基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn) TaGAPDH8基因小麥的獲得與鑒定

雷代麗，雷瑛彤，張 琳，張陽(yáng)璞，鄧西平，楊淑慎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100; 2.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界范圍內(nèi)種植最廣的糧食作物之一，它為人類提供了超過(guò)20%的熱量和蛋白質(zhì)，以及豐富的礦質(zhì)元素等。但近年來(lái)溫室效應(yīng)及土地鹽堿化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量受到了嚴(yán)重的威脅[1]，現(xiàn)有小麥品種已經(jīng)難以滿足人們對(duì)高品質(zhì)小麥日益增長(zhǎng)的客觀需求。培養(yǎng)高抗的優(yōu)良作物品種一直是育種專家們研究的重點(diǎn)。但傳統(tǒng)的雜交育種方法無(wú)法避免育種周期長(zhǎng)、雜交困難及無(wú)法獲得優(yōu)良性狀的小麥品種等難題[2]。目前，小麥抗逆新品種的培育也因基因庫(kù)的匱乏和方法的局限而落后于其他農(nóng)作物。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，深入探索小麥生理生化特點(diǎn)，在分子水平上挖掘小麥抗逆基因、了解其抗逆機(jī)制，借助基因工程手段將抗性基因?qū)胄←?，培育具有?yōu)良性狀的抗旱、高產(chǎn)、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的品種是解決當(dāng)今糧食短缺的根本途徑之一[3]。

目前基因槍介導(dǎo)法是應(yīng)用最廣的植物轉(zhuǎn)化方法之一，其原理是利用金屬微粒將其上攜帶的外源基因高速射入受體細(xì)胞，外源基因隨機(jī)插入受體細(xì)胞基因組并整合，最終得以表達(dá)。Vasil等[4]首次利用基因槍介導(dǎo)法將草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)導(dǎo)入小麥品種Pavon，獲得了世界上第一批轉(zhuǎn)基因小麥植株，為開展小麥分子育種奠定了基礎(chǔ)。隨后，Weeks等[5]利用基因槍介導(dǎo)法分別將β-葡萄糖苷酸標(biāo)記基因(gus)、bar基因?qū)肓诵←湥醪浇⒘嘶驑尫ㄞD(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。據(jù)統(tǒng)計(jì)，隨著基因槍法在單子葉植物方面的轉(zhuǎn)化技術(shù)越來(lái)越成熟，該法已占到小麥遺傳轉(zhuǎn)化的68.8%[6]。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 是一種高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白，幾乎在所有組織和器官中均能穩(wěn)定表達(dá)。它在真核生物和原核生物的細(xì)胞中占有10%～20%的蛋白總量，因其表達(dá)的穩(wěn)定性，它常被人們選作內(nèi)參進(jìn)行研究[7]。然而越來(lái)越多的研究表明，GAPDH在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性等諸多方面都發(fā)揮著多元化的功能。在植物基礎(chǔ)代謝方面，GAPDH參與植物碳水化合物(如糖類[8]和油脂[9])的積累，以及種子成熟和細(xì)胞程序性死亡過(guò)程[10]；在植物生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)方面，gapc1和gapc2的缺失會(huì)造成植物根系發(fā)育受阻、植株矮小和雄性不育等癥狀[11]；在植物抗逆方面，過(guò)表達(dá)GAPDH能夠增強(qiáng)植物對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)能力[12]。此外，GAPDH能通過(guò)降低過(guò)氧化物的方式減輕高鹽對(duì)植物的毒害[13]，這種抗鹽功能可能與GAPDH能和參與鹽脅迫的第二信使磷脂酸(phosphatidic acid,PA)相互作用有關(guān)[14]。

同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，用PEG處理抗旱小麥品種長(zhǎng)武134后，植株大量表達(dá)分子量約為39.5 kD的GAPDH蛋白[15]。隨著小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)日趨完整，Zeng等[16]在小麥基因組中共發(fā)現(xiàn)22個(gè)TaGAPDH基因亞型，除去其中3個(gè)編碼非磷酸化蛋白的TaGAPN，共有13個(gè)基因亞型能夠編碼具有完整結(jié)構(gòu)域的蛋白。TaGAPDH8基因便是其中特殊的一個(gè)，該基因長(zhǎng)1 690 bp，含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)編碼一個(gè)由337個(gè)氨基酸組成、分子量為36.61 kD、pI為 6.67的磷酸化蛋白(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)。張 琳[17]研究發(fā)現(xiàn)，小麥中的TaGAPDH8基因會(huì)被某些脅迫大量誘導(dǎo)表達(dá)。本研究選擇廣泛種植于陜西和甘肅地區(qū)的抗旱小麥品種長(zhǎng)武134和干旱敏感小麥品種鄭引1號(hào)為材料，采用基因槍法建立這兩個(gè)品種的轉(zhuǎn)基因體系，并獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的T3代株系，以期為進(jìn)一步研究TaGAPDH8基因的生物學(xué)功能提供技術(shù)支撐和基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為抗旱品種長(zhǎng)武134(CW134)和干旱敏感品種鄭引1號(hào)(ZY1)，由中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所提供。干擾表達(dá)載體pTCK303-RNAi由張 琳[17]提供，該載體中正義片段(Fragment1)和反義片段(Fragment2)之間由水稻內(nèi)含子(rice intron)隔開。過(guò)表達(dá)載體pTCK303-TaGAPDH8由張陽(yáng)璞[18]提供，該載體中SacI和SpeI兩酶切位點(diǎn)之間的序列由TaGAPDH8基因編碼序列代替。

1.2 培養(yǎng)基

本研究所用培養(yǎng)基類型及配方如下：誘導(dǎo)/恢復(fù)培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-12,4-D+500 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖；高滲培養(yǎng)基：誘導(dǎo)/恢復(fù)培養(yǎng)基+0.2 mol·L-1甘露醇+0.2 mol·L-1山梨醇；分化培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-1玉米素+0.5 mg·L-1激動(dòng)素+25 mg·L-1潮霉素+30 g·L-1蔗糖；生根培養(yǎng)基：1/2 MS+25 mg·L-1潮霉素+15 g·L-1蔗糖。在每種培養(yǎng)基中加入7 g·L-1瓊脂粉,pH 調(diào)節(jié)為5.8，高溫高壓滅菌。其中水解酪蛋白、玉米素(solarbio)、潮霉素(solarbio)經(jīng)過(guò)濾除菌，再加入滅菌后溫度降至50 ℃左右的培養(yǎng)基中。

1.3 小麥愈傷組織的誘導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化

參考池青等[19]的方法對(duì)小麥進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的愈傷組織轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)14～21 d，再于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)28～35 d。將分化出的幼苗轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中，在幼苗根長(zhǎng)2～3 cm時(shí)轉(zhuǎn)入4 ℃培養(yǎng)箱春化30 d，再移栽入花盆中培養(yǎng)。

1.4 再生植株的PCR鑒定與后代種植

待T0代再生植株長(zhǎng)至三葉一心期，利用CTAB法提取潮霉素抗性小麥的基因組DNA，以檢測(cè)載體序列上的潮霉素抗性基因(491 bp)，引物序列為Fhyg：5′- TACTCTACACAGCCAT CGGGTCCAG，Rhyg：5′-ACTGGCAAA CTGT GATGGACGAC，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR體系和程序參考2×TaqMasterMix(近岸蛋白，上海)說(shuō)明書進(jìn)行，其中退火溫度為57 ℃，循環(huán)數(shù)為35，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

選擇PCR陽(yáng)性植株單穗收取種子并做好標(biāo)記，晾干后播種，將T1和T2代小麥種植后分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)方法同T0代植株，收獲T3代小麥種子。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)情況比較

隨機(jī)挑取大田T2代轉(zhuǎn)基因小麥和普通小麥植株，于乳熟期測(cè)量株高和穗長(zhǎng)，收獲期測(cè)量穗粒數(shù)和千粒重。測(cè)量方法參照李立會(huì)[20]的標(biāo)準(zhǔn)，株高為地上部分長(zhǎng)度(不包括芒)，每組測(cè)5株；穗長(zhǎng)為穗基部至頂部(不包括芒)，每組測(cè)5穗；隨機(jī)挑出1 000粒種子并稱重計(jì)算千粒重，重復(fù)3次。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR鑒定

選取大小一致的T3代轉(zhuǎn)基因小麥和對(duì)照組小麥種子，用0.1%的HgCl2消毒15 min，無(wú)菌水沖洗數(shù)次后浸泡16～20 h，腹溝向下平鋪在鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，加蒸餾水室溫中黑暗萌發(fā)1 d，10 h光照/14 h黑暗條件下培養(yǎng)14 d后取樣。將樣品于液氮中速凍后放入-80 ℃冰箱中保存。用Trizol(TaKaRa，日本)提取植株總RNA，并按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)TaGAPDH8基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(FGAPDH8：5′-CCACC AGCCGTCCCACAATA，RGAPDH8：5′-GAACC AATCTCCCAATCCGTC，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為207 bp)，以小麥β-Actin基因(GenBank 注冊(cè)號(hào)：AB181991)為內(nèi)參(引物為Factin：5′-CGACTCTG GTGATGGTGTGAG,Ractin：5′-AGCAAGGTCC AAACGAAGGA，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為85 bp)，使用CFX 96 Touch Real-time PCR Dectection System(Bio-Rad,美國(guó))，按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，日本)說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 22軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因槍法轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織及再生植株的結(jié)果

用含有目的基因和篩選標(biāo)記基因Hyg的干擾載體和過(guò)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化1 000個(gè)CW134愈傷組織和1 000個(gè)ZY1愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選，最終移栽成活15株CW134幼苗(圖1A),植株再生率為1.5%，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性植株為9株(圖2A)，陽(yáng)性植株轉(zhuǎn)化率為0.9%；獲得ZY1再生苗23株(圖1B)，植株再生率為4.6%，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性植株為13株(圖2B)，陽(yáng)性植株轉(zhuǎn)化率為2.6%。

2.2 T1代轉(zhuǎn)基因小麥鑒定

對(duì)長(zhǎng)武134和鄭引1號(hào)T1代植株進(jìn)行PCR鑒定，分別獲得5株和9株陽(yáng)性植株(圖3)，最終將收獲種子的4個(gè)長(zhǎng)武134株系和8個(gè)鄭引1號(hào)株系分別命名為CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13以及ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17。

2.3 T2代轉(zhuǎn)基因小麥在大田的生長(zhǎng)狀況比較

將T1代轉(zhuǎn)基因小麥種子種植到大田，測(cè)量乳熟期小麥的株高、穗長(zhǎng)、千粒重和穗粒數(shù)。在RNA干擾株系中，與對(duì)照相比，CW134-6和CW134-12的千粒重極顯著(P<0.01)提高，株高顯著(P<0.05)降低；CW134-13的穗長(zhǎng)顯著(P<0.05)降低。在過(guò)表達(dá)株系中，與對(duì)照相比，ZY1-10的穗長(zhǎng)、千粒重和穗粒數(shù)極顯著(P<0.01)提高，株高顯著(P<0.05)降低；ZY1-1和ZY1-3的穗長(zhǎng)、千粒重和穗粒數(shù)極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)提高，株高顯著(P<0.05)增加；其余5個(gè)株系也都至少有2個(gè)性狀與對(duì)照的差異達(dá)到了顯著水平。

A：轉(zhuǎn)基因CW134；B：轉(zhuǎn)基因ZY1。 A:Transgenic plants of CW134;B:Transgenic plants of ZY1.

圖1轉(zhuǎn)基因小麥植株

Fig.1Wheattransgenicplant

1：長(zhǎng)武134的陰性植株；2～6：長(zhǎng)武134的陽(yáng)性植株；7～12:鄭引1號(hào)的陽(yáng)性植株；M:DL2000 DNA marker。

1:Negative plant of CW134;2-6:Positive plants of CW134;7-12:Positive plants of ZY1;M:DL2000 DNA marker.

圖2長(zhǎng)武134(A)和鄭引1號(hào)(B)部分T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果

Fig.2PCRdetectionresultsofT0generationplantsofCW134(A)andZY1(B)

1～3和5～10：鄭引1號(hào)的陽(yáng)性植株；4：鄭引1號(hào)的陰性植株；11、12、14、15、17：長(zhǎng)武134的陽(yáng)性植株；13、16、18：長(zhǎng)武134的陰性植株；M：DL2000 marker。

1-3 and 5-10:Positive plants of ZY1;4:Negative plant of ZY1;11,12,14,15 and 17:Positive plants of CW134;13,16 and 18:Negative plants of CW134; M:DL2000 DNA marker.

圖3T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果

Fig.3PCRdetectionresultsofT1generationplants

表1 T2代轉(zhuǎn)基因小麥株系的主要農(nóng)藝性狀Table 1 Major agronomic traits of T2 transgenic ZY1 and CW134 lines

*和**分別表示與CK的差異達(dá)到了顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

* and** indicate significant differences between transgenic lines and CK at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.4 TaGAPDH8基因的表達(dá)分析

以T3代轉(zhuǎn)基因小麥的株系為材料提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR鑒定結(jié)果表明，正常生長(zhǎng)條件下株系間TaGPDH8基因的表達(dá)水平存在差異。4個(gè)長(zhǎng)武134株系均表現(xiàn)出較低的表達(dá)量(圖4A)，尤其是CW134-12和CW134-3，TaGAPDH8基因的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的21%和53%，表明在這兩個(gè)株系中目的基因的表達(dá)受到了較大程度的抑制。在鄭引1號(hào)的8個(gè)株系中，TaGAPDH8基因的表達(dá)量均高于對(duì)照(圖4B)，其中ZY1-10的表達(dá)量最高，ZY1-1次之，分別為對(duì)照的3.02和4.02倍。

A:4個(gè)干擾表達(dá)株系中TaGPDH8基因的表達(dá)量；B:8個(gè)過(guò)表達(dá)株系中TaGPDH8基因的表達(dá)量。

A:Relative expression levels ofTaGAPDH8in four RNAi lines;B:Relative expression levels ofTaGAPDH8in eight overexpression lines.

圖4正常生長(zhǎng)條件下TaGPDH8基因在小麥株系中的表達(dá)分析

Fig.4TaGAPDH8geneexpressioninwheatlinesundernormalgrowthconditions

3 討 論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速、定向獲得植物新品種，但目標(biāo)基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)卻難以控制。作為六倍體(AABBDD)單子葉植物，小麥具有龐大的基因組和大量的重復(fù)序列，遺傳背景復(fù)雜，轉(zhuǎn)化難度大。研究發(fā)現(xiàn)，外植體的選擇成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化成果與否與的關(guān)鍵,小麥材料的再生效率成為首要的考慮因素。雖然可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的組織有根、成熟胚、花藥、幼穗、幼胚和莖分生組織等多種類型，但幼胚再生性能最好[21]，因此本試驗(yàn)以幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

本試驗(yàn)以長(zhǎng)武134和鄭引1號(hào)小麥為材料成功獲得遺傳外源基因的轉(zhuǎn)化植株，其T0代植株轉(zhuǎn)化效率分別為0.9%和2.6%，說(shuō)明轉(zhuǎn)化效率過(guò)低的問(wèn)題仍然存在。這與外植體的基因型、培養(yǎng)基成分、受體預(yù)處理方式和處理時(shí)間、受體轟擊后培養(yǎng)及篩選，以及轉(zhuǎn)化條件如微彈種類、直徑大小和用量、轟擊距離和壓力等[22]多種因素相關(guān)?；驑屴D(zhuǎn)化法操作步驟繁瑣，過(guò)低的轉(zhuǎn)化率一直是限制其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)T2代小麥株系進(jìn)行了形態(tài)指標(biāo)測(cè)量和基因表達(dá)分析。長(zhǎng)武134株系中變化比較明顯的是千粒重，既有顯著降低(P<0.01，CW134-6),也有顯著升高(P<0.01，CW134-12)；而由于鄭引1號(hào)株系比較多，其植株的農(nóng)藝性狀差異也更大。造成這種結(jié)果的原因可能與各株系間目的基因的表達(dá)量有所差異，如轉(zhuǎn)化了RNAi載體的株系CW134-12的TaGAPDH8基因的表達(dá)量只有對(duì)照的0.21倍，而CW134-13卻高達(dá)0.78倍；轉(zhuǎn)化了過(guò)表達(dá)載體的ZY1-1、ZY1-4和ZY1-10的表達(dá)量提高到了2倍以上。造成植株農(nóng)藝性狀和基因表達(dá)量差異的原因有很多，如株系間外源基因拷貝數(shù)、插入位點(diǎn)、大田復(fù)雜的環(huán)境等?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化的植株外源基因拷貝數(shù)多，其隨機(jī)整合的特點(diǎn)使每個(gè)株系的基因表達(dá)各有不同，還容易導(dǎo)致外源基因沉默和丟失的情況。如ZY1-3和ZY1-10中TaGAPDH基因的表達(dá)量相差了3.29倍，原因可能是在ZY1-3中外源基因插入的位點(diǎn)在非編碼區(qū)，導(dǎo)致外源基因無(wú)法翻譯。因此在以后的試驗(yàn)中需要從這些株系中挑選出具有優(yōu)良性狀的株系進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究了小麥轉(zhuǎn)化體系以及T2代轉(zhuǎn)基因小麥在大田的性狀，得到了與對(duì)照植株相比具有明顯差異的株系(表1)。此外，本試驗(yàn)還探究了T3代小麥中TaGAPDH基因的表達(dá)量，證明確實(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因株系，如下調(diào)基因表達(dá)的CW134-3和CW134-6及上調(diào)基因表達(dá)的ZY1-1和ZY1-10(圖4)。綜上所述，本試驗(yàn)采用基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚的方法成功獲得TaGAPDH8的轉(zhuǎn)基因株系，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。