沈自燕 馮旰珠
南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科210011
1882年Carl Friedlander首次從肺炎死亡患者的肺中提取并描述了肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia,KP)[1]。KP是一種革蘭陰性桿菌,屬于腸桿菌科,廣泛存在于自然界中。KP兼性厭氧,無鞭毛及芽孢,可有莢膜,營養(yǎng)要求不高,在普通培養(yǎng)基上生長的菌落大,呈黏液狀,以接種環(huán)挑之易拉成絲,此特征有助于鑒別。根據(jù)其毒力及致病特點,KP可分為普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumonia,c KP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumonia,hv KP),其中hv KP因其高黏液性更易引起健康人群及青年人群患病[2]。有研究發(fā)現(xiàn),hv KP主要引起社區(qū)獲得性肝膿腫、腦膜炎、重癥肺炎、眼內(nèi)炎等,也可以形成多遠(yuǎn)處播散[3],造成這種現(xiàn)象的具體原因及機(jī)制尚不清楚,尚有待人們?nèi)ヌ剿餮芯俊?/p>
如所周知,KP可引起多種感染,如肺部感染、尿路感染、腹腔感染、手術(shù)部位感染甚至血流感染等,而在有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病及免疫功能低下患者其更易罹患該病原菌感染的發(fā)生;在感染科室分布中,包括新生兒病房、ICU、老年病房、泌尿科病房等,ICU則是KP感染發(fā)生的重點臨床科室,在ICU革蘭陰性菌感染中,其占15%左右[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),KP在導(dǎo)致革蘭陰性菌血癥及尿路感染的病原菌中位列第二,更是引起醫(yī)院呼吸道感染的最常見病原菌[6]。KP的病死率極高,據(jù)統(tǒng)計KP引起血流感染的病死率為20%~30%,總的人群死亡率為1.3/10萬,而KP菌血癥同時合并肺炎的病死率可達(dá)50%以上[1]。
目前,隨著臨床中廣譜抗生素的大量不合理運(yùn)用,KP對抗生素耐藥性不斷增加。2018年一項關(guān)于KP耐藥的流行病學(xué)研究顯示:KP分離株對氨曲南和頭孢他啶的耐藥率分別達(dá)到了55.4%和55.7%[7]。KP的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣,包括產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶、染色體變異、質(zhì)粒及整合子介導(dǎo)、外膜孔蛋白缺失、靶位改變、生物膜形成及主動外排機(jī)制等[8-10]。隨著KP感染在臨床感染中所占的比例不斷增加,人們在研究新的治療方案或新型有效藥物控制感染的同時,也在努力把目光投向免疫治療。很多學(xué)者開始嘗試?yán)肒P全菌、核糖體、外膜蛋白、莢膜多糖、脂多糖等KP不同結(jié)構(gòu)的免疫原性,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗KP免疫,從而達(dá)到預(yù)防或控制KP感染的目的。本文就KP疫苗研究進(jìn)展綜述如下。
IWC是運(yùn)用物理加熱或者福爾馬林、甲醛等化學(xué)物質(zhì)滅活病原微生物,然后以滅活的病原菌誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答,從而達(dá)到預(yù)防感染的目的。IWC由于病原菌本身的部分結(jié)構(gòu)的內(nèi)毒性及安全性問題,目前尚未運(yùn)用于臨床。2013年Sun等[11]制備了KP滅活全菌疫苗,但研究發(fā)現(xiàn)KP攜帶的sit A蛋白對細(xì)胞存在明顯的毒性作用,sit A是在腸桿菌科細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)其自身營養(yǎng)代謝相關(guān)的亞鐵與錳離子的一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,其表達(dá)水平隨著細(xì)菌培養(yǎng)條件的變化而改變。研究中,Sun等[11]運(yùn)用基因工程技術(shù)并通過體內(nèi)和體外實驗證明,sit A的缺失將減弱KP菌的毒性。他們用紫外線滅活sit A缺失菌株和野生菌株,然后將其注射入小鼠腹腔內(nèi),兩周后用相同劑量野生型菌株經(jīng)腹腔感染小鼠,結(jié)果顯示所有注射了sit A缺失菌株的小鼠存活,而對照組存活率則為80%,且其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。該研究結(jié)果表明,sit A缺失菌株滅活菌能夠有效誘導(dǎo)小鼠免疫功能,既能保留其良好的免疫原性,同時又剔除了sit A的毒性,因此敲除sit A構(gòu)建KP菌的無毒株全菌疫苗,進(jìn)行更深入的研究很有必要。此外,除了IWC外,另一種相對安全的技術(shù)則是采用細(xì)菌細(xì)胞的完全裂解物方法,制作含有所有細(xì)胞組分的非細(xì)胞疫苗。然而,KP的細(xì)胞裂解物可引起接種部位嚴(yán)重局部反應(yīng),常常導(dǎo)致皮膚組織壞死,嚴(yán)重時甚至可引起過敏性休克[12]。這種現(xiàn)象表明,KP裂解物中含有多種對機(jī)體有害的毒性成份,簡單裂解而不加以選擇性剔除,則不能運(yùn)用到機(jī)體進(jìn)行誘導(dǎo)免疫,但KP菌體成份復(fù)雜、各種蛋白結(jié)構(gòu)種類繁多,選擇性剔除研究工作會龐大而漫長。因此,近年來這方面的相關(guān)研究相對較少。
核糖體是一個巨大的核糖核蛋白體,其功能是將m RNA轉(zhuǎn)譯成多肽,同時也是主要的抗生素靶點。核糖體疫苗主要由非細(xì)胞壁成分組成,其中主要為細(xì)胞溶質(zhì)成分。1978年人類首次嘗試研制KP核糖體疫苗,并在104名健康男性中以氣霧劑形式進(jìn)行接種,研究結(jié)果示試驗組較對照組特異性抗體增加明顯,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義[13]。然而,隨后的一系列研究發(fā)現(xiàn),核糖體疫苗具有保護(hù)作用是由于受細(xì)胞壁成分的污染,而并來自于非核糖體制劑本身的免疫作用,純化的核糖體制劑不具有免疫原性來對抗KP感染[14-15]。因此,普遍認(rèn)為KP核糖體疫苗開發(fā)前途不大。
革蘭陰性菌衍生的細(xì)胞外囊泡,也稱為EVs,是直徑為20~200 nm的球形雙層磷脂,主要由外膜蛋白、脂多糖、外膜脂質(zhì)、周質(zhì)蛋白及其他與部分毒力蛋白物質(zhì)組成。2015年Lee等[16]首次研究發(fā)現(xiàn)KP的細(xì)胞外囊泡能夠?qū)P感染中起到抵抗作用。他們通過鼠膿毒癥模型驗證,接種KP外膜囊泡能誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫,從而降低小鼠死亡率。因此,開發(fā)EVs用于制備KP疫苗不失為一個頗有前途的策略。但是,EVs成分同樣也很復(fù)雜,而其具體作用機(jī)制及對宿主細(xì)胞的毒性作用尚仍有待深入研究。
KP的免疫原性蛋白主要包括KP細(xì)菌的細(xì)胞表面蛋白和一些毒力因子,其中細(xì)胞表面蛋白主要包括外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)和菌毛蛋白(fimbriae proteins)[14]。鑒于毒力因子改造的復(fù)雜性,本文僅就對三種蛋白疫苗進(jìn)展進(jìn)行介紹。
4.1 KP細(xì)胞毒素(Klebsiella cytotoxins,KCTs)KCTs是致病KP的重要毒力因子,在宿主應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)更高。早在2001年Singh和Sharma[12]觀察了粗制細(xì)胞毒素(多黏菌素B提取物,polymyxin-B extract,PBE)及純化的KCTs(KCT-Ⅰ、KCT-Ⅱ和KCT-Ⅲ三種類型)制備的類毒素疫苗對兔和小鼠KP感染的保護(hù)效力。研究發(fā)現(xiàn),KCT-I和PBE制成的類毒素在兔和小鼠感染KP后可起到保護(hù)作用;有趣的是,接受免疫的雌性兔可將母乳的保護(hù)性免疫球蛋白傳遞給子代,且對子代的抗感染保護(hù)作用能保持1個月以上。該研究結(jié)果提示,類毒素疫苗可以用于保護(hù)實驗動物及其后代對抗KP感染,至于能否應(yīng)用于人體,尚待更深入研究。
4.2 OMP OMP是一類存在于細(xì)菌外膜的蛋白,其具有穩(wěn)定細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)并參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝,還具有調(diào)控一些小分子物質(zhì)如抗生素進(jìn)出細(xì)菌的作用。2010年Kurupati等[17]首次評估了表達(dá)OMP的DNA疫苗的免疫原性,并確定其具有對抗KP感染的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),構(gòu)建的Omp A和Omp K36基因質(zhì)粒在接種小鼠中后,可誘導(dǎo)相應(yīng)抗體的產(chǎn)生、并促進(jìn)TH1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,在一定程度上保護(hù)小鼠免受KP的攻擊。因此,研究者認(rèn)為可以積極開發(fā)KP菌Omp A和Omp K36的DNA疫苗應(yīng)用于保護(hù)人類的研究;另有Babu等[6]于2017年用免疫顯性抗原Omp A和Omp K36制成重組蛋白(AK36),并在小鼠模型中評估重組多表位亞基疫苗(r-AK36)的安全性和保護(hù)效力。研究結(jié)果顯示,與對照組相比,重組抗原可刺激實驗組小鼠脾細(xì)胞增殖達(dá)三倍之多。當(dāng)用3×LD100(100%致死劑量)劑量KP菌攻擊r-AK36免疫的小鼠時,約80%的小鼠在觀察期之后存活,r-AK36促進(jìn)免疫小鼠產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ。該研究結(jié)果表明,r-AK36能夠有效抵抗KP菌的感染,而鑒于外膜蛋白Omp A和Omp K36在KP菌株中的高度保守性,可以為不同菌株的KP菌感染提供廣泛的保護(hù)作用。
2018年Husseina等[18]在小鼠感染模型中評估了兩種OMP(Omp K17和Ompk36)及其融合蛋白(F36/17)對KP菌攻擊的免疫保護(hù)作用,該研究中運(yùn)用并比較了3種不同的免疫佐劑:GEM(Gram-positive enhancer matrix)佐劑、Hz(synthetic hemozoin)佐劑及不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant,IFA)。其中,GEM佐劑是由乳酸乳球菌經(jīng)熱酸處理后形成的細(xì)菌樣顆粒,主要由肽聚糖結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁組成,缺乏如DNA等胞內(nèi)物質(zhì);Hz佐劑則是瘧原蟲分解血紅蛋白形成的副產(chǎn)物;弗氏佐劑包括完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑(主要由熱滅活的結(jié)核分枝桿菌、石蠟油和羊毛脂混合而成,主要誘導(dǎo)Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答)。該研究中,Husseina首先運(yùn)用基因重組技術(shù)表達(dá)、純化上述3種蛋白,然后分別用上述3種免疫佐劑分別與重組蛋白抗原免疫小鼠3次(分別在第1、14、28 d免疫),在第3次免疫后的兩周,以致死劑量的KP菌攻擊小鼠,最后評估免疫保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果顯示,Omp K17、Ompk36及F36/17 3組小鼠存活率分別為50%、60%及50%,且3種免疫佐劑中IFA組顯示了較為良好的保護(hù)作用。該研究結(jié)果表明,Omp K17或Ompk36都具有良好的開發(fā)前景,而兩種OMP的融合沒有顯示更強(qiáng)的免疫原性。
4.3 菌毛蛋白 菌毛的主要物質(zhì)成分是菌毛蛋白,該類蛋白由相關(guān)的基因編碼表達(dá)。KP菌毛主要介導(dǎo)該菌接近或吸附宿主細(xì)胞黏膜。KP存在多種菌毛,但以Ⅰ型和Ⅲ型菌毛為主。研究發(fā)現(xiàn),KP菌的Ⅰ型菌口可以與宿主細(xì)胞糖蛋口中的甘露糖結(jié)合,Ⅲ型菌毛則具有抵抗甘露糖血凝的特性。菌毛蛋白在與宿主細(xì)胞作用的過程中能被宿主免疫系統(tǒng)廣泛識別,從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫。早在2005年Lavender等[19]就觀察到,Ⅲ型菌毛蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度抗體以抵抗KP菌在呼吸道的攻擊效應(yīng)。人們通過對菌毛的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),Ⅲ型菌口表達(dá)及調(diào)控基因包括mrk A和mrkD,其中mrk A是Ⅲ型菌毛的編碼基因簇,而mrk D則是調(diào)節(jié)基因簇,Mrk A蛋白主要與細(xì)菌附著宿主細(xì)胞及形成生物膜有關(guān),且Mrk A廣泛存在于KP菌中,具有高度保守性。2016年Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn),抗Mrk A抗體在體外可減少KP生物膜的形成,并能在小鼠KP肺炎模型中發(fā)揮保護(hù)作用;Wang等[21]的后續(xù)研究進(jìn)一步對Mrk A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探究,認(rèn)為Mrk A有望成為對抗KP菌的重要免疫靶點。鑒于蛋白疫苗的生產(chǎn)成本相對較高,可以考慮將外膜蛋白及菌毛蛋白等用作載體蛋白。
細(xì)菌中存在多種糖類物質(zhì),其中由于莢膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)的O-多糖具有免疫原性,人們將其制成多糖疫苗,并嘗試用于對抗KP感染。多糖疫苗主要是由特異性的多糖純化后制成。
5.1 莢膜多糖疫苗(capsular polysaccharide vaccine) 莢膜多糖位于KP細(xì)胞最外層,是KP的重要毒力因子。由于莢膜多糖結(jié)構(gòu)差異較大,目前莢膜多糖主要已鑒定出79種血清型,其中K1和K2血清型與hv KP有關(guān)[3,22]。研究發(fā)現(xiàn),莢膜多糖在人類KP感染的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。2017年Seeberger等[23]從莢膜多糖及相關(guān)序列中合成了名為CRM197-1的半合成疫苗,研究發(fā)現(xiàn)CRM197-1疫苗在小鼠和兔子中可產(chǎn)生高滴度抗體,該抗體可與天然莢膜多糖交叉反應(yīng),且CRM197-1疫苗還可通過介導(dǎo)吞噬細(xì)胞的吞噬作用對抗耐碳青霉烯類KP菌。至于CRM197-1在動物感染模型中的免疫保護(hù)效應(yīng)評估及免疫保護(hù)機(jī)制目前仍有待進(jìn)一步研究。然而,由于莢膜多糖有血清型的多樣性,單價莢膜多糖疫苗不能提供對KP菌的廣泛保護(hù)效應(yīng),因而在很大程度上限制了KP莢膜多糖疫苗的開發(fā)應(yīng)用。
5.2 脂多糖疫苗(lipo-polysaccharide vaccine) LPS是革蘭陰性菌表面的主要脂質(zhì)及其細(xì)胞壁的主要成分。LPS主要包括三個結(jié)構(gòu)區(qū)域:脂質(zhì)A鏈、寡糖核心和O-多糖重復(fù)的外部區(qū)域,其中脂質(zhì)A是主要的內(nèi)毒素因子。LPS的O抗原能干擾巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的吞噬作用以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]。目前由于脂多糖O抗原的不同,脂多糖分為9種血清型,其中O1、O2、O3血清型在感染中占絕大部分,文獻(xiàn)報道達(dá)80%[22,25]。Clements等[26]研究證實純化的LPS可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗KP感染的免疫保護(hù)作用,且O抗原特異性抗體可用于治療或預(yù)防KP感染。Jain等[27]運(yùn)用熱酚提取法從KP中提取LPS抗原成份,采用乳液離子凝膠化法制備包被LPS的海藻酸鈉微粒,在瑞士白化小鼠分別經(jīng)由肌內(nèi)、氣管內(nèi)和鼻內(nèi)三種免疫途徑比較游離LPS和包被LPS在體內(nèi)的免疫原性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)途徑接種,包被LPS比游離LPS顯示出更強(qiáng)的免疫原性。其他多項研究也證明了LPS較強(qiáng)的免疫原性,且這種免疫原性其與其他革蘭陰性桿菌能共享交叉反應(yīng),從而顯示其作為候選疫苗的優(yōu)勢。需要指出的是,LPS疫苗主動免疫的明顯缺點則是其不良的內(nèi)毒素反應(yīng),但通過酸或堿性水解或與脂質(zhì)體結(jié)合則可降低這種內(nèi)毒素毒性。
結(jié)合疫苗是運(yùn)用化學(xué)方法將多糖抗原共價結(jié)合到載體蛋白上形成糖蛋白,從而達(dá)到持久的免疫保護(hù)效應(yīng)。最先報道的KP結(jié)合疫苗,是將2個單位的重復(fù)四糖(八糖抗原)偶聯(lián)到牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)上,研究結(jié)果顯示兩種混合物都產(chǎn)生了胸腺依賴性抗原[28]。早在2002年,Libon等[29]嘗試將莢膜多糖與P40(KP重組外膜蛋白A,具有良好的抗原載體性質(zhì),是多肽和多糖的載體分子[30])結(jié)合制成疫苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)合后莢膜多糖的免疫原性明顯增強(qiáng)。因此,研究者推測,具有T-輔助表位的P40有利于同源B-T細(xì)胞間的相互作用;Ahmad等[31]則于2012年構(gòu)建了O-抗原與外膜蛋白結(jié)合的結(jié)合疫苗,并對其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、安全性以及對尿路感染、肺部感染及血流感染的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了觀察,發(fā)現(xiàn)這種其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用可以通過胎盤傳遞給疫苗接種的實驗兔模型子代,表明這種結(jié)合疫苗具有持久的免疫原性。由于目前載體蛋白種類單一且生產(chǎn)成本較高,在一定程度上限制了結(jié)合疫苗的發(fā)展。
反向疫苗學(xué)是通過對某一病原體基因組測序分析,篩選出抗原決定簇,并對這些抗原決定簇進(jìn)行高通量克隆、表達(dá)、純化,得到重組蛋白,并對候選抗原進(jìn)行體內(nèi)、體外評價,從而篩選出保護(hù)性抗原,并運(yùn)用于疫苗的研制。與傳統(tǒng)疫苗研究方法相比,RV更加便捷、寬泛、安全。目前反向疫苗學(xué)越來越廣泛運(yùn)用到各種病原微生物的疫苗研究中[32]。Lundberg等[33]于2013年從100例臨床診斷為KP感染(其中包括皮膚或軟組織感染、肺炎、敗血癥、腹腔內(nèi)感染和尿路感染)個體及89名健康個體的血清中進(jìn)行全基因組抗原選擇,運(yùn)用抗原組學(xué)(Antigenome)技術(shù)篩選出KP的169種抗原蛋白,包括已知的保護(hù)性抗原Fep A。然后通過體外分析和鼠科感染模型,確定了8種能夠誘導(dǎo)主動免疫提供保護(hù)作用的新蛋白,這8種新蛋白有望用于KP疫苗的制備。反向疫苗學(xué)開辟了一條新的疫苗研制途徑,有助于預(yù)測和發(fā)現(xiàn)以往未知的免疫原,在今后疫苗發(fā)展中將發(fā)揮越來越重要的作用。
KP是自然界中的常見細(xì)菌,同時也是最常見的機(jī)會性致病菌之一。近年來,隨著高效廣譜抗菌藥物的廣泛使用,KP的耐藥性不斷增加,已成為世界公共衛(wèi)生的一大難題,利用疫苗預(yù)防和控制KP感染成為一種新的策略。目前眾多研究表明:滅活全菌、核糖體、EVs、蛋白、多糖等具有良好的免疫原性和抗原性,但各有其優(yōu)缺點。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷成熟,RV也開始應(yīng)用于疫苗的研制開發(fā),隨著對KP基因組成及致病機(jī)制的不斷研究及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,終有一日KP疫苗應(yīng)用于臨床不再是設(shè)想。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突