為更深入研究其雌性生殖毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? SPF級(jí)斷奶昆明雌鼠，購買于長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房?jī)?nèi)。動(dòng)物飼料及墊料購買于長沙天勤生物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到海南醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑? β-CP（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，Cas號(hào)：65731-84-2）;細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）;Primers[生工生物工程（上海）股份有限公司];PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[寶生物工程（大連）有限公司]。

1.2構(gòu)建β-CP染毒模型? SPF級(jí)斷奶昆明雌鼠40只，體重10～15 g， 3周齡，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只。小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，于每天早上9點(diǎn)以灌胃方式染毒，染毒時(shí)間設(shè)定為90 d;實(shí)驗(yàn)組：灌胃10 mg/（Kg·bw·d）β-CP+玉米油。對(duì)照組：灌胃等量玉米油;染毒期間自由進(jìn)食與飲水，每2 d更換墊料，清洗盒子并對(duì)其消毒，稱量體重，記錄攝食量。染毒結(jié)束后先對(duì)各組小鼠體重稱量并記錄。染毒后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

各組小鼠灌胃溶質(zhì)和溶劑計(jì)算方法：每周1次稱量各組小鼠體重，計(jì)算各組小鼠的平均體重值M（g）。依據(jù)上述各染毒組濃度結(jié)合各組小鼠平均體重計(jì)算出各染毒組灌胃溶質(zhì)量;結(jié)合各組小鼠平均體重（g），依灌胃容量為0.01 ml/g計(jì)算各組灌胃體積，即溶劑玉米油體積。

1.3建立小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型? 小鼠子宮內(nèi)膜自然蛻膜化模型：染毒結(jié)束后隨機(jī)選取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只雌鼠分別與性成熟雄鼠按3∶1合籠交配，次日清晨見陰栓記為孕第1天（D1），于D8天上午頸椎脫臼法處死小鼠，摘取小鼠子宮，計(jì)數(shù)小鼠胚泡。小鼠子宮內(nèi)膜人工誘導(dǎo)蛻膜化模型：染毒結(jié)束后隨機(jī)選取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只發(fā)情期的雌鼠與輸精管結(jié)扎的雄鼠也按3∶1合籠交配，次日為假孕第1天（PD1）。PD4小鼠清晨雙側(cè)宮角注射玉米油各25 μL，至PD8上午取材。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)dtPRP在小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平? 刮取D8和PD8雌鼠子宮內(nèi)膜組織：摘取小鼠子宮，剔凈脂肪和系膜組織，沿子宮縱軸切開子宮，機(jī)械刮取內(nèi)膜組織，PBS清洗3次備用提取RNA檢查dtPRP的mRNA表達(dá)水平。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成DNA，之后Real-time PCR 法進(jìn)行定量測(cè)定RNA。引物序列為Dtprp：Forward：5'-AGCCAGAAATCACTGCCACT-3';Rerverse：5'-TGA TCCATGCACCCATAAAA-3';β-actin：Forward：5'-GTGGGGCCCCAGGCACCA-3'; 5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.5 ELISA檢測(cè)BMP2在小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)? 取部分小鼠子宮內(nèi)膜組織于勻漿器中加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，同時(shí)進(jìn)行機(jī)械勻漿、分離，收集上清液，采用ELISA法檢測(cè)BMP2。測(cè)試步驟嚴(yán)格按照試劑盒提供的參考方法進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)分析? 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel整理，SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有統(tǒng)計(jì)圖采用Graph Pad Prism 5.0軟件繪制。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用？字2檢驗(yàn)， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠一般情況比較? 染毒期間各組小鼠均無死亡且飲食、行為活動(dòng)等無異常。染毒后，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.102，P=0.006）。

2.2 β-CP暴露對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響? 對(duì)照組成功誘導(dǎo)10例，實(shí)驗(yàn)組成功誘導(dǎo)3例，與對(duì)照組的人工誘導(dǎo)蛻膜化成功率（100.00%）相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的人工誘導(dǎo)蛻膜化成功率（30.00%）下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=10.77，P<0.05）。

2.3 β-CP暴露對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜厚度的影響 在小鼠子宮內(nèi)膜自然蛻膜化過程中，實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮內(nèi)膜厚度與對(duì)照組相比顯著變薄，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.595，P<0.05）。在人工誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中，實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮內(nèi)膜厚度與對(duì)照組相比顯著變薄，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.544，P<0.05）。人工誘導(dǎo)蛻膜化的實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮內(nèi)膜厚度與自然蛻膜化的實(shí)驗(yàn)組小鼠相比，內(nèi)膜厚度有所增厚，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 β-CP暴露對(duì)dtPRP在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的影響? 染毒后，實(shí)驗(yàn)組dtPRP在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)與對(duì)照組相比發(fā)生了顯著變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.762，P<0.05），在自然誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中，實(shí)驗(yàn)組dtPRP在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)與對(duì)照組相比，顯著下調(diào)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。染毒后，實(shí)驗(yàn)組dtPRP在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與對(duì)照組相比發(fā)生了顯著變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.544，P<0.05），在人工誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中，實(shí)驗(yàn)組dtPRP在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)與對(duì)照組相比，顯著下調(diào)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 β-CP暴露對(duì)BMP2在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的影響? 在自然誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中，BMP2在實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)與對(duì)照組相比，表達(dá)顯著下調(diào)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.133，P<0.05）。在人工誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中，BMP2在實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)與對(duì)照組相比，表達(dá)顯著降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.111，P<0.05）。

2.6 β-CP暴露對(duì)小鼠胚胎著床的影響? 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組胚胎著床數(shù)減少，但結(jié)果未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.089）。

3討論

子宮內(nèi)膜蛻膜化是子宮內(nèi)膜的一種特殊分化過程，與妊娠有著密切聯(lián)系。蛻膜化包括子宮腺的內(nèi)分泌改變、基質(zhì)細(xì)胞的分化、子宮自然殺傷細(xì)胞的積聚和血管再生。蛻膜化的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cells，ESCs），在細(xì)胞形態(tài)和功能上都發(fā)生明顯變化，細(xì)胞的形態(tài)由梭形逐漸變?yōu)槎嘟切?，胞體大而圓，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞間的界線不清[14]，人類子宮內(nèi)容蛻膜化受多種激素的調(diào)節(jié)，孕酮誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化為蛻膜細(xì)胞[15]。本研究采用小鼠妊娠D8處死小鼠，獲取子宮組織，這種方法獲得的子宮組織是已經(jīng)產(chǎn)生蛻膜化的組織，即無需人工激素處理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-CP暴露小鼠蛻膜化誘導(dǎo)成功率顯著下降，子宮內(nèi)膜厚度顯著變薄。可能的原因是β-CP影響了dtPRP和BPM2在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)表達(dá)起到了抑制作用。

既往研究報(bào)道可采用如注射芝麻油、玻璃珠及子宮劃傷等人工誘導(dǎo)的方法模擬蛻膜化過程，同時(shí)檢測(cè)標(biāo)志分子，比如dtPRP、PR、Cyclin D3、PRL、ALP（堿性磷酸酶）等來判斷誘導(dǎo)是否成功[16]。分泌催乳素即（dtPRP），被廣泛認(rèn)為是ESCs蛻膜化的標(biāo)志[17]。本研究中，采用了檢測(cè)dtPRP 和BMP2在蛻膜化組織的表達(dá)。β-CP暴露后，dtPRP在小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)隨著β-CP暴露染毒劑量的增加而下調(diào)。BMP2是BMP/Smads通路的相關(guān)基因，是調(diào)控成骨的重要通路之一[18]。文獻(xiàn)指出，BMP2能促進(jìn)人ESCs蛻膜化，當(dāng)BMP2的表達(dá)受到抑制時(shí)，將造成不孕和妊娠損失[19]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)β-CP下調(diào)BMP2在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)時(shí)，蛻膜化誘導(dǎo)成功率降低顯著，子宮內(nèi)膜厚度也顯著變薄。β-CP可能直接或間接的抑制了BMP2在蛻膜組織中的表達(dá)。

綜上所述，β-CP暴露顯著降低了dtPRP和BMP2表達(dá)，降低了子宮內(nèi)膜厚度，減少了胚胎著床率。β-CP對(duì)雌鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進(jìn)程有干擾作用，但確切的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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收稿日期：2018-12-16;修回日期：2018-12-25

編輯/肖婷婷