促紅細(xì)胞生成素對肝癌生長影響的臨床研究

李瑞芹 鄭海濤 蘇偉民 陳鳳燕

普寧市人民醫(yī)院 （普寧515300）

肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，且發(fā)展迅速，短期內(nèi)病死率高，嚴(yán)重威脅著人們的健康［1］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移離不開腫瘤組織新生血管的形成，腫瘤新生血管是腫瘤形成和發(fā)展的基礎(chǔ)［2］。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）及促紅細(xì)胞生成素受體（EPO receipter，EPOR）除了調(diào)節(jié)紅系的發(fā)生與發(fā)展外，其在多種非紅系組織細(xì)胞中也有表達(dá)［3］。最新的研究表明，EPO作為一種內(nèi)源性促血管生成因子參與了多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，它促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞的生長，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，有益于腫瘤細(xì)胞在缺氧的環(huán)境中存活［4］。對血管生成及調(diào)節(jié)的具體機(jī)制的研究有助于為HCC的抗血管生成治療提供新的治療靶點(diǎn)。HCC是典型的多血管腫瘤，研究表明HCC的預(yù)后與腫瘤的微血管密度（microvessel density，MVD）有關(guān)［5］。但HCC中EPO和EPOR表達(dá)情況及其于MVD之間的關(guān)系卻鮮見報道?；谝陨?，本研究采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測癌組織和癌旁組織中EPO及EPOR表達(dá)水平，利用免疫組織化學(xué)方法染色檢測微血管密度（MVD），旨在探討癌組織、癌旁組織和正常組織中EPO、EPOR及MVD的差異，分析EPO、EPOR表達(dá)水平與MVD之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)同意，選取我院2016年1月—2018年3月收治的手術(shù)切除HCC的標(biāo)本30例，同時取腫瘤邊緣2.0 cm的肝組織作為對照，另取10例肝外傷、肝膿腫、肝內(nèi)膽管結(jié)石、肝囊腫等患者肝臟組織作為陰性對照。記錄所有患者一般資料及臨床病理資料。HCC患者中，男17例，女13例，年齡范圍27～75歲，平均年齡（45.28±9.58）歲。正常肝臟組織組患者中，男5例，女5例，年齡范圍25～72歲，平均年齡（42.11±8.67）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)滿足：臨床癥狀滿足HCC診斷，并且病理結(jié)果證實(shí)為HCC。②正常肝臟診斷標(biāo)準(zhǔn)：肝臟組織病理結(jié)果證實(shí)為正常肝臟組織。③患者年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過放化療治療者；②存在內(nèi)分泌、免疫、代謝性疾?。虎刍颊甙橛衅渌绊懷芯康南到y(tǒng)性疾病，如嚴(yán)重心臟疾病、嚴(yán)重肺部疾病、嚴(yán)重腎功能異常、其他部位腫瘤等。

1.2 觀察指標(biāo)

EPO及EPOR表達(dá)水平：取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊，PBS沖洗后置于冰上剪碎勻漿，于4℃條件下5 000 g離心5min，留存上清液備用。利用EPO ELISA kits（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，YM-Y11494）、EPOR ELISA kits（上海晶抗生物工程有限公司，JK-a-5635）檢測EPO及EPOR表達(dá)水平。

MVD檢測：根據(jù)Weidner［6］報道的經(jīng)典MVD檢測方法進(jìn)行檢測，先在低倍鏡（×100）下尋找組織中血管密度最高的4個區(qū)域，然后在高倍鏡（×400）下計數(shù)MVD，取4個象限的均值記為該組織的MVD。遇到管腔很大的特殊類型的微血管，其單位面積內(nèi)的血管數(shù)相對較少，則采用由Tanigawa N［7］報道的改良法計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，對計數(shù)資料用率（%）表示，兩組比較進(jìn)行c2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布且方差齊性資料比較采用t檢驗(yàn)，否則采用t'檢驗(yàn)，連續(xù)變量相關(guān)分析采用Person相關(guān)分析。以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPR、EPOR、MVD在不同組織中的表達(dá)

HCC組織中，EPR、EPOR、MVD均高于癌旁組織和正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），EPR、EPOR、MVD在癌旁組織和正常組織中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 HCC中EPR、EPOR、MVD與臨床病理特征間的關(guān)系

EPR、EPOR、MVD水平在HCC患者年齡、性別構(gòu)成間，不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），腫瘤大?。? cm、存在包膜侵犯、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及高中分化的HCC中，EPR、EPOR、MVD水平高于腫瘤大小≤5 cm、無包膜侵犯、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及低分化的水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 EPR、EPOR、MVD在不同組織中的表達(dá)

表1 EPR、EPOR、MVD在不同組織中的表達(dá)

n HCC組織（H）癌旁組織（P）正常組織（N）30 30 10 t P EPO/（mIU·mL-1）36.67±3.28 12.13±1.68 11.22±1.90 t HvsP=36.473 t HvsN=23.149 t PvsN=1.437 PHvsP＜0.001 P HvsN＜0.001 PPvsN=0.159 EPOR/（mIU·mL-1）53.38±7.66 27.82±5.21 24.83±4.96 t HvsP=15.112 t HvsN=10.991 t PvsN=1.589 PHvsP＜0.001 P HvsN＜0.001 PPvsN=0.120 MVD/（n·mm-2）44.62±9.76 23.18±5.31 21.44±4.79 t HvsP=10.569 t HvsN=9.911 t PvsN=0.918 PHvsP＜0.001 P HvsN＜0.001 PPvsN=0.364

表2 HCC中EPR、EPOR、MVD與臨床病理特征間的關(guān)系

表2 HCC中EPR、EPOR、MVD與臨床病理特征間的關(guān)系

特征年齡（歲）＞60 n EPO/（mIU·mL-1）表達(dá)量t P EPOR/（mIU·mL-1）表達(dá)量t P MVD/（n·mm-2）密度t P 18 37.22±4.13 54.79±8.12 45.72±7.77 0.771 0.447 0.639 0.528 0.547 0.588≤60性別12 35.89±5.31 52.88±7.87 44.21±6.79男 女17 13 37.18±4.23 36.29±5.02 0.527 0.602 55.02±8.23 52.79±7.92 0.747 0.461 45.66±7.92 44.31±7.01 0.486 0.631腫瘤大小/cm＞5 11 39.28±4.33 56.72±7.93 47.97±7.33 3.055 0.005 2.175 0.038 2.311 0.028≤5包膜侵犯（+）19 34.32±4.26 50.08±8.13 41.28±7.81 11 39.35±4.28 57.29±8.05 48.14±7.51 3.337 0.002 2.737 0.011 2.715 0.011（-）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（+）19 34.02±4.18 48.83±8.22 40.06±8.04 12 39.27±4.19 57.12±7.81 48.22±7.33 3.348 0.002 2.941 0.006 2.481 0.019（-）分化程度低分化18 34.14±4.06 48.58±7.78 41.13±7.88 13 39.77±4.71 58.93±7.89 52.28±8.83 4.215＜0.001 3.686＜0.001 5.271＜0.001高中分化17 32.25±4.94 48.53±7.48 35.57±8.43

2.3 EPO、EPOR表達(dá)水平與MVD之間的關(guān)系

Person相關(guān)分析結(jié)果顯示，EPO表達(dá)水平與MVD呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.651（P＜0.001），EPOR表達(dá)水平與MVD呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.620（P＜0.001）。

3 討論

EPOR是EPO的特異性膜受體，EPO可與EPOR結(jié)合，從而激活JAK/STAT、Ras/MAP等信號通路［8-9］。而這些信號通路又與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［10］。目前研究表明，EPO作為一種內(nèi)源性促血管生成因子與EPOR結(jié)合，參與了多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤微血管形成是腫瘤建立血液循環(huán)的過程。MVD可直接反應(yīng)腫瘤微血管形成的水平，常作為反映腫瘤血管生成的代表性指標(biāo)之一，不僅能夠反映腫瘤的供氧，也可間接反映腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤能力［10-11］。HCC是典型的多血管腫瘤，MVD水平的檢測具有重要的意義?；谝陨?，本研究通過分析EPO、EPOR在NCC中的表達(dá)規(guī)律，以及它們和MVD之間的關(guān)系，擬為進(jìn)一步闡明HCC微血管發(fā)生的機(jī)制提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中，EPO、EPOR、MVD均高于癌旁組織和正常組織，而在癌旁組織和正常組織中，盡管癌旁組織EPO、EPOR、MVD水平高于正常組織，但無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果與以往Qu Z［12］的研究結(jié)果相一致。EPO在由HCC細(xì)胞分泌后，可通過自分泌或者旁分泌的方式與EPOR相結(jié)合，最終作用于HCC血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮促進(jìn)HCC微血管形成的作用［13］。而在癌旁組織或正常組織中，由于缺少HCC細(xì)胞的分泌作用，EPO、EPOR表達(dá)呈低水平，減少了MVD的數(shù)量。

為了進(jìn)一步探討HCC組織中，EPO、EPOR、MVD與腫瘤病理學(xué)特征之間的關(guān)系，本研究按不同年齡組、性別、腫瘤大小、有無包膜侵犯、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化程度將樣本進(jìn)行分組比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤大?。? cm、存在包膜侵犯、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及高中分化的HCC中，EPR、EPOR、MVD水平明顯高于相對應(yīng)的分組。這說明，EPR、EPOR、MVD與HCC病理學(xué)特征密切相關(guān)，EPR、EPOR、MVD高的患者，其腫瘤較大，存在包膜侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，惡性程度也較高。提示，它們在HCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。

為了探討EPR、EPOR是否與MVD之間存在關(guān)系，本研究利用Person相關(guān)分析分析了EPO、EPOR表達(dá)水平與MVD之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPO表達(dá)水平、EPOR表達(dá)水平分別與MVD的呈正相關(guān)。提示EPO、EPOR可能通過直接或間接途徑增加MVD。

綜上所述，盡管本研究初步證實(shí)了EPO、EPOR、MVD在HCC中呈現(xiàn)高水平，且與腫瘤大小、局部侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，其機(jī)制可能與EPO、EPOR增加MVD有關(guān)。但由于納入研究的樣本量較少，可能使結(jié)果產(chǎn)生偏倚，在今后的研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，增加EPO、EPOR、MVD對患者無瘤生存期的影響，以進(jìn)一步探索EPO、EPOR、MVD與HCC腫瘤生長的機(jī)制。