不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇生長發(fā)育的影響

張紅剛，郭明慧，郭 尚，張 程，郭霄飛，張 勇，劉 晶

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西太原030031）

白靈菇（Pleurotus nebrodensis）是白靈側(cè)耳的商品名稱，又名白阿魏側(cè)耳、白阿魏蘑、白靈芝菇等，屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）[1]。它主要野生于我國新疆一帶傘形科大型草本植物刺芹、阿魏等植株上[2]。其菇肉質(zhì)細嫩，味美可口，被譽為“草原上的牛肝菌”，同時該菇具有很高的藥用價值，可以調(diào)節(jié)人體生理平衡，增強人體免疫功能。白靈菇屬于珍稀食用菌，是我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的少數(shù)菇種之一，經(jīng)濟價值較高。

目前白靈菇在栽培過程中存在諸多問題：現(xiàn)蕾不均勻、現(xiàn)蕾率低，具體表現(xiàn)在生產(chǎn)中菌棒要么現(xiàn)蕾多但成活率低，要么現(xiàn)蕾極少，不出菇，不易控制；與其他菇種相比，其菌絲長滿菌袋后仍需60 d以上的后熟期，且必須低溫3～8℃催蕾，生產(chǎn)中經(jīng)常因技術(shù)水平要求太高而導(dǎo)致失敗，從而制約了它的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。研究解決白靈菇生產(chǎn)中存在的這些問題，對于白靈菇產(chǎn)業(yè)來說迫在眉睫。

生長調(diào)節(jié)劑在很多農(nóng)作物上得到應(yīng)用。研究表明，其能夠有效改善作物品質(zhì)，使產(chǎn)量提高，并且有改善收獲和貯存條件等作用，使用后可取得顯著的經(jīng)濟效益[3]。近年來，關(guān)于生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在食用菌上的應(yīng)用逐漸增多，特別是國外已經(jīng)將生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用作為食用菌產(chǎn)量及品質(zhì)提升的關(guān)鍵因素，并且已經(jīng)商業(yè)化，但關(guān)于生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇生長發(fā)育及酶活性的影響研究較少。白靈菇生長發(fā)育主要依靠自身不斷分泌各種胞外酶來分解、吸收培養(yǎng)基中的碳氮營養(yǎng)[4]。胞外酶的活性同培養(yǎng)基質(zhì)中纖維素的降解速度和食用菌子實體產(chǎn)量有關(guān)[5]。葉敘豐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在香菇栽培出菇階段噴施三十烷醇，可適當(dāng)增產(chǎn)并提高子實體內(nèi)總氨基酸態(tài)氮的含量。尹紅芳[7]研究表明，赤霉素、三十烷醇對毛木耳的菌絲生長具有一定的促進作用。張慧鋒[8]研究發(fā)現(xiàn)，在蛹蟲草培養(yǎng)基中適量添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠提高蛹蟲草的多糖含量，促進子實體生長。這些研究均表明，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)應(yīng)用于食用菌生產(chǎn)，能夠誘導(dǎo)細胞的分裂和伸長，激活并提高多種酶的活性，加快機體的代謝活動，同時增強菌絲生長過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而加速菌絲的生長，促進菌絲體扭結(jié)現(xiàn)蕾，進而使子實體快速生長，并且使用后子實體具有個頭大、品質(zhì)優(yōu)且外觀商品性好等特點[9-13]。而生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的這些功效，正是解決白靈菇生產(chǎn)中存在的上述問題的關(guān)鍵所在。

本試驗通過研究多種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇生長發(fā)育及胞外酶活性的影響，進而為下一步解決白靈菇現(xiàn)蕾不均勻、現(xiàn)蕾率低、后熟期太長、需要低溫促熟等生產(chǎn)實際問題提供解決途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 供試菌株編號為BL-2，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。

1.1.2 試劑與儀器 三十烷醇、蕓苔素內(nèi)酯、3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、赤霉素、萘乙酸，購自廣州林國化肥有限公司；3，5-二硝基水楊酸（DNS），購自上海生工生物技術(shù)有限公司。水浴鍋（恒溫）（50±1）℃，電熱干燥箱（80±1）℃，TU-1810PC 型紫外可見分光光度儀，均購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 培養(yǎng)基配方：蛋白胨2 g，葡萄糖 20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，酵母浸膏 4 g，瓊脂15 g，VB110 mg，水 1 000 mL，pH 值自然。

栽培袋配方：木屑55%，棉籽皮20%，玉米芯10%，麩皮10%，玉米粉3%，石灰1%，石膏1%。料∶水＝1∶（1.1～1.2）。

在高溫（121℃）、高壓（110 kPa）下滅菌。

1.2 菌袋制作管理及不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理方法

1.2.1 栽培管理 菌袋每袋裝干料250 g，含水量調(diào)至65%，攪拌均勻后，裝至17 cm×33 cm×0.05 cm聚丙烯塑料袋內(nèi)，碼入滅菌鍋，溫度調(diào)至121℃，高壓滅菌2.5 h，冷卻至室溫，超凈工作臺無菌操作接種。接種完成后，將栽培袋置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為（25±1）℃。栽培袋菌絲長滿時移入培養(yǎng)室，在（22±1）℃條件下進行后熟管理。

后熟培養(yǎng)30 d，進行搔菌，隨后繼續(xù)培養(yǎng)5 d，再移入可控溫出菇房，按照試驗設(shè)計，部分進行溫差刺激催蕾，溫度控制在4～15℃，空氣相對濕度90%～95%。出菇期溫度控制在（14±2）℃，CO2濃度≤1 000 mg/L，空氣相對濕度90%～95%。在催蕾和出菇期間，晝夜光照交替[14]。

1.2.2 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配制及噴施方法 其配制方法列于表1。在滅好菌的培養(yǎng)袋接種口處噴施不同濃度的已滅菌（用針筒式微孔濾膜過濾器）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)1 mL，然后接種，接種等量的原種，設(shè)5個重復(fù)，然后常規(guī)栽培培養(yǎng)，觀察各生長階段情況，隨后在催蕾期往接種面上噴施1 mL不同種類的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，進行現(xiàn)蕾期觀察。

表1 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配制

1.2.3 取樣方法 接種后第 10，20，35，45，55，65，70，75，85，95，105，115 天進行取樣，基本為每隔 10 d取樣一次，取樣部位為菌袋的接種點向下2 cm處、中部和距底部2 cm處，每個部位3次重復(fù)，每次取樣將單個重復(fù)的3個部位的樣品混勻待用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生理特性的測定 每個處理隨機抽取5個菌袋，接種10 d后，在菌袋外側(cè)劃線，之后每隔5 d劃線1次，劃第3次后計數(shù)統(tǒng)計，并計算菌絲的平均生長速度[15]。

現(xiàn)蕾天數(shù)按噴施不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)后出現(xiàn)第一個菇蕾的時間記錄。

1.3.2 粗酶液制備和酶活性的測定 從每個處理中隨機抽取3個菌袋，將取出的培養(yǎng)料混勻，加5倍蒸餾水，室溫下浸提1 h，過濾去渣，上清液即為酶提取液，測定羧甲基纖維素酶活性和半纖維素酶活性。

1.3.2.1 纖維素酶（CMC）活性測定 取3支15 mL刻度試管分別加入0.2mL酶液，再分別吸取1.8 mL CMC溶液，50℃水浴保溫30 min，空白樣用0.2 mL酶液，加入1.8 mL醋酸緩沖液，同樣50℃水浴30 min，再吸取DNS 2 mL搖勻后，具塞，沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后，補加水至15 mL，輕輕上下?lián)u勻，用空白調(diào)零點，于550 nm下測OD值[16-19]。

1.3.2.2 半纖維素酶（HC）活性測定 15 mL刻度試管中加入酶液0.2 mL，再各吸取1.8 mL1%的木聚糖溶液，搖勻，50℃水溶60 min，取出后，再吸取2 mLDNS試劑搖勻，具塞，立即沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻后，補加水定容到15 mL，輕輕上下?lián)u勻，空白用0.2 mL酶液、1.8 mL醋酸緩沖液，不加木聚糖溶液，同樣依上述步驟，用空白調(diào)零點，于550 nm下測 OD 值[16-19]。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0對不同處理的菌絲生長速度、出菇率、酶活性等指標進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇生理特性的影響

由表2可知，7種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇菌生理特性均產(chǎn)生影響。在菌絲生長速度方面，7種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)均能加速菌絲生長，其中，三十烷醇和6-芐氨基嘌呤處理后菌絲生長速度較快，分別為6.84，6.62 mm/d，與CK之間差異達極顯著水平，其次為赤霉素、蕓苔素內(nèi)酯和3-吲哚乙酸，分別為5.74，5.66，5.44 mm/d，與 CK 間差異達顯著水平，萘乙酸對菌絲生長速度影響較小，僅為4.49 mm/d。

噴施三十烷醇和蕓苔素內(nèi)酯的培養(yǎng)袋菌絲長勢最旺盛，3-吲哚乙酸和赤霉素處理后的長勢次之，萘乙酸處理后與CK對比差異不顯著，而6-芐氨基嘌呤處理后菌絲長勢較弱。

表2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇生理特性的影響

不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對出菇率影響較小，噴施蕓苔素內(nèi)酯后出菇率最高，可達98.76%，三十烷醇次之，達98.49%，二者之間差異不顯著。噴施3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤和萘乙酸與CK之間差異未達顯著水平，僅有赤霉素噴施后表現(xiàn)出出菇率降低的趨勢，但與CK之間差異不顯著。

噴施這7種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)后，生物學(xué)效率與平均產(chǎn)量變化趨勢一致，蕓苔素內(nèi)酯和三十烷醇處理后的生物學(xué)效率和產(chǎn)量均較高，分別為62.79%，61.32%和251.16，245.28 g/袋。3-吲哚乙酸和赤霉素處理后生物學(xué)效率與產(chǎn)量與CK之間差異顯著。6-芐氨基嘌呤和萘乙酸處理后，與CK之間差異未達顯著水平。

噴施蕓苔素內(nèi)酯后現(xiàn)蕾天數(shù)最短，為（108±2）d。三十烷醇處理后比CK現(xiàn)蕾天數(shù)提前6 d，3-吲哚乙酸和6-芐氨基嘌呤處理后現(xiàn)蕾天數(shù)相近，比CK現(xiàn)蕾天數(shù)均提前2 d，赤霉素和萘乙酸處理后現(xiàn)蕾天數(shù)與CK表現(xiàn)一致。

2.2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇酶活性的影響

2.2.1 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇不同生長階段纖維素酶活性的影響 從圖1可以看出，噴施不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)后，對白靈菇不同生長發(fā)育階段羧甲基纖維素酶活性影響不同，但總體變化趨勢與CK保持一致，即現(xiàn)蕾前較低，現(xiàn)蕾后迅速升高。蕓苔素內(nèi)酯對羧甲基纖維素酶影響最大，噴施之后在各個階段均能顯著提高其活性，與CK之間差異顯著。第105天時達最大值（20.2 U），隨后急劇降至14.5 U。三十烷醇影響次之，與CK之間差異也達顯著水平，其在第70天時，酶活性最低，為1.6 U，隨后快速上升，在第105天時達最大值，為19.3 U。6-芐氨基嘌呤、赤霉素和萘乙酸對白靈菇各生長階段的羧甲基纖維素酶活性雖能提高，但與CK之間差異不顯著。所有處理均表現(xiàn)出在后熟期開始至第45天達第1個峰值，隨后降低，在第70天達最小值，隨后急劇上升，在第105天時達第2個峰值，隨后又下降。

2.2.2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對白靈菇不同生長階段半纖維素酶活性的影響 從圖2可以看出，噴施生長調(diào)節(jié)物質(zhì)后，白靈菇不同生長發(fā)育階段半纖維素酶活性均有提高，但總體趨勢與CK保持一致，即現(xiàn)蕾前較低，現(xiàn)蕾后迅速升高。蕓苔素內(nèi)酯對半纖維素酶影響最大，噴施之后在各個階段均能顯著提高其活性，在第105天時達44.3 U，與CK之間差異極顯著，隨后115 d時，急劇下降為6.23 U，此時半纖維素酶活性與CK之間差異仍達顯著水平。

其次為3-吲哚乙酸和三十烷醇，對半纖維素酶活性影響二者之間差異不顯著，與CK之間差異顯著，在第105天時均達最大值，分別為44.3，45.9 U，隨后又分別急劇降至5.1，5.23 U。6-芐氨基嘌呤、赤霉素和萘乙酸對白靈菇各生長階段的半纖維素酶影響與CK之間差異不顯著。所有處理均表現(xiàn)出在第35天時達第1個峰值，隨后降低，在第65天時達最小值，隨后急劇上升，在第105天時達第2個峰值，隨后又下降。

3 結(jié)論與討論

不同種類的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)施用可明顯促進白靈菇菌絲生長，縮短發(fā)菌和現(xiàn)蕾時間，使出菇相對集中，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，蕓苔素內(nèi)酯對白靈菇生長發(fā)育調(diào)節(jié)作用較大，可使現(xiàn)蕾期提前13 d左右，同時有效改善白靈菇現(xiàn)蕾前需低溫處理的條件。三十烷醇和3-吲哚乙酸對白靈菇生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用次之，對白靈菇的提前現(xiàn)蕾和提高出菇率也有促進作用。這些結(jié)果應(yīng)該與生長調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠促進白靈菇細胞分裂，進而增強胞外酶活性有關(guān)[20]。

雖然本研究為解決白靈菇現(xiàn)蕾不均勻、現(xiàn)蕾率低、后熟期太長、需要低溫促熟等生產(chǎn)實際問題提供了依據(jù)，但本研究只針對單一生長調(diào)節(jié)物質(zhì)噴施后的影響進行了研究，尚未對復(fù)合型生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響做進一步研究，另外，關(guān)于生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用的最佳時期和濃度還有待于進一步探索。