乏氧微環(huán)境下外泌體對腫瘤進(jìn)展及輻射抵抗的影響

默芳 張江虹 邵春林

復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所放射生物研究部，上海 200032

乏氧是許多實(shí)體腫瘤的顯著特征，腫瘤乏氧微環(huán)境的產(chǎn)生及演變往往對于腫瘤細(xì)胞具有復(fù)雜且重要的影響。參與形成及維持腫瘤乏氧微環(huán)境的因素有很多，近年來的研究表明[1]，外泌體作為腫瘤乏氧微環(huán)境的重要組成部分，在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移過程中均扮演著重要角色。乏氧微環(huán)境下外泌體的存在不僅能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力，影響腫瘤的血管生成，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，改變腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性與耐藥性，從而促進(jìn)腫瘤的惡化程度，降低腫瘤的治療效果。本文就乏氧微環(huán)境下外泌體對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其對乏氧輻射抵抗的影響進(jìn)行概述。

1 外泌體及其功能

外泌體最初于1983年被發(fā)現(xiàn)于綿羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞中，1987年被Johnstone命名為“exosome”[2]。外泌體自發(fā)現(xiàn)之初，一直被認(rèn)為是細(xì)胞的廢棄物。近年來，隨著研究的深入，外泌體的許多重要功能被逐漸發(fā)現(xiàn)，引發(fā)了人們對于外泌體的興趣?，F(xiàn)在外泌體被廣泛接受的定義是，直徑為30~150 nm的細(xì)胞外囊泡，由內(nèi)含物和脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成，含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸。大多數(shù)細(xì)胞在正?；虿±頎顟B(tài)下都可以分泌外泌體，在各種體液中，如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁及腦脊液等中均能檢測到外泌體[3]。

外泌體具有獨(dú)特且復(fù)雜的組成，其內(nèi)含物的種類和含量因來源細(xì)胞的不同而有所差異。根據(jù)最新的外泌體數(shù)據(jù)庫顯示，在多種生物的外泌體中，已有41 860種蛋白質(zhì)、3408種mRNA和2838種miRNA被鑒定出來源于胞內(nèi)體[4]。其中，外泌體中最容易識(shí)別的蛋白包括腫瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101, TSG101）、重組Alix蛋白（ALG-2-interacting protein X，Alix）、胞內(nèi)分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）、熱休克蛋白（HSC70、HSP90）、各種膜聯(lián)蛋白和外泌體內(nèi)部或表面表達(dá)的標(biāo)志物，包括跨膜蛋白4超家族（CD81、CD63、CD9）、細(xì)胞骨架蛋白（肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和膜突蛋白）及與脂質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)和磷脂酶等[5-8]。

外泌體可通過多種方式與受體細(xì)胞融合，并將內(nèi)含物釋放到受體細(xì)胞中，從而影響受體細(xì)胞的各種生物過程。近年來，在外泌體的合成、分泌和釋放過程，及其對腫瘤細(xì)胞侵襲遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）、血管生成、放化療抵抗等腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程的影響均有研究。其中對涉及到的各種相關(guān)蛋白、具有重要作用的核酸（mRNA、miRNAs和長鏈非編碼RNA等）及脂類的研究均取得了一定程度的進(jìn)展[9-10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，還能改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，且部分外泌體還承載著腫瘤標(biāo)志物的作用[11-12]。因此，外泌體在疾病診斷和治療上具有重要的潛在意義。

2 乏氧微環(huán)境和外泌體

腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中會(huì)與其周圍血管、細(xì)胞外基質(zhì)、其他非惡性細(xì)胞以及信號(hào)分子等形成一個(gè)獨(dú)特的微小生態(tài)系統(tǒng)，稱之為腫瘤微環(huán)境[13-14]。許多因素都參與腫瘤微環(huán)境的形成和維持，如：乏氧、不同種類的細(xì)胞、可溶性因子、信號(hào)分子、細(xì)胞外基質(zhì)及外泌體等。乏氧（缺氧）是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的一個(gè)顯著特性[15]，它不僅會(huì)改變腫瘤微環(huán)境的理化特性，還會(huì)影響腫瘤細(xì)胞代謝相關(guān)的信號(hào)通路。越來越多的證據(jù)表明，乏氧與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗、預(yù)后不佳、病死率上升等密切相關(guān)[16]。乏氧微環(huán)境的存在可使腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制適應(yīng)其所處環(huán)境，使其具有更強(qiáng)的生存能力、侵襲性、轉(zhuǎn)移性和抵抗性，從而影響治療效果[17-22]。乏氧會(huì)影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT-1）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等質(zhì)膜受體的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的內(nèi)吞作用，導(dǎo)致外泌體分泌顯著增多。除了影響外泌體的表達(dá)量之外，乏氧環(huán)境還會(huì)誘導(dǎo)外泌體的功能發(fā)生顯著改變。正如Kore等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（glioblastoma cells, GBM）在低氧條件下，選擇性地提高部分外泌體蛋白的表達(dá)，如賴氨酸6-氧化酶（lysyl oxidase, LOX）、血小板反應(yīng)蛋白1（thrombospondin-1,TSP1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，而這些蛋白質(zhì)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管生成等密切相關(guān)。此外，乏氧也會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞外泌體RNA的表達(dá)發(fā)生變化，如Umezu等[24]研究表明，與常氧條件相比，缺氧條件下多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的外泌體miR-135b的表達(dá)顯著升高，并進(jìn)一步影響了腫瘤的血管生成。

由于外泌體攜帶的生物活性物質(zhì)來源于母體細(xì)胞，而乏氧（缺氧）區(qū)域在實(shí)體腫瘤內(nèi)普遍存在，因此研究乏氧與外泌體的關(guān)系對腫瘤的臨床診斷、預(yù)后具有重要意義，研究乏氧微環(huán)境中外泌體的功能也為開拓腫瘤治療的途徑提供了新的思路。

3 乏氧環(huán)境下外泌體對腫瘤的影響

3.1 乏氧環(huán)境下外泌體介導(dǎo)腫瘤的侵襲和遷移

眾所周知，腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移行為是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的首要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)過程，其中，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。在EMT期間，腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞特性被弱化，細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，并獲得間質(zhì)細(xì)胞特征，包括高遷移和侵襲能力。在分子水平上，EMT期間發(fā)生的變化可通過上皮細(xì)胞標(biāo)志物的損失和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的獲得來解釋，如在EMT過程中，代表上皮表型的鈣黏連蛋白E（E-cadherin）等標(biāo)志物的表達(dá)水平下降，代表間質(zhì)表型的波形蛋白（Vimentin）、鈣黏連蛋白N（N-cadherin）等標(biāo)志物表達(dá)升高。越來越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力的增強(qiáng)與乏氧條件下外泌體的表達(dá)變化密切相關(guān)[25]。胰腺癌細(xì)胞在乏氧條件下增加的外泌體可通過激活PTEN/PI3K γ信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2極化，并進(jìn)一步促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT的發(fā)生[26]。此外，Xue等[27]從體內(nèi)和體外水平研究均發(fā)現(xiàn)，乏氧會(huì)促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞分泌更多的長鏈非編碼RNA-UCA1（long non-coding RNA-UCA1,lncRNA-UCAI）進(jìn)入外泌體中，與lncRNA-UCA1低表達(dá)的人膀胱癌細(xì)胞（UMUC2）共同培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該外泌體可促進(jìn)UMUC2細(xì)胞的侵襲、遷移，并促進(jìn)膀胱腫瘤的增長；與健康個(gè)體比較，膀胱癌患者血清中的lncRNA-UCA1表達(dá)量更高，提示外泌體lncRNA-UCA1可能成為膀胱癌的潛在診斷生物標(biāo)志物。Li等[28]研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌細(xì)胞在乏氧條件下分泌的外泌體miR-21水平較常氧條件更高，且miR-21的表達(dá)依賴缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）與缺氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor-2α, HIF-2α）途徑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乏氧條件下產(chǎn)生的外泌體miR-21能夠顯著誘導(dǎo)Vimentin的表達(dá)，降低E-cadherin的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力[28]。

由此可見，乏氧能顯著改變腫瘤細(xì)胞外泌體的表達(dá)，且可通過多種途徑介導(dǎo)腫瘤的侵襲、遷移過程，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展。這些研究結(jié)果提示，乏氧外泌體可作為腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的表征因子，為臨床上腫瘤惡性程度的判斷提供了重要的依據(jù)。

3.2 乏氧環(huán)境下外泌體介導(dǎo)腫瘤的血管生成

腫瘤的血管生成是影響腫瘤微環(huán)境形成和發(fā)展的重要因素，是腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵步驟。血管生成是源于已存在的血管系統(tǒng)的基礎(chǔ)上新的毛細(xì)血管性血管的生長。腫瘤的血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及到多個(gè)血管生成因子及相關(guān)受體，主要包括VEGF、血小板源性生長因子、血管生成素、肝細(xì)胞生長因子、表皮生長因子等[29]。腫瘤的血管生成可為腫瘤細(xì)胞提供所需的氧氣及營養(yǎng)成分，從而促進(jìn)腫瘤的快速發(fā)展。近年來，乏氧環(huán)境下外泌體介導(dǎo)的腫瘤血管生成的相關(guān)研究已取得重要進(jìn)展。Tadokoro等[30]提取常氧與乏氧條件下白血病K562細(xì)胞分泌的外泌體，以此處理人臍靜脈內(nèi)皮（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乏氧條件下產(chǎn)生的外泌體miR-210顯著增多，并顯著增強(qiáng)HUVEC細(xì)胞的血管生成。Tadokoro等[30]研究也發(fā)現(xiàn)：乏氧條件下多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增多的外泌體miR-135b可通過介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（hypoxia inducible factor-factorinhibiting HIF, HIF-FIH）途徑，促進(jìn)HUVEC的血管生成。此外，Kucharzewska等[31]分別于常氧和乏氧條件下收集人惡性GBM細(xì)胞的外泌體，混合人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞后注入到小鼠皮下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體能夠促進(jìn)腫瘤在小鼠皮下的生長及血管生成，且乏氧條件下的外泌體對腫瘤的促進(jìn)作用較常氧條件更為顯著。

可見，乏氧條件下腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體經(jīng)過介質(zhì)傳遞被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，加速血管生成的進(jìn)程，從而加劇了腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移的速度及其惡化程度。

3.3 乏氧環(huán)境下外泌體影響腫瘤的免疫系統(tǒng)

腫瘤的產(chǎn)生是由于機(jī)體的某些細(xì)胞喪失正常的調(diào)控能力，進(jìn)而引發(fā)異常的細(xì)胞增殖。事實(shí)證明，腫瘤的發(fā)生與免疫系統(tǒng)的功能密切相關(guān)。免疫功能的缺失或“免疫逃逸”的實(shí)現(xiàn)，使生物體內(nèi)的惡變細(xì)胞逐步發(fā)展成為腫瘤[32]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫功能，且對免疫功能的調(diào)節(jié)具有兩面性，外泌體既能促進(jìn)免疫應(yīng)答，又能抑制免疫應(yīng)答[33-34]。例如，樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體通過表達(dá)腫瘤壞死因子等配體激活腫瘤細(xì)胞的凋亡程序，并能活化自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞，使其產(chǎn)生更高水平的γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的效果[33]。而Wu等[34]研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤B16F0細(xì)胞分泌的外泌體可以抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，增加了腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視的可能性。有趣的是，乏氧環(huán)境下的外泌體亦能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫功能。例如，將乳腺癌細(xì)胞在常氧或乏氧條件下培養(yǎng)，通過CD63免疫印跡的方法，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乏氧條件下細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌體數(shù)量有所增加，且用這些外泌體作用于T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乏氧環(huán)境下產(chǎn)生的外泌體能顯著抑制T細(xì)胞的增殖[35]。此外，研究發(fā)現(xiàn)乏氧的鼻咽癌細(xì)胞能夠分泌出更高水平的外泌體miR-24-3p，可抑制T細(xì)胞增殖和輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）的分化，同時(shí)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化[36]。乏氧的卵巢癌SKOV3細(xì)胞亦產(chǎn)生更加豐富的外泌體miRNA-940，以促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2表型極化，從而影響上皮卵巢癌的發(fā)展進(jìn)程[37]。

總之，腫瘤在乏氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的外泌體對調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫功能發(fā)揮著重要作用，乏氧環(huán)境下的外泌體在免疫調(diào)節(jié)中的表現(xiàn)為我們正確認(rèn)識(shí)腫瘤細(xì)胞的生長及惡化過程，以及發(fā)掘新型的抗腫瘤治療方法提供了參考依據(jù)。

3.4 乏氧環(huán)境下外泌體介導(dǎo)的其他生物學(xué)過程

乏氧環(huán)境下的外泌體除介導(dǎo)腫瘤的侵襲、遷移、血管生成以及免疫調(diào)節(jié)外，在腫瘤微環(huán)境中的其他生物學(xué)過程中也發(fā)揮著不可忽視的作用。Papi等[38]研究發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌MCF7細(xì)胞在乏氧條件下產(chǎn)生的外泌體miR27b、miR130b、載脂蛋白E以及碳酸酐酶Ⅸ等較常氧條件具有更高水平的表達(dá)，且這些分子可以經(jīng)過氧化物酶體增殖物激活受體 γ調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移以及免疫抑制等生物學(xué)過程；Zhao等[39]研究發(fā)現(xiàn)，GBM細(xì)胞在乏氧條件下的外泌體中VEGF-A的含量顯著增高，并通過下調(diào)緊密聯(lián)結(jié)抗體和閉合蛋白的表達(dá)影響血腦屏障的通透性。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，利用低氧條件下卵巢癌細(xì)胞分泌的外泌體處理后的卵巢癌OVCAR8細(xì)胞相對于未經(jīng)處理的細(xì)胞來說，具有更強(qiáng)的抵抗化療藥順鉑的特性[40]。

可見，乏氧環(huán)境下的外泌體在腫瘤細(xì)胞存活、放化療抵抗等生物學(xué)過程中扮演著重要角色，乏氧環(huán)境下的外泌體與臨床上腫瘤的預(yù)后不佳可能存在著重要聯(lián)系。

4 乏氧環(huán)境下外泌體與腫瘤的輻射敏感性

腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性與許多因素有關(guān)，包括腫瘤細(xì)胞的類型、惡化程度、腫瘤的供氧及代謝情況等。實(shí)體腫瘤內(nèi)多存在乏氧區(qū)域，對放療的敏感性影響較大。研究發(fā)現(xiàn)，供氧豐富、代謝旺盛的腫瘤細(xì)胞往往放療敏感性較強(qiáng)，而腫瘤的乏氧區(qū)域則表現(xiàn)出一定程度的輻射抵抗性[41]。乏氧影響腫瘤細(xì)胞輻射抵抗性的原因包括兩個(gè)方面：一是放療對腫瘤細(xì)胞DNA的損傷需要氧的存在；二是乏氧環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的某些基因表達(dá)的變化影響了細(xì)胞的輻射敏感性。例如，肺癌A549細(xì)胞在乏氧條件下具有更強(qiáng)的抗輻射性，乏氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的MiR-210的高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的輻射損傷具有一定的保護(hù)作用[42]。乏氧可通過抑制P53的活性增加小鼠纖維肉瘤細(xì)胞（KHT-C）的輻射敏感性[43]。同時(shí)，外泌體對腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性同樣產(chǎn)生重要影響。例如，外泌體miR-208a可通過靶向p21促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的增殖和輻射抵抗[44]?；|(zhì)細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞利用旁分泌的形式啟動(dòng)化療和放療抵抗性[45]。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)照射后的肺癌細(xì)胞A549分泌的miR-1246可通過直接靶向死亡受體5促進(jìn)肺癌細(xì)胞H446的增殖并增強(qiáng)其放射抵抗性[46]。

諸多研究提示我們，乏氧微環(huán)境與外泌體的存在均對腫瘤的輻射敏感性有著重要的影響。大量文獻(xiàn)也證明了乏氧環(huán)境下的外泌體能夠促進(jìn)腫瘤的惡化程度[1]。因而，乏氧微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞外泌體的產(chǎn)生勢必能夠影響到腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性以及腫瘤的放療進(jìn)程。

5 總結(jié)與展望

乏氧環(huán)境下外泌體的產(chǎn)生及其功能的實(shí)現(xiàn)是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，涉及多種細(xì)胞的多個(gè)階段。腫瘤乏氧微環(huán)境中的外泌體不僅能夠改變腫瘤微環(huán)境的理化特性，更能介導(dǎo)腫瘤的生理學(xué)過程。由于外泌體特殊的組成與結(jié)構(gòu)，在臨床檢驗(yàn)上具有靈敏度高、穿透力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特性，因此其具有成為液體活檢靶點(diǎn)的潛質(zhì)。實(shí)體腫瘤乏氧區(qū)內(nèi)外泌體的穩(wěn)定表達(dá)使其可能成為癌癥診斷的生物標(biāo)志物，用于估計(jì)判斷腫瘤的惡性程度與侵襲性等。此外，納米技術(shù)的應(yīng)用可以使外泌體承載特殊的藥物或基因，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療和克服乏氧輻射抵抗的目標(biāo)?？梢姡谀[瘤的臨床診斷和治療中，乏氧環(huán)境下的外泌體具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景。

然而，從當(dāng)前的研究進(jìn)展來看，腫瘤乏氧微環(huán)境中外泌體介導(dǎo)的生物學(xué)過程及其相應(yīng)的機(jī)制研究仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，外泌體繁瑣復(fù)雜的提取步驟、高昂的純化費(fèi)用限制了外泌體在臨床上的大規(guī)模使用。如何準(zhǔn)確快速地從外泌體中分離出目的核酸或蛋白依然是擺在人們面前的難題。另一方面，外泌體全部信息并未完全獲知，其在機(jī)體局部或整體環(huán)境中的作用機(jī)制仍未清晰，并且在各種囊泡中找到目標(biāo)外泌體也是一大挑戰(zhàn)。所以說，乏氧環(huán)境下的外泌體是一把“雙刃劍”，它的存在可能會(huì)惡化腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，但也可以幫助我們探索新的檢測及治療腫瘤的方法。因此，如何正確合理地認(rèn)識(shí)和利用乏氧環(huán)境下的外泌體將成為未來腫瘤生物學(xué)的一個(gè)重要的研究方向。