日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療小鼠外陰陰道念珠菌病的療效觀察

劉道凡 伍啟康

(1.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院皮膚科，佛山 528000；2. 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，佛山 528000)

陰道念珠菌病是常見的婦科疾病之一，是由假絲酵母菌感染引起的炎癥[1]，主要臨床表現(xiàn)為白帶異常、外陰水腫、紅斑伴瘙癢、灼燒感等，在患者的陰道灌洗液中細(xì)胞因子水平也會出現(xiàn)變化[2-3]。日舒安洗液是由20多種中藥提取得到的外用中藥制劑，主要成分苦參，具有殺蟲止癢、清熱燥濕等功效，可用于治療多種類型陰道炎以及其他婦科疾病。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日舒安洗液治療陰道炎療效明顯[4]?？嗣惯蚴菑V譜抗真菌藥物，可以通過抑制真菌細(xì)胞膜的合成抑制真菌的生長，研究表明克霉唑可有效地抑制念珠菌病[5]。目前治療念珠菌性陰道炎多采用單藥治療，長期治療癥狀易反復(fù)，療效欠佳，給患者精神和身體帶來較大痛苦。因此找到有效的治療手段能夠抑制念珠菌、進(jìn)而緩解并治愈念珠菌性陰道炎是臨床亟待解決的問題之一。本次研究以BALB/c雌鼠為疾病研究模型，觀察日舒安洗液聯(lián)合氟康唑?qū)ν怅庩幍滥钪榫〉寞熜А?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

日舒安洗液由貴州漢方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；克霉唑片由樂普藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；IL12、IL10和IL6的ELISA試劑盒(南京森貝伽生物有限公司)；Trizol試劑盒(invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas:K1622(Thermo Scientific)；SYBR Green試劑盒(QIAGEN公司)。

菌懸液的制備 將新傳代的白念珠菌14053接種于YDP液體培養(yǎng)基上，30℃，200 r/min培養(yǎng)18 h，用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，調(diào)節(jié)白念珠菌孢子濃度為3×106CFU/mL。

實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c雌鼠(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，鼠齡8周)。

儀器 ABI-Veriti型普通PCR儀(美國Applied Biosystems)；美國ABI 熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分組 將95只BALB/c雌鼠隨機(jī)分為4組，A組5只為空白對照組, B組30只為模型對照組, C組30只為克霉唑治療組(克霉唑每天陰道內(nèi)使用1.5 mg/L 100 μL),D組30只為日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療組(日舒安洗液稀釋10倍，反復(fù)沖洗陰道，1次/d，克霉唑每天陰道內(nèi)使用1.5 mg/L 100 μL)。除了空白對照組外其他組都要先建立外陰陰道念珠菌病模型。

念珠菌病小鼠疾病模型建立[6]首先將B組，C和D組每只小鼠皮下注射1 mg/mL苯甲酸雌二醇油劑0.1 mL，每隔1 d注射1次，共注射3次。第6天后，用無菌水對小鼠陰道進(jìn)行灌洗，對灌洗液進(jìn)行觀察是否有小鼠陰道上皮細(xì)胞，若有上皮細(xì)胞，將準(zhǔn)備好的白念珠菌菌液(3×106CFU/mL)接種小鼠陰道內(nèi)，每只10 μL，接種后將小鼠倒立3 min以防止菌液流出，使用同樣的操作方法持續(xù)接種3 d。

藥物治療 在念珠菌病小鼠疾病模型建立成功1d后，對小鼠進(jìn)行治療。A組和B組每天予等量的生理鹽水沖洗陰道，C組每天只用克霉唑陰道內(nèi)使用1.5 mg/L 100 μL進(jìn)行治療, 對D組小鼠用稀釋10倍的日舒安洗液，反復(fù)沖洗陰道，每日1次，并同時聯(lián)合克霉唑每天陰道內(nèi)使用1.5 mg/L 100 μL進(jìn)行治療。

1.3 療效評價

在治療后的第8天取各組小鼠陰道灌洗液進(jìn)行菌落培養(yǎng)，采用涂布法檢測小鼠的陰道真菌載荷量，并通過ELISA檢測IL-2和IL-8的水平；qRT-PCR法檢測小鼠陰道組織中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較用方差分析，兩組間比較用 LSD-t 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體重變化

在前8天4組小鼠的體重均保持穩(wěn)定，接種后B、C和D組小鼠體重下降，隨后體重逐漸上升，接近接種前水平。A、B、C和D組4組小鼠之間體重未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，如圖1所示。

圖1 小鼠體重變化圖

2.2 各組小鼠陰道灌洗液真菌載量

通過涂布法檢測小鼠的陰道真菌載荷量，A組小鼠陰道真菌載荷均為陰性，B組、C組和D組檢測結(jié)果如表1-3所示。在治療后的第1、2、3、6、8、10和14天，B組和C組，C組和D組小鼠陰道灌洗液培養(yǎng)真菌載荷量均具有統(tǒng)計學(xué)差異，P均小于0.01。C組和D組小鼠陰道灌洗液培養(yǎng)，治療后第2天較第1天明顯降低，但第3天增高，隨后C組和D組小鼠陰道真菌載荷量均逐漸降低，但D組小鼠陰道真菌載荷量小于C組小鼠，兩組之間CFU差異有顯著性(P值均<0.01)。D 組小鼠治療后第3天有2例轉(zhuǎn)陰，感染后第8天有3例轉(zhuǎn)陰,14 d后有6例轉(zhuǎn)陰，C組小鼠只在14 d后有1例轉(zhuǎn)陰，B組小鼠未見轉(zhuǎn)陰標(biāo)本。

表1 3組小鼠陰道灌洗液真菌載量(CFU/mL)

表2 B、C兩組小鼠陰道灌洗液真菌載量(CFU/mL)

表3 D、C兩組小鼠陰道灌洗液真菌載量(CFU/mL)

2.3 各組小鼠IL-2和IL-8檢測結(jié)果

使用ELISA試劑盒檢測各組小鼠IL-2和IL-8水平，A組小鼠IL-2的均值為(86.42±6.32) pg/mL，IL-8的均值為(88.21±19.68) pg/mL。檢測B組、C組和D組小鼠在治療前后的IL-2和IL-8表達(dá)水平，結(jié)果如圖2、3所示，D組和C組小鼠分別經(jīng)日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療和單用克霉唑治療后陰道分泌物中IL-2和IL-8的表達(dá)水平明顯下降，D組的表達(dá)水平低于C組和B組，C組小鼠的表達(dá)水平低于B組，組間相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P值均<0.01)。說明日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療小鼠外陰陰道念珠菌病效果顯著，效果比單用克霉唑治療好。

圖2 3組小鼠IL-2表達(dá)水平

圖3 3組小鼠IL-8表達(dá)水平

2.4 各組小鼠NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)檢測

與正常組A組比較，模型組B組的NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)分別上調(diào)了5.82、3.16和4.58倍，用日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療過的小鼠NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)分別上調(diào)了2.20、2.22和2.88倍，單用克霉唑治療過的小鼠NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)分別上調(diào)了3.78、2.62和3.56倍，見圖4-6。B組和C組,C組和D組相比NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P值均<0.01)，說明日舒安洗液聯(lián)合克霉唑和單用克霉唑治療后小鼠NLRP3炎癥小體激活被抑制，但日舒安洗液聯(lián)合克霉唑的效果更好。

3 討 論

本文研究觀察了日舒安洗液聯(lián)合克霉唑?qū)π∈笸怅庩幍滥钪榫〉闹委熥饔眯Ч?，通過檢測小鼠陰道灌洗液真菌載量、IL-2和IL-8的表達(dá)及NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)來檢測其治療作用。

圖4各組小鼠NLRP3 mRNA表達(dá)檢測圖5各組小鼠ASC mRNA表達(dá)檢測圖6各組小鼠caspase-1 mRNA表達(dá)檢測

Fig.4Detection of NLRP3 mRNA expression in miceFig.5Detection of ASC mRNA expression in miceFig.6Detection of caspase-1 mRNA expression in mice

本次研究中，日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療小鼠后小鼠陰道灌洗液真菌載量明顯降低，低于單用克霉唑治療組。在外陰陰道念珠菌病患者的陰道灌洗液中細(xì)胞因子的水平會出現(xiàn)明顯的升高，如IL-2和IL-8，兩者是炎性反應(yīng)中較為重要的炎性因子，可參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。IL-2是T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可通過自分泌活化T細(xì)胞 ，調(diào)控炎癥、自身免疫病、心血管等疾病進(jìn)展。IL-8是白介素家族成員，同時也是趨化因子之一，在炎癥過程中其分泌增加，可促進(jìn)白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等向炎癥部位趨化，進(jìn)而參與炎癥過程。日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療小鼠后，小鼠的IL-2和IL-8顯著降低，低于單用克霉唑治療組。

NLRP3是一類炎性小體，炎性小體可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，其活化對炎癥發(fā)展具有重要意義，為闡明病毒、真菌、細(xì)菌等炎癥過程提供依據(jù)。目前NLRP3的相關(guān)研究較多[7]，NLRP3是由接頭分子ASC、識別分子NLRP3以及效應(yīng)分子半胱天冬酶1(caspase-1)組成[8]。本次研究中發(fā)現(xiàn)日舒安洗液聯(lián)合克霉唑治療小鼠后NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)均降低，與單用克霉唑治療組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，日舒安洗液聯(lián)合克霉唑能明顯降低外陰陰道念珠菌病小鼠的真菌載量及炎癥反應(yīng)，治療作用顯著，優(yōu)于單用克霉唑治療。