大麥單粒種子起源的小孢子培養(yǎng)再生頻率研究

郭桂梅,何 婷,劉成洪,高潤(rùn)紅,徐紅衛(wèi),李穎波,黃劍華,王亦菲,陸瑞菊

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106)

遠(yuǎn)緣雜交是向栽培品種導(dǎo)入優(yōu)異基因的有效方法，但雜交成功率、結(jié)實(shí)率均較低。遺傳背景相同的純合群體可以大幅度減少來自供試材料引起的試驗(yàn)誤差，但是，其構(gòu)建費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。源于單粒種子的小孢子培養(yǎng)高頻再生技術(shù)可以有效克服上述難題。

大麥小孢子培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟[1-2]，大量再生綠苗的獲得為加快大麥育種進(jìn)程和相關(guān)的機(jī)理分析提供了有利條件。陸瑞菊等[3-4]建立了大麥大田取材高效的小孢子培養(yǎng)體系；郭桂梅等[5]建立了溫室單粒種子分蘗穗高效形成技術(shù)。影響游離小孢子培養(yǎng)效率的因素復(fù)雜、繁多，對(duì)小孢子培養(yǎng)的供體植株、取材時(shí)期、前期預(yù)處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化、植株再生等諸多方面均有研究報(bào)道[2]。有關(guān)單株培養(yǎng)的效率研究還未見報(bào)道。

本研究以大麥花30經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的加倍單倍體株系為供試材料，在已有研究基礎(chǔ)上[3-9]，于可控的人工氣候室中，研究離體穗預(yù)處理時(shí)間、離體小花預(yù)處理時(shí)間和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機(jī)氮、有機(jī)氮含量以及添加PEG對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的影響，為稀缺大麥資源的種質(zhì)繁殖和創(chuàng)造同一親本來源的群體遺傳材料提供途徑，以更好地開展相關(guān)遺傳機(jī)理研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大麥(HordeumvulgareL.)品種花30經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的加倍單倍體株系(編號(hào)6-3)的7株小孢子再生植株(編號(hào)6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-10、6-3-20、6-3-23)及6-3-6的4株小孢子再生植株(編號(hào)6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)。

1.2 方法

1.2.1 植株培養(yǎng)與取材

11株材料用盆缽種植于人工氣候室，光照強(qiáng)度25 μmol·m-2·s-1，光暗比12/12，溫度22 ℃/18 ℃,濕度70%。參照郭桂梅等[5]的方法，調(diào)節(jié)水、肥、溫度等，促進(jìn)植株分蘗，以獲得足夠多的穗子進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。選取穗中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗子，剪去葉片(保留上部?jī)善~子基部約1.5 cm)，濕紗布包裹放入保鮮袋中，標(biāo)號(hào)，5 ℃冰箱低溫處理。

1.2.2 小孢子培養(yǎng)

將1.2.1中低溫處理的穗子參照陸瑞菊等[10]和Lu等[4]方法進(jìn)行小孢子游離。接種時(shí)，穗子的滅菌參照郭桂梅等[11]方法。每個(gè)試管接5個(gè)穗子的花苞，加入12 mL提取液(60 g·L-1甘露醇、1.1 g·L-1CaCl2、0.976 g·L-1MES、20 mg·L-1秋水仙堿，pH 5.8，下同)，用高速分散器以15 000 r·min-1旋切，150目篩網(wǎng)過濾，濾液700 r·min-1離心5 min，重復(fù)3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液于25 ℃暗處理2 d后，用21%麥芽糖純化；誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌1次，用其將小孢子密度調(diào)節(jié)至1.0×105個(gè)·mL-1。取1.0 mL小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(35 mm×12 mm)中，Parafilm封口，25 ℃暗培養(yǎng)19 d后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基吸干，稱重愈傷組織；然后將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，25℃、12 h光照培養(yǎng)，待再生苗長(zhǎng)至3 cm左右進(jìn)行綠苗數(shù)目統(tǒng)計(jì)。正常的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6為基本培養(yǎng)基，其中，KNO3和(NH4)2SO4含量降低一半[KNO3降低至1 415 mg·L-1，(NH4)2SO4降至231.5 mg·L-1]，鐵鹽加倍，并添加90 g·L-1麥芽糖、0.5 mg·L-1KT、1.0 mg·L-12,4-D、0.976 g·L-1MES、400 mg·L-1谷氨酰胺及100 mg·L-1水解干酪素，pH 5.8。分化培養(yǎng)基是以2/3MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g·L-1麥芽糖、0.5 mg·L-16-BA、1.5 mg·L-1KT及0.05 mg·L-1NAA，用5.5 g·L-1瓊脂粉固化， pH 5.8。提取液和誘導(dǎo)培養(yǎng)基為過濾滅菌，分化培養(yǎng)基為0.11 Mpa、121 ℃高溫高壓滅菌15 min。

1.2.3 愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的條件優(yōu)化

將不同單株(6-3-4、6-3-6、6-3-10、6-3-23)的離體穗進(jìn)行不同時(shí)間(19 d 和32 d)的5℃低溫預(yù)處理后進(jìn)行小孢子培養(yǎng)(同1.2.2)；將不同單株(6-3-10、6-3-20、6-3-23)的離體小花用提取液5 ℃預(yù)處理0 d、1 d和2 d后進(jìn)行小孢子培養(yǎng)(同1.2.2)，測(cè)定其產(chǎn)生的愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力，研究低溫預(yù)處理時(shí)間和離體小花提取液預(yù)處理時(shí)間對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的影響。

將6份單株材料(6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的穗子按照1.2.2方法置于5 ℃冰箱預(yù)處理19 d進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為正常培養(yǎng)基和1/2無機(jī)氮培養(yǎng)基，其中后者是在正常誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將KNO3和(NH4)2SO4再降低一半[KNO3降低至707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4降至115.75 mg·L-1]；愈傷組織稱重后放入相同的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化，統(tǒng)計(jì)綠苗產(chǎn)量。同時(shí)將其中的4份單株材料(6-3-4、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的小孢子置于1/2無機(jī)氮培養(yǎng)基和添加了1 600 mg·L-1谷氨酰胺及400 mg·L-1水解干酪素的1/2無機(jī)氮培養(yǎng)基上(有機(jī)氮提高4倍)進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力， 研究無機(jī)氮和有機(jī)氮對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的影響。

將4份單株材料(6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)的小孢子置于正常誘導(dǎo)培養(yǎng)基和添加了4%PEG的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基同1.2.2，統(tǒng)計(jì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力，研究PEG對(duì)此三個(gè)指標(biāo)的影響。

1.2.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

愈傷組織產(chǎn)量：每皿小孢子培養(yǎng)19 d時(shí)產(chǎn)生的愈傷組織量，用mg·皿-1表示； 綠苗產(chǎn)量：每皿愈傷組織分化出的綠苗數(shù)，用株·皿-1表示；再生能力：每100 mg愈傷組織分化出的綠苗數(shù)，用株·100 mg-1愈傷組織表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、DPS V7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體穗5 ℃處理時(shí)間對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表1可以看出，單株6-3-10預(yù)處理32 d的愈傷組織產(chǎn)量和綠苗產(chǎn)量高于預(yù)處理19 d，而其他3份單株都是預(yù)處理19 d的效果優(yōu)于32 d，其中，6-3-4和6-3-6差異達(dá)顯著水平。低溫預(yù)處理時(shí)間從19 d增加到32 d，所有供試單株的再生能力均下降，4份供試單株中，3份單株的再生能力在處理間差異顯著。6-3-23變幅最大，預(yù)處理19 d 時(shí)的愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力分別是預(yù)處理32 d的1.41倍、6.75倍和4.75倍。

* 和 ** 分別表示預(yù)處理32 d與19 d間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

* and ** mean significant difference between the pretreatments at 19 d and 32 d at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.2 離體小花提取液預(yù)處理時(shí)間對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表2可以看出，提取液預(yù)處理時(shí)間對(duì)6-3-20的愈傷組織產(chǎn)量無顯著影響，對(duì)其綠苗產(chǎn)量、再生能力及其他材料的愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力均有顯著影響，且均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(6-3-10的愈傷組織除外)，不同處理間差異均達(dá)顯著水平(6-3-10除外)。單株6-3-10的離體小花培養(yǎng)的愈傷組織與綠苗情況見圖1A和B。

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表3～5同。

Different letters following data in same row mean significant difference between treatments at 0.05 level.The same in tables 3-5.

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機(jī)氮含量對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表3可以看出，6份單株材料經(jīng)低無機(jī)氮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理后，愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力均高于對(duì)照，其中，3份單株材料的愈傷組織在處理間差異顯著；6份材料的綠苗產(chǎn)量在處理間差異均顯著，增加幅度最大的是6-3-20(圖1C)，達(dá)到8.63倍，增加幅度最小的6-3-23，為1.53倍。5份材料的再生能力在處理間差異顯著。這些結(jié)果表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機(jī)氮的降低，有利于胚性愈傷組織的形成，使得更多的愈傷組織能夠在分化培養(yǎng)基上形成綠苗。

2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機(jī)氮含量對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表4可以看出，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機(jī)氮含量提高后，4份單株材料的愈傷組織產(chǎn)量和綠苗產(chǎn)量均顯著增加，再生能力在處理間差異不顯著；綠苗產(chǎn)量與愈傷組織產(chǎn)量的提高幅度相當(dāng)。推測(cè)有機(jī)氮的提高使得更多的小孢子脫分化啟動(dòng)形成愈傷組織(圖1D)，進(jìn)而增加綠苗的數(shù)量。

A和B：小花預(yù)處理0 d、1 d、2 d的愈傷組織與綠苗；C：對(duì)照與處理(1/2無機(jī)氮)綠苗長(zhǎng)勢(shì)；D：對(duì)照與處理(增加有機(jī)氮)愈傷組織。

A and B:Callus and green plants with floret nursing in extraction buffer；C:Green plants in normal and low inorganic nitrogen；D:Callus in normal and high organic nitrogen.

圖1大麥單株小孢子培養(yǎng)的愈傷組織與植株分化

Fig.1Callusgreenplantofbarleymicrosporeculturefromsingledonorplant

表3 無機(jī)氮對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響Table 3 Effect of inorganic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

表4 有機(jī)氮對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響Table 4 Effect of organic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

2.5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PEG對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表5可以看出，PEG的添加對(duì)供試單株的愈傷組織產(chǎn)量影響不盡相同，除單株6-3-6-10降低外，其余3株均提高，但僅6-3-6-2提高顯著；PEG的添加使所有單株的綠苗產(chǎn)量均提高，且除單株6-3-6-4外均達(dá)顯著水平；所有單株的再生能力在添加PEG后均顯著提高。

表5 PEG對(duì)愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響Table 5 Effect of the addition of PEG on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

3 討 論

在早期的花藥培養(yǎng)研究中，離體穗的低溫預(yù)處理和花藥的甘露醇預(yù)處理被廣泛應(yīng)用于大麥花藥培養(yǎng)。雖然直接游離大麥小孢子也能獲得再生植株[12]，但是離體穗的低溫預(yù)處理有助于游離小孢子的脫分化啟動(dòng)[13-15]，甘露醇(提取液主要成分)預(yù)處理的培養(yǎng)效果也得到證實(shí)[16]。這種簡(jiǎn)單易行且非常有效的預(yù)處理方法在大麥、青稞和水稻的小孢子培養(yǎng)上同樣被廣泛采用[7,17-18]。本研究以大麥小孢子培養(yǎng)的單株為取材對(duì)象，比較了離體穗5 ℃處理19 d和32 d的培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)離體穗經(jīng)過19 d的低溫預(yù)處理后，小孢子更容易啟動(dòng)脫分化程序，且形成的愈傷組織質(zhì)量好，具有更大的綠苗分化潛力，但這種效果會(huì)隨著供試單株不同而有所差異。小花或未成熟子房的共培養(yǎng)，可以促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)生[4,19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小孢子游離前用提取液預(yù)處理小花1～2 d，也可以促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)愈傷組織的形成和綠苗的分化。

培養(yǎng)基的選擇是植物離體培養(yǎng)中最能體現(xiàn)人為調(diào)控作用的因素之一，培養(yǎng)基中氮源的重要性在大麥花藥培養(yǎng)上早已證實(shí)。早期的工作以MS培養(yǎng)基和略作修改的MS培養(yǎng)基最普遍，后來N6、C17和W14培養(yǎng)基的發(fā)明及應(yīng)用極大地推動(dòng)了禾本科植物組織培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)的進(jìn)步[21-22]。將MS培養(yǎng)基中NH4NO3含量降低至165 mg·L-1對(duì)大麥花藥培養(yǎng)的成功至關(guān)重要[23]，培養(yǎng)基中無機(jī)氮源的影響在大麥小孢子培養(yǎng)上早已證實(shí)[7,9,24]。但有機(jī)氮的作用有爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺會(huì)使白苗的數(shù)量大幅度增加[25]；谷氨酰胺的添加對(duì)水稻愈傷誘導(dǎo)具有基因型的選擇，而且不能夠提高植株的再生頻率[26]。也有研究表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺能夠促進(jìn)水稻愈傷的誘導(dǎo)以及綠苗再生[27]；水解干酪素的添加能夠提高大麥花藥培養(yǎng)中綠苗率，降低白苗的數(shù)量[28]。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)降低誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機(jī)氮含量[KNO31 415～707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4231.5～115.5 mg·L-1]，能顯著提高單株小孢子培養(yǎng)綠苗產(chǎn)量，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機(jī)氮源含量提高，可以大幅度提高大麥小孢子離體培養(yǎng)的愈傷組織產(chǎn)量，從而提高綠苗產(chǎn)量。

PEG作為滲透脅迫物質(zhì)可以對(duì)植物造成水分脅迫，因而被廣泛應(yīng)用于植物抗旱性鑒定研究。有研究表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入較低濃度的PEG(80～100 mg·L-1)，可以提高小麥花藥培養(yǎng)的出愈率，PEG濃度達(dá)到120 mg·L-1時(shí)對(duì)供試材料的花藥出愈起到脅迫作用，在小麥的花藥培養(yǎng)中，供試材料整株水平的抗旱性與細(xì)胞水平的抗旱性存在著內(nèi)在的關(guān)系[29-30]。小孢子培養(yǎng)必須采用液體培養(yǎng)方式，而通氣差是液體培養(yǎng)的致命缺點(diǎn)。為了改善液體培養(yǎng)基中的通氣條件，有研究表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加Ficoll能提高綠苗得率[31]，不過Ficoll比較貴，在以育種為目的的小孢子培養(yǎng)中不常使用。我們?cè)诒驹囼?yàn)中觀察到，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了4%的PEG后，培養(yǎng)的小孢子很多呈漂浮狀態(tài)，而對(duì)照培養(yǎng)基中小孢子一般都下沉在培養(yǎng)皿的底部。因此，推測(cè)PEG的作用類似Ficoll，通過改善通氣條件使得愈傷組織的質(zhì)量有了提高，從而提高了愈傷組織的綠苗再生能力，使綠苗產(chǎn)量有了大幅度提高。