流式樣本保存時間對肝癌患者外周血T淋巴細胞和NK細胞的影響

代艷超，覃 嶺，高夢丹，孫堅萍，張永宏

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院生物醫(yī)學信息中心，北京 100069

流式細胞儀已經(jīng)成為臨床及科研工作中不可或缺的工具，在免疫研究、免疫性疾病檢測和預后的判斷中均有重要意義[1-5]。目前提出使用新鮮的外周血進行流式細胞檢測，從而保證檢測結(jié)果的準確性及表型檢測的可靠性，但是，由于流式細胞儀價格昂貴，并不是所有實驗室可以獨立擁有一臺進行立即上機檢測，因此，流式細胞儀檢測處理樣本保存多長時間可以保證其細胞及亞群的百分比結(jié)果穩(wěn)定，是一個亟待解決的問題。之前有研究關(guān)注艾滋病、白血病、肺癌等疾病患者,健康者樣本的保存時間和溫度對流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群的影響[6-8]，而對肝癌患者外周血樣本的T細胞亞群及NK細胞的研究未見報道。因此，本文將對肝癌患者外周血樣本預處理后保存時間對流式細胞儀檢測T淋巴細胞及NK細胞的影響進行研究。

1 資料與方法

1.1一般資料隨機收集北京佑安醫(yī)院肝癌患者16例，男7例，女9例；年齡(44±11.32)歲(27～59歲)。所有患者均自愿簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑真空采血管為BD真空采血管，內(nèi)含EDTA-K2抗凝劑。淋巴細胞亞群：使用BD公司和Ebiolegned公司的抗體及BD公司鞘液進行檢測。抗體及標記熒光素分別為：CD3 AF700(Ebiolegend公司)，CD4 FITC(BD公司)，CD8 APC-H7(BD公司)，CD56 PE-CF594(BD公司)。儀器使用BD LSRFortessa高端科研型流式細胞儀。血常規(guī)及生化檢測為本院常規(guī)檢測結(jié)果。

1.3方法

1.3.1 外周血單個核細胞分離：采集患者外周血10 ml，6 h內(nèi)分離外周血單個核細胞。將真空采血管2 200 r/min離心7 min，收集血漿；用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，混勻，緩緩加入到帶有淋巴細胞分離液的離心管中，931×g離心20 min，提取淋巴細胞層細胞；RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細胞，計數(shù)。部分細胞用于流式細胞儀檢測，其余細胞凍存。

1.3.2 流式細胞儀檢測樣本的處理：16例肝癌患者樣本分離后的外周血單個核細胞各取2.5×107細胞，分為5個組，每組為0.5×107細胞，均同時進行CD3 AF700、CD4 FITC、CD8 APC-H7、CD56 PE-CF594染色。五組分別為：立即上機組；加入PBS，4 ℃保存1 d組；加入PBS，4 ℃保存2 d組；加入PBS，4 ℃保存3 d組；加入PBS，4 ℃保存5 d組。

1.4統(tǒng)計學方法采用Graphpad Prism6軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，對于計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1外周血常規(guī)及生化指標檢測15例肝癌患者(1例數(shù)據(jù)缺失)外周血血常規(guī)檢測結(jié)果：白細胞計數(shù)(5.32±0.61)×109L-1，淋巴細胞絕對值(1.43±0.21)×109L-1，單核細胞絕對值(0.44±0.09)×109L-1，中性粒細胞絕對值(3.57±10.51)×109L-1，均在參考值范圍內(nèi)。13例肝癌患者(3例數(shù)據(jù)缺失)外周血生化檢測結(jié)果：ALT水平為(94.45±53.06)U/L；AST水平為(115±75.01)U/L，均高于參考值范圍。

2.2不同保存時間上機淋巴細胞物理參數(shù)變化情況樣本處理后立即上機、保存1 d、2 d、3 d和5 d后上機，細胞物理參數(shù)變化情況結(jié)果顯示：樣本處理后立即上機、保存1 d和2 d，淋巴細胞分群明顯(見圖1，紅、藍、橘紅色線條)，而保存3 d和5 d，淋巴細胞分群不明顯，前向角和側(cè)向角位置與處理后立即上機、保存1 d和2 d比較發(fā)生了較大變化(見圖1，熒光綠和草綠色)，可見，樣本保存3 d后，淋巴細胞的物理參數(shù)發(fā)生變化。

圖1 不同保存時間淋巴細胞物理參數(shù)的變化情況Fig 1 The changes of physical parameters of lymphocyte in different storage times

2.3不同保存時間檢測CD3+T細胞比例及其亞群百分比樣本處理后立即上機、保存1 d、2 d、3 d和5 d CD3+T細胞比例結(jié)果顯示，立即上機組CD3+T細胞比例為(54.62±6.013)%，保存1 d組CD3+T細胞百分比為(54.81±4.357)%，保存2 d組CD3+T細胞比例為(54.33±5.276)%，保存3 d組為(38.04±4.511)%，保存5 d組為(27.29±4.352)%，可見，到第3天時，CD3+T細胞比例顯著降低(P<0.05，見圖2A)。

比較觀察處理后立即上機、保存1 d和2 d CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+T細胞比值及NKT(CD3+CD56+T)細胞間的差異，結(jié)果顯示，CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+T細胞比值及NKT細胞，立即上機、保存1 d、2 d組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖2B～2E)。

2.4不同保存時間上機檢測NK細胞結(jié)果比較樣本處理后立即上機、保存1 d、2 d、3 d、5 d后上機NK細胞(CD3-CD56+)比例。結(jié)果顯示，立即上機組NK細胞比例為(27.06±5.61)%，保存1 d組NK細胞比例為(26.29±4.72)%，保存2 d組NK細胞比例為(27.35±5.38)%，保存3 d組為(14.89±3.45)%，保存5 d組為(10.21±2.95)%，保存3 d組和5 d組NK細胞比例顯著降低(P<0.05，見圖3)。

圖2 不同上機時間對CD3+T細胞比例及其亞群百分比比較情況 A: CD3+T細胞； B： CD3+CD8+T細胞；C： CD3+CD4+T細胞；D： CD4+/CD8+T； E： CD3+CD56+T細胞Fig 2 Comparison of the percentage of CD3+T and its subsets in different storage time A: CD3+T cells； B： CD3+CD8+T cells；C： CD3+CD4+T cells；D： CD4+/CD8+T； E： CD3+CD56+T cells

圖3 不同保存時間NK細胞百分比比較Fig 3 Comparison of the percentage of NK cells in different storage times

3 討論

流式細胞檢測可以比較細胞的相對大小和胞內(nèi)的復雜程度，前向角散射(FSC)對應的是細胞的相對大小，F(xiàn)SC的值越大表示細胞越大；側(cè)向角散射(SSC)對應的是細胞內(nèi)部復雜程度，SSC的值越大說明細胞內(nèi)部的顆粒越多。本研究在確定電壓等檢測條件后，在不改變檢測條件的前提下，對立即上機、保存1 d、2 d、3 d和5 d的細胞分別進行檢測，觀察FSC和SSC的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)立即上機、保存1 d和2 d的FSC位置基本沒有變化；保存3 d和5 d的FSC發(fā)生左移。將兩圖疊加在一起可以很明顯地觀察出對于肝癌患者的外周血單個核細胞，隨著保存時間的延長，細胞逐漸縮小。EKONG等[7]提出患者于健康人相比，在機體狀態(tài)異常的條件下，長時間儲存樣本對其細胞物理參數(shù)和化學參數(shù)的影響可能更為明顯。

流式檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣本保存3 d組CD3+T淋巴細胞顯著減少，提示如果進行淋巴細胞的相關(guān)檢測，樣本處理后用PBS在4 ℃條件下最多保存2 d。淋巴細胞亞群包括CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+與CD3+CD8+細胞百分比比值在立即上機組、保存1 d和保存2 d組間差異無統(tǒng)計學意義，雖然CD3+CD56+T(NKT)細胞的比例可以看出隨保存時間的延長而降低，但差異無統(tǒng)計學意義。本研究只對立即上機組、保存1 d和2 d組的細胞進行了細胞亞群分析，是因為對細胞進行活死染色后，發(fā)現(xiàn)保存3 d組細胞顯著發(fā)生死亡，因此無法對保存3 d的淋巴細胞亞群進行比較。在陳瀟等[6]的研究中發(fā)現(xiàn)保存3 d的樣本，CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴細胞亞群檢測結(jié)果與采集后1 h內(nèi)檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義；但是在方芳等[8]和EKONG等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，保存72 h后淋巴細胞亞群等各項差異有統(tǒng)計學意義。

本研究進一步對樣本處理后立即上機組、保存1 d、2 d、3 d、5 d組的CD3-CD56+(NK)細胞比例進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存3 d組NK細胞比例顯著降低。方芳等[8]對非肝癌患者樣本外周血在采集后6 h內(nèi)檢測、保存24 h和36 h的CD56+CD16+比例進行比較，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義。本研究延長了保存時間進行檢測，結(jié)果提示如果對NK細胞進行流式檢測，樣本處理后，用PBS在4 ℃保存48 h內(nèi)進行檢測結(jié)果均穩(wěn)定。

綜上所述，臨床樣本在收到后進行處理，用PBS于4 ℃條件下保存3 d內(nèi)進行T淋巴細胞和NK細胞的上機檢測結(jié)果比較穩(wěn)定。此研究結(jié)果一方面可以為需要預約流式細胞儀的研究人員提供一個流式樣本保存條件的依據(jù)；另一方面可以減少流式細胞儀的開機次數(shù)，減少儀器損耗，節(jié)約資源和成本。