利用基因拆分技術(shù)培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的研究

董玉鳳 王旭靜 宋亞亞 靳 茜 王志興,*

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利用基因拆分技術(shù)培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的研究

董玉鳳1王旭靜1宋亞亞1靳 茜2王志興1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)(分子)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081;2保定學(xué)院, 河北保定 071000

耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻基因飄流可能產(chǎn)生的環(huán)境安全問題是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一, 并已成為耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻能否在我國生產(chǎn)上發(fā)揮效益的限制因素。基因拆分技術(shù)能夠有效地控制轉(zhuǎn)基因目標(biāo)性狀飄流, 為培育耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻提供新的途徑和思路。本研究將耐除草劑基因拆分成N端(EPSPSn, 1~295 aa)和C端(EPSPSc, 296~435 aa), 分別與DnaE蛋白內(nèi)含肽的N端(Intein-N)和C端(Intein-C)連接形成融合基因與, 并分別通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入受體材料中花11。Southern雜交證明轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22中外源基因?yàn)閱慰截惒迦?。?cè)翼序列分析證明轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22中外源基因分別插入第2和第6染色體。利用四引物法篩選出轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22的純合系, 并通過有性雜交獲得同時(shí)含有與的轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec。草甘膦抗性分析發(fā)現(xiàn), 單獨(dú)含有1個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22不具有耐受草甘膦特性, 而同時(shí)含有2個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec具有耐受草甘膦的特性, 說明拆分后的2個(gè)蛋白片段在intein的介導(dǎo)下重新組裝成完整有功能蛋白, 并賦予轉(zhuǎn)基因水稻耐受草甘膦的特性。轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec與含有完整轉(zhuǎn)基因水稻G2-6相比, 其耐受草甘膦的能力有所下降, 但能夠滿足生產(chǎn)需求。本研究結(jié)果為利用基因拆分技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因耐草甘膦水稻提供了科學(xué)依據(jù), 同時(shí)也為利用基因工程手段培育轉(zhuǎn)基因雜交稻提供了新的技術(shù)平臺。

耐草甘膦; 轉(zhuǎn)基因水稻; 基因拆分技術(shù)

稻田雜草與水稻競爭水、肥、空間和傳播病蟲害而對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響。在勞動力匱乏、人工成本逐年增加的情況下, 化學(xué)除草因省工省力等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。稻田雜草種類比較多, 選擇性除草劑如 50% 優(yōu)克稗乳油和幼禾保等只能對某一類雜草起作用, 無法達(dá)到完全控制雜草的效果。草甘膦為廣譜滅生性和內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑, 能殺死全部雜草, 但同時(shí)對水稻也具有滅殺作用。因此, 稻田中使用草甘膦的前提是培育抗草甘膦的水稻品種。

基因工程技術(shù)的發(fā)展為培育抗草甘膦水稻提供了新途徑, 并取得了一些進(jìn)展。研究者們通過將不同的耐草甘膦基因?qū)胨? 獲得了具有不同草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因水稻新種質(zhì)[1-5]。但同時(shí)也引發(fā)了人們對其安全性的關(guān)注, 關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一是耐草甘膦基因通過花粉介導(dǎo)飄流至有性可交配野生種或雜草后, 是否會演變?yōu)殡y以防治的“超級雜草”[6], 對生物多樣性產(chǎn)生一定的影響。目前普遍認(rèn)同的防控轉(zhuǎn)基因飄流的主要方法是物理隔離, 在出臺的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法中, 規(guī)定了轉(zhuǎn)基因水稻的隔離距離為100 m, 這在我國小農(nóng)經(jīng)濟(jì)的國情下, 實(shí)施起來具有一定的困難, 并提高了研發(fā)成本?；趦?nèi)含肽的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)剪接功能建立起來的基因拆分技術(shù)為培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻提供了新的思路, 利用此方法培育的轉(zhuǎn)基因水稻能有效防控耐草甘膦性狀向有性可交配物種的轉(zhuǎn)移, 避免因基因飄流可能帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

基因拆分技術(shù)是建立在蛋白內(nèi)含肽(Intein)及其介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)剪接的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的, 簡單說就是將目的基因拆分成兩個(gè)基因片段, 分別與Intein兩個(gè)剪接域的基因序列結(jié)合, 形成融合基因, 翻譯后形成的兩個(gè)融合蛋白通過Intein介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)剪接功能, 將Intein從前體蛋白中切除, 同時(shí)將兩個(gè)基因片段編碼的蛋白序列連接起來, 形成一個(gè)完整的、有功能的蛋白。sp. PCC6803 DnaE Intein (DnaE Intein)是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的天然存在的 trans-splicing intein, 它存在于編碼復(fù)制 DNA 聚合酶III的催化亞基a的DnaE基因中, 有123個(gè)氨基酸殘基的In (Intein N端)和36個(gè)氨基酸殘基的Ic (Intein C端)兩個(gè)片段組成, In和Ic間插入了745 kb的DNA間隔區(qū)域[7]。與人工合成的Intein相比,DnaE Intein 催化的蛋白剪接反應(yīng)有效率高和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn), 且DnaE Intein片段In和Ic離體條件下不經(jīng)尿素處理也能進(jìn)行剪接[8]。實(shí)驗(yàn)證明DnaE Intein在離體、活體條件下均能進(jìn)行蛋白質(zhì)的剪接反應(yīng), 使分開的兩個(gè)基因片段表達(dá)后的蛋白片段重新組裝成有功能的完整蛋白質(zhì)[9]。目前已在煙草、擬南芥、小麥等作物中證明拆分后的目標(biāo)基因能夠在DnaE intein介導(dǎo)下重新組裝成完整有功能蛋白[10-16]。

基因克隆自極端草甘膦污染環(huán)境, 轉(zhuǎn)棉花、煙草、玉米、水稻等對草甘膦有較高的抗性[17-20]。G2-aroA蛋白在F295/S296的位置拆分后, 通過DnaE intein介導(dǎo)能重新組裝成完整有功能蛋白[21-22]。本研究利用和DnaE intein的蛋白轉(zhuǎn)剪接功能, 培育出了有效降低功能基因飄流頻率的耐草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻。此研究不但為耐草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)提供了新種質(zhì), 也為培育雜交轉(zhuǎn)基因水稻提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水稻轉(zhuǎn)化所用受體材料中花11 (ZH11)和轉(zhuǎn)完整基因水稻G2-6為本實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)載體13UEI [含有基因的N端(1~295氨基酸的編碼序列) EPSPSn和DnaE Intein的N端結(jié)構(gòu)域In的融合基因片段]和13UIC [含有基因的C端(296~445氨基酸的編碼序列) EPSPSc和DnaE Intein的C端結(jié)構(gòu)域Ic的融合基因片段Ic-EPSPSc]為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。農(nóng)達(dá)(Roundup)購自Monsanto公司; 其他分析純化學(xué)藥品、抗生素以及激素等購自拜爾迪公司。本研究所用引物見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水稻遺傳轉(zhuǎn)化 采用熱激法將含有不同融合基因片段的植物表達(dá)載體13UEI和13UIC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 EHA105, 依據(jù)已報(bào)道的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化水稻品種中花11[23]。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻的拷貝數(shù)分析 利用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片基因組DNA?；蚪MDNA經(jīng)RI或dIII酶切, 酶切產(chǎn)物用于Southern雜交分析。按照地高辛標(biāo)記試劑盒(DIG High Primer DNA Labeled and Detection Starter Kit II, Roche)說明書進(jìn)行Southern雜交。參照PCR法標(biāo)記地高辛探針的試劑盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit, Roche)說明書進(jìn)行探針標(biāo)記, 其中EnIn535F/ EnIn535R用于克隆檢測基因的探針, IcEc459F/IcEc459R用于克隆檢測基因的探針。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的側(cè)翼序列分析 用CTAB 法提取水稻基因組DNA, 根據(jù)植物表達(dá)載體13UEI 和 13UIC上T-DNA左邊界附近的潮霉素篩選標(biāo)記基因設(shè)計(jì)3個(gè)用于特異引物hptII-tail-1、hptII-tail-2、hptII-tail-3 以及用于檢測擴(kuò)增條帶特異性的 hptII-text-323, 利用染色體步移技術(shù)克隆側(cè)翼序列, 具體操作參照試劑盒(Genome Walking Kit, TaKaRa)說明書。根據(jù)獲得的側(cè)翼序列和公布的水稻基因組序列, 設(shè)計(jì)引物12-RF和22-RF, 根據(jù)T-DNA右邊界附近序列設(shè)計(jì)引物RB-R, 利用同源克隆的方法獲得另一側(cè)的側(cè)翼序列。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻純合系篩選 依據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22中外源基因在水稻基因組中的整合位點(diǎn)序列和T-DNA插入序列, 分別設(shè)計(jì)12-TF/12-TR、22-TF/22-TR、12-OsF/12-OsR和22-OsF/22-OsR引物對, 利用12-TF/12-TR和12-OsF/12-OsR 兩對特異引物對轉(zhuǎn)基因植株En-12進(jìn)行PCR檢測, 利用22-TF/22-TR和22-OsF/22-OsR兩對特異引物對轉(zhuǎn)基因植株Ec-22進(jìn)行PCR檢測, 篩選出En-12和Ec-22的轉(zhuǎn)基因純合系。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因水稻的草甘膦抗性分析 1)葉面噴施法: 水稻三至五葉期, 田間噴施2000 mg L–1的草甘膦, 10 d后觀察植株的生長情況。同時(shí)在室內(nèi)將轉(zhuǎn)基因水稻En-12×Ec-22以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1的種子消毒并催芽, 均勻地種植在8 cm × 8 cm培養(yǎng)缽中, 三至五葉期開始噴施不同濃度的草甘膦。在噴施當(dāng)天和噴施后12 d測量株高, 使用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析噴施前后水稻株高與葉片生長速率, 評定毒害效果, 并使用Graph Pad 6.0軟件繪圖。2)水培法: 將水稻種子消毒后在4℃黑暗條件放置2 d, 而后37℃黑暗培養(yǎng)。待種子冒白后輕輕移入去除底部的96孔板中, 放于含有不同濃度草甘膦的 1/2 Yoshida培養(yǎng)液(1 mmol L–1NH4NO3, pH 5.5)中培養(yǎng)10 d, 每天更換營養(yǎng)液一次。所有水培植物在人工氣候室內(nèi)生長(14 h/10 h光照/黑暗, 光子流量密度500 μmol m–2s–1PAR, 相對濕度為90%)。在不同濃度草甘膦濃度培養(yǎng)狀態(tài)下, 植物地上部株高可直接反應(yīng)植物對草甘膦的耐受性。每個(gè)樣品處理的植株數(shù)為30~40株。在草甘膦抗性分析過程中, 為了去除En-12抗性分析過程中中的偽雜種, 噴施草甘膦之前提取樣品的葉片DNA, 利用22-TF/22-TR和12-TF/12-TR對En×Ec進(jìn)行PCR檢測, 依據(jù)檢查結(jié)果拔除偽雜種。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因水稻的RT-PCR檢測 提取水稻總 RNA 并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA, 以cDNA為模板, 以外源目的基因特異引物En535F/En535R、Ec459F/Ec459R、內(nèi)標(biāo)基因特異引物對sps155-F/sps155-R進(jìn)行PCR檢測, 反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性10 min, 94℃ 1 min, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30個(gè)循環(huán), 72℃ 延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 含有單個(gè)基因片段轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22 的選育

將分別含有和融合基因的植物表達(dá)載體13UEI和13UIC通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻中花11, 獲得含有的轉(zhuǎn)基因水稻En 52株, 含有的轉(zhuǎn)基因水稻Ec 46株(圖1和圖2)。Southern雜交證明轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22為外源基因單拷貝插入(圖3)。

圖1 水稻轉(zhuǎn)化用植物表達(dá)載體中外源基因表達(dá)盒示意圖

Plasmid: 轉(zhuǎn)化載體的名稱; Transgenic plant: 轉(zhuǎn)基因水稻的名稱; UbiP: 玉米多聚泛素蛋白基因Ubiqutin啟動子; CTS: 菊花Rubisco小亞基的葉綠體信號肽; NosT: 胭脂堿合酶基因Nos的終止子; 35SP: 花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子;: 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因; PolyA Signal: 多聚腺苷酸加尾信號; GUSA: β-葡萄糖苷酸酶基因; Nos PolyA: 來自于Nos基因的多聚腺苷酸加尾信號; RB: T-DNA右邊界; LB: T-DNA左邊界。

Plasmid: Construct names; Transgenic plant: the name of different transgenic rice; UbiP: Ubiqutin promoter from maize; CTS: Rubisco small subunit chloroplast signal peptide from; NosT: nopaline synthase gene terminator; 35SP: Cauliflower mosaic virus CaMV 35S promoter;: Hygromycin phosphotransferase gene; PolyA Signal: Polyadenylation tail signal; GUSA: β-Glucuronidase gene; Nos PolyA: Polyadenylation tail from nopaline synthase gene; RB: T-DNA right border; LB: T-DNA left border.

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測

上圖: En檢測。M: 5 kb DNA marker (5000 bp, 3000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 800 bp, 500 bp, 300 bp); 1~14: 轉(zhuǎn)基因水稻; 15: CK-; 16: CK+。下圖: Ec檢測。M: 100 bp DNA marker (1500 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp); 1~14: 轉(zhuǎn)基因水稻; 15: CK-; 16: CK+。

Up: For transgenic rice En detection. M: 5 kb DNA marker (5000 bp, 3000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 800 bp, 500 bp, 300 bp); 1-14: Transgenic rice; 15: CK-; 16: CK+.Down: For transgenic rice Ec detection. M: 100 bp DNA marker (1500 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp); 1–14: Transgenic rice; 15: CK-; 16: CK+.

圖3 轉(zhuǎn)基因水稻的Southern雜交

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec的培育

利用染色體步移和同源克隆技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻En-12和Ec-22中外源基因整合位點(diǎn)的側(cè)翼序列。序列分析發(fā)現(xiàn): 在轉(zhuǎn)基因水稻En-12中, T-DNA插入到水稻基因組第2染色體的31,252,771~ 31,252,833位置, 并造成插入位點(diǎn)處62 bp基因組DNA的缺失; 在轉(zhuǎn)基因水稻Ec-22中, T-DNA插入到水稻基因組第6染色體的24,271,155~24,271,279位置, 造成第6染色體插入位點(diǎn)處缺失124 bp的基因組DNA (圖4)。

由于基因分離, 轉(zhuǎn)基因水稻后代中會同時(shí)存在非轉(zhuǎn)基因、雜合體和純合體3種類型。在轉(zhuǎn)基因作物中外源基因插入位點(diǎn)明確的情況下, 四引物法能簡單快捷地從后代中篩選出純合系, 縮短篩選時(shí)間。在外源基因插入位點(diǎn)上游的水稻基因組上設(shè)計(jì)正向引物OsF和TF, 插入位點(diǎn)下游的水稻基因組上設(shè)計(jì)反向引物OsR, 在插入序列上設(shè)計(jì)一個(gè)中間引物TR, 利用OsF/OsR和TF/TR兩個(gè)引物對可以從后代中鑒定轉(zhuǎn)基因純合系植株。純合系中, 由于插入的T-DNA片段太長, OsF/OsR引物對無法擴(kuò)增到目的DNA片段, 只有TF/TR能擴(kuò)增到目的條帶產(chǎn)物; 非轉(zhuǎn)基因水稻中, 由于沒有外源基因, OsF/OsR可以擴(kuò)增出相應(yīng)DNA條帶, 但TF/TR不能擴(kuò)增到目的條帶; 雜合體一條染色體上存在外源基因, 另一條染色體沒有外源基因, OsF/OsR和TF/TR均能擴(kuò)增到相應(yīng)的目標(biāo)DNA條帶(圖5-A)。

圖4 T-DNA轉(zhuǎn)基因水稻En-12 和Ec-22插入位點(diǎn)分析

本研究根據(jù)En-12中外源基因插入位點(diǎn)處的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了引物對12-OsF/12-OsR, 根據(jù)插入序列和側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了引物對12-TF/12-TR。用12-OsF/ 12-OsR和12-TF/12-TR對En-12后代進(jìn)行PCR檢測, 只有用12-OsF/12-OsR能擴(kuò)增到548 bp左右的DNA條帶的植株為非轉(zhuǎn)基因, 只有用12-TF/12-TR引物能擴(kuò)增到645 bp目的條帶的植株為純合系, 而用12-OsF/ 12-OsR和12-TF/12-TR能同時(shí)擴(kuò)增到548 bp和645 bp DNA條帶的為雜合系。利用此方法, 從T1轉(zhuǎn)基因植株中獲得了En-12純合系植株。同時(shí)根據(jù)Ec-22中外源基因插入位點(diǎn)處的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了引物對22-OsF/22-OsR, 根據(jù)插入序列中T-DNA右邊界附近序列和側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了引物對22-TF/22-TR。用22-OsF/22-OsR和22-TF/22-TR對Ec-22后代進(jìn)行PCR檢測篩選, 從T1轉(zhuǎn)基因植株中獲得了Ec-22純合系植株(圖5-B, C)。利用篩選出的En-12和Ec-22純合系植株為父母本, 通過有性雜交獲得了同時(shí)含有和融合基因的轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec的草甘膦耐受性分析

對不同類型的轉(zhuǎn)基因水稻田間噴施2000 mg L–1的草甘膦, 發(fā)現(xiàn)單獨(dú)含有1個(gè)基因片段的En-12和Ec-22植株均枯萎死亡, 而同時(shí)含有2個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec生長正常, 具有耐受草甘膦的特性(圖6-A)。在盆栽條件下, 對轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec、含完整基因的轉(zhuǎn)基因水稻G2-6和中花11噴施不同濃度的草甘膦發(fā)現(xiàn), 中花11噴施1000 mg L–1的草甘膦12 d后, 植株干枯死亡; 轉(zhuǎn)基因水稻 En×Ec和G2-6 噴施1000 mg L–1草甘膦后能夠正常生長, 轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec在噴施5000 mg L–1草甘膦后植株生長明顯受到抑制, 而轉(zhuǎn)基因水稻G2-6受抑制的程度低于轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec (圖6-B)。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn), 當(dāng)用 En535F/En535R和Ec459F/Ec459R進(jìn)行多重PCR檢測時(shí), En×Ec中只能檢測到(擴(kuò)增片段大小為535 bp)和(擴(kuò)增片段大小為459 bp) 2個(gè)基因片段的表達(dá), 但未檢測到完整基因(擴(kuò)增片段大小為1201 bp)的表達(dá), 說明拆分后的基因片段在intein介導(dǎo)下重新組裝成有功能的完整蛋白(圖7)。

圖5 四引物法從T1代轉(zhuǎn)基因水稻中篩選純合系

A: 四引物法篩選轉(zhuǎn)基因純合系的引物設(shè)計(jì)示意圖; B: En-12和Ec-22轉(zhuǎn)基因純合系篩選所需引物特異性檢測. M: Trans2K DNA marker (2000 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); C: En-12和 Ec-22 后代 PCR 檢測結(jié)果。En-12檢測中編號為5、10和12的株系為純合體; 1、4、6、7、8、9為雜合體; 2、3、11為非轉(zhuǎn)基因水稻; Ec-22檢測中編號為3、6、7、8、9、10、11、12的株系為純合體; 1、2、4為雜合體, 5為非轉(zhuǎn)基因水稻。

A: Primer design for selection of homozygous line using 4 primers method; B: Specific detection of primers for homozygous line selection of En-12 and Ec-22. M: Trans2K DNA marker (2000 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); C: PCR detection results of progeny of transgenic rice En-12 and Ec-22. For PCR detection of En-12: 5, 10, and 12 were homozygous lines; 1, 4, 6, 7, 8, and 9 were heterozygous lines; 2, 3, and 11 were non-transgenic rice. For PCR detection of Ec-22: 3, 6, 7, 8, 10, 11, and 12 were homozygous lines; 1, 2, and 4 were heterozygous lines; 5 was non-transgenic rice.

將轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec和受體材料中花11置于不同濃度的草甘膦水溶液中培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)隨草甘膦濃度的提高, 水稻地上部株高、根長與總鮮重均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢; 受體材料中花11對草甘膦耐受性的拐點(diǎn)濃度(致死濃度)為1 mg L–1; 在0~10 mg L–1草甘膦濃度下, 轉(zhuǎn)完整基因的水稻G2-6生長不受影響, 隨草甘膦濃度的進(jìn)一步提高, 轉(zhuǎn)基因水稻的生長受到抑制, 對草甘膦耐受性的拐點(diǎn)濃度為100 mg L–1; 而轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec的地上部株高、根長及植株總鮮重在 0 和 5 mg L–1草甘膦濃度下無差異, 對草甘膦耐受性的拐點(diǎn)濃度為 25 mg L–1(圖8)。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec對草甘膦的耐受性低于轉(zhuǎn)完整基因的水稻 G2-6。

3 討論

轉(zhuǎn)基因作物大面積商業(yè)化種植以來的20多年間, 耐除草劑一直是商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因作物的主要性狀[23]。耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物可能帶來的環(huán)境安全問題, 尤其是基因飄流可能產(chǎn)生的環(huán)境安全問題也一直是人們所關(guān)注的焦點(diǎn)問題。在作為水稻發(fā)源地之一的我國, 如何避免轉(zhuǎn)基因水稻基因飄流, 培育無目標(biāo)性狀向環(huán)境逃逸的轉(zhuǎn)基因耐草甘膦水稻顯得尤為重要。

圖6 轉(zhuǎn)基因水稻的草甘膦抗性分析(草甘膦濃度單位: mg L–1)

A: 轉(zhuǎn)基因水稻的草甘膦抗性田間檢測; B: 盆栽轉(zhuǎn)基因水稻的草甘膦抗性分析。

A: Glyphosate tolerance analysis of transgenic rice in field; B: Glyphosate tolerant analysis of transgenic rice cultivated in pot.

圖7 轉(zhuǎn)基因水稻的RT-PCR檢測

M: Trans2k DNA marker; 1: En535F/En535R擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻 En-12; 2: Ec459F/Ec459R 擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻 Ec-22; 3: En535F/ En535R和Ec459F/Ec459R 擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻 En×Ec; 4: sps155F/ sps155R 擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻En-12內(nèi)標(biāo)基因; 5: sps155F/ sps155R擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻Ec-22內(nèi)標(biāo)基因; 6: sps155F/ sps155R擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec內(nèi)標(biāo)基因。

M: Trans2k DNA marker; 1:fragment (535 bp) was amplified from En-12 using En535F/En535R primer pair; 2:fragment (459 bp) was amplified from Ec-22 using Ec459F/Ec459R primer pair; 3:(535 bp) and(459 bp) fragments were amplified from En×Ec using En535F/ En535R and Ec459F/Ec459R primer pairs at same time. Nogene fragment (1201 bp) was amplified; 4: reference genefragment was amplified from En-12 using sps155F/ sps155R primer pair; 5: reference genefragment was amplified from Ec-22 using sps155F/sps155R primer pair; 6: reference genefragment was amplified from En×Ec using sps155F/sps155R primer pair.

基因拆分技術(shù)作為一種限控轉(zhuǎn)基因飄流的生物學(xué)措施, 能夠有效地控制轉(zhuǎn)基因性狀向可交配物種的轉(zhuǎn)移, 大大降低對生態(tài)環(huán)境帶來不利影響的可能性。在煙草人工雜交情況下證明, 利用基因拆分技術(shù)至少能降低草甘膦性狀向非轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)移的75%[21]。本研究將具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的基因拆分后轉(zhuǎn)化水稻, 證明拆分后的基因片段在intein介導(dǎo)下重新組裝成完整有功能蛋白, 賦予了水稻耐受草甘膦的特性。此研究的成功不但為培育轉(zhuǎn)基因耐草甘膦水稻提供了新方法, 而且為培育安全轉(zhuǎn)基因雜交稻提供了新途徑。此法將目標(biāo)基因拆分成N端和C端兩部分, 即片段A和B, 分別與intein的N端和C端剪接域的基因序列連接, 形成融合基因, 片段A導(dǎo)入親本A中, 片段B導(dǎo)入親本B中, 通過雜交獲得同時(shí)含有2個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)基因雜交水稻。因此, 本研究也為培育抗除草劑提供了一個(gè)新思路。

對草甘膦的耐受性是決定所培育的轉(zhuǎn)基因水稻能否走向市場的決定因素之一。因此, 本研究分析了轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec的草甘膦耐受性, 發(fā)現(xiàn)其耐受性比受體材料提高，但與本實(shí)驗(yàn)室培育的含有完整的轉(zhuǎn)基因水稻G2-6相比, 其草甘膦耐受性明顯降低。分析其可能原因有以下幾個(gè)方面, 一是兩種轉(zhuǎn)基因水稻中外源蛋白的表達(dá)量存在明顯差異; 二是2個(gè)基因拆分后的重新組裝效率影響了目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。拆分位點(diǎn)是影響基因拆分后的重新組裝效率的主要因素。對于基因來說, 在190/191位氨基酸處拆分后分別轉(zhuǎn)化煙草, 在DnaE intein介導(dǎo)下重新組裝的 Cre 重組酶功效為野生型的77%[15]。而在232/233位氨基酸處拆分后分別轉(zhuǎn)化擬南芥, 雜交后代中Cre的重組酶功效接近于野生型[24]; 三是因?yàn)榛虿鸱趾蟮闹匦陆M裝過程中導(dǎo)致酶活性或結(jié)構(gòu)改變。Dun 等曾報(bào)道在原核生物中拆分后重新組裝的G2-aroA蛋白的酶活性比完整G2-aroA蛋白的酶活性明顯降低, 為完整G2-aroA蛋白酶活的62.92%[20]。另外, 使用除草劑后產(chǎn)量是否受影響也是衡量抗除草劑水稻應(yīng)用潛力的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。因此, 后期我們將進(jìn)一步分析的其他可拆分位點(diǎn)、En×Ec轉(zhuǎn)基因水稻的基因表達(dá)水平和產(chǎn)量性狀, 明確轉(zhuǎn)基因水稻 En×Ec 草甘膦耐受性低的原因和商業(yè)化應(yīng)用的潛力。

圖8 不同草甘膦濃度下的植株生長勢分析

4 結(jié)論

耐草甘膦基因基因在295/296位氨基酸處拆分后, 在DnaE intein介導(dǎo)下在轉(zhuǎn)基因水稻 En×Ec 中重新組裝成完整有功能蛋白, 賦予耐除草劑特性, 但轉(zhuǎn)基因水稻En×Ec的草甘膦耐受性低于轉(zhuǎn)完整基因的水稻。

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Cultivation of herbicide tolerant transgenic rice by gene spliting technique

DONG Yu-Feng1, WANG Xu-Jing1, SONG Ya-Ya1, JIN Xi2,and WANG Zhi-Xing1,*

1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, MARA Key Laboratory on Safety Assessment (Molecular) of Agri-GMO, Beijing 100081, China;2Baoding Institute, Baoding 071000, Hebei, China

The environmental risk caused by gene flow from herbicide-tolerant rice to normal rice is focused by the public and has become a key factor affecting the use of herbicide-tolerant rice in rice production. Gene splitting technique can effectively resolve the problem of the environmental risk and be applied on the development of herbicide-tolerant rice. In this study, the herbicide-tolerant genewas separated into N-terminal (EPSPSn) and C-terminal (EPSPSc) and were fused withDnaE intein, N-terminal (Intein-N) and C-terminal (Intein-C), to form fusion genesand, respectively.andwere separately transferred into Zhonghua11 by-mediated method. Southern hybridization demonstrated that the transgenic lines En-12 and Ec-22 were integrated with a single copy of insertion. The flanking sequence analysis demonstrated that the foreign genes in the transgenic lines En-12 and Ec-22 were respectively inserted into chromosomes 2 and 6. The homozygous lines of En-12 and Ec-22 were screened using the optimized four-primer method, and the hybrid En×Ec containing bothandwas obtained through sexual hybridization. Glyphosate resistance analysis revealed that transgenic rice containing only one gene fragment did not possess glyphosate tolerance, while transgenic rice En×Ec containing both gene fragments showed glyphosate tolerance. The glyphosate tolerance of the hybrid En×Ec was slightly weaker than that of the transgenic lines containing whole, but could meet the requirement in rice production. The results of this study provide a scientific basis for the use of gene splitting technology to develop safe transgenic glyphosate-tolerant rice, and also a new technology platform for genetically engineering safe transgenic hybrid rice.

glyphosate-tolerance; transgenic rice; gene splitting

2018-05-24;

2018-12-24;

2019-01-04.

10.3724/SP.J.1006.2019.82029

王志興, E-mail: wangcotton@126.com, 010-82106102

E-mail: yufengdong1989@126.com

本研究由國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201403075)和國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016zx08010-003)資助。

This work was supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201403075) and the National Major Project for Developing New GM Crops (2016zx08010-003).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190102.1355.002.html