嵌合抗原受體T細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展

譚灝，李祥，康永，劉聰，楊偉晗

山西省中醫(yī)藥研究院方劑實(shí)驗(yàn)室，太原 030012 00

近年來(lái)，盡管放療、化療及手術(shù)治療等常規(guī)腫瘤治療方法可以起到一定的治療效果，但腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及患者生存率低等問(wèn)題仍未得到妥善解決[1]。隨著臨床研究的深入開(kāi)展，嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor transduced T，CAR-T）細(xì)胞療法成為近年來(lái)腫瘤免疫治療的新方法并逐漸成為解決上述難題的重要方法[2-3]。CAR-T細(xì)胞免疫治療新策略給腫瘤患者帶來(lái)新的希望[4]，但仍有不足之處。

常規(guī)抗腫瘤治療的靶點(diǎn)位于腫瘤組織及細(xì)胞，但腫瘤免疫治療的重點(diǎn)在于提高患者自身免疫力。CAR-T細(xì)胞作為個(gè)體化的“活藥物”，結(jié)合T細(xì)胞殺傷作用和抗原抗體高親和性，經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)使T淋巴細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）后，在機(jī)體內(nèi)識(shí)別腫瘤抗原，進(jìn)而起到精確殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。CAR-T細(xì)胞療法在卵巢癌、淋巴瘤及白血病等[5-6]惡性腫瘤治療中可以高效、準(zhǔn)確地定位腫瘤靶點(diǎn)，療效可靠。與單克隆抗體相比，CAR-T細(xì)胞具有更有效且持久的抗腫瘤效果。

1 CAR的主要結(jié)構(gòu)

CAR結(jié)構(gòu)包含3個(gè)部分，依次為細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)及跨膜區(qū)。細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)的主要作用是對(duì)靶細(xì)胞外表的特異性抗原進(jìn)行特異性識(shí)別，并起著決定性作用。CD3、CD4及CD28等構(gòu)成了CAR跨膜區(qū)。該區(qū)域包括單鏈可變片段和鉸鏈區(qū)，其中單鏈可變片段是克服主要組織相容性復(fù)合體限制的關(guān)鍵，鉸鏈區(qū)促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原的選擇。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)的主要功能為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前CAR的信號(hào)域大致分為3代，已經(jīng)從第1代單信號(hào)分子發(fā)展到含有CD28、4-1BB和其他共刺激分子的多信號(hào)域（第2、3代），并被廣泛應(yīng)用于臨床[7]。

2 CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制

1989年Gross等首次提出了建立CAR，將抗原抗體的高親和性與T細(xì)胞的殺傷作用相結(jié)合，構(gòu)建特異性CAR。通過(guò)一定途徑將編碼CAR的基因插入T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該抗體[8]。經(jīng)一系列免疫反應(yīng)修飾T細(xì)胞，再通過(guò)體外擴(kuò)增及純化后重新輸入機(jī)體內(nèi)。組建的CAR-T細(xì)胞不僅可以特異性識(shí)別腫瘤抗原，還可以與其有效結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用。在基因修飾的作用下，T細(xì)胞可以起到靶向殺傷的作用。腫瘤局部免疫微循環(huán)不僅不會(huì)對(duì)其進(jìn)行抑制，還可以影響宿主免疫耐受，最終對(duì)腫瘤細(xì)胞起到特異性殺傷效果[9]。CAR-T細(xì)胞有3代，盡管第1代可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，但僅表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞活化[10]，且其分泌的細(xì)胞因子水平過(guò)低，無(wú)法取得持久的抗腫瘤效應(yīng)和T細(xì)胞增殖作用。為了使T細(xì)胞獲得更好的活化效果，第2代CAR-T細(xì)胞重組了共刺激分子，將CD28、CD137等置入CAR-T細(xì)胞中。一方面明顯增強(qiáng)了腫瘤相關(guān)抗原的活性；另一方面加速了白細(xì)胞介素-2的分泌，增強(qiáng)了T細(xì)胞的活化及增殖，起到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。在第3代CAR-T細(xì)胞中，CAR細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)多加入了兩個(gè)共刺激分子。與第2代對(duì)比，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其抗腫瘤效應(yīng)更強(qiáng)。盡管第3代CAR增強(qiáng)磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）信號(hào)通路活性[11]，上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)，強(qiáng)化T細(xì)胞活化、增殖，但共刺激分子較強(qiáng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴以及信號(hào)泄露。除此之外，其還會(huì)下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)閾值，造成未獲得抗原刺激下激活T細(xì)胞，最終殺傷鄰近正常組織細(xì)胞。目前，CAR技術(shù)已發(fā)展到第4代，在血液腫瘤和實(shí)體腫瘤治療中取得了一定的效果。

3 CAR-T細(xì)胞在臨床治療中的應(yīng)用

常規(guī)腫瘤治療方法如手術(shù)治療、化療等的不良反應(yīng)給患者身心帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。而CAR-T細(xì)胞療法不會(huì)明顯損傷正常細(xì)胞，僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用，不良反應(yīng)極少，因此可以提高患者的治療依從性；同時(shí)CAR-T細(xì)胞還可以重建，增強(qiáng)患者的免疫功能，在抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮長(zhǎng)效機(jī)制[12]。

CAR-T細(xì)胞可經(jīng)單鏈抗體片段（single chain antibody fragment，scFv）可變區(qū)序列對(duì)腫瘤特異性抗原進(jìn)行識(shí)別，再通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分泌顆粒酶、穿孔素等，同時(shí)表達(dá)腫瘤壞死因子及Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）蛋白相關(guān)的凋亡配體，促使腫瘤細(xì)胞逐漸凋亡。另外，CAR-T細(xì)胞需要冷凍保存，冷凍可減少細(xì)胞因子如干擾素γ、白細(xì)胞介素-2及腫瘤壞死因子α等的分泌，具有抗腫瘤的作用[4]。很多血液腫瘤均具備特異性抗原及單克隆抗體，可以為CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建提供有效的scFv可變區(qū)以及靶點(diǎn)。因此，在血液腫瘤治療時(shí)CAR-T細(xì)胞應(yīng)用廣泛，如CD19、CD133[13]。

3.1 CAR-T細(xì)胞在B細(xì)胞惡性腫瘤中的應(yīng)用

經(jīng)CAR修飾的自體或異體來(lái)源的T細(xì)胞靶向B細(xì)胞惡性腫瘤抗原CD19的研究，構(gòu)建了CAR-T-19慢病毒表達(dá)載體，培養(yǎng)CAR-T-19細(xì)胞擴(kuò)增體系。先通過(guò)體外殺傷實(shí)驗(yàn)，后對(duì)9例患者進(jìn)行臨床研究，得出CAR-T-19細(xì)胞治療難治、復(fù)發(fā)性小兒急性淋巴細(xì)胞白血病可獲得有效的疾病緩解[14-15]，B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤是一種非常罕見(jiàn)的惡性腫瘤，以抗CD20為基礎(chǔ)的化學(xué)免疫療法的標(biāo)準(zhǔn)治療對(duì)該病的控制非常有效。然而，標(biāo)準(zhǔn)療法對(duì)雙重打擊淋巴瘤、轉(zhuǎn)化型淋巴瘤或早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者效果較差。過(guò)繼性CAR-T細(xì)胞治療是一項(xiàng)可以有效治療預(yù)后不良的B細(xì)胞淋巴瘤患者的新技術(shù)[16]。在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤治療中靶向CD19的CAR-T細(xì)胞重定向免疫療法成為一種新的選擇，特別在難治、復(fù)發(fā)性非霍奇金淋巴瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中取得較好的效果[17]。除治療外，臨床護(hù)理也至關(guān)重要。通過(guò)分析13例接受CAR-T細(xì)胞免疫療法的B淋巴細(xì)胞血液惡性腫瘤患者的治療效果，得出充分的治療準(zhǔn)備、積極的護(hù)理配合和并發(fā)癥的處理是促進(jìn)患者康復(fù)的關(guān)鍵[18]。采用Meta分析法檢測(cè)CAR-T-19細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性血液疾病的臨床療效，得出靶向CD19的CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性血液疾病的臨床療效顯著[19-20]。

3.2 CAR-T細(xì)胞在白血病中的應(yīng)用

在急性髓細(xì)胞樣白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）治療中發(fā)現(xiàn)化療耐藥和復(fù)發(fā)仍然是患者死亡的重要原因。由于化療藥物通常誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的組織急性壞死或長(zhǎng)期不良反應(yīng)，進(jìn)一步強(qiáng)化常規(guī)細(xì)胞毒性藥物化療可能行不通。因此，腫瘤抗原重定向CAR-T細(xì)胞免疫治療在復(fù)發(fā)或難治性B淋巴細(xì)胞白血病患者中發(fā)揮積極作用，成為AML患者的新精確藥物治療方法，可能提高白血病患者的緩解率并減少不良反應(yīng)。治療過(guò)程中選擇最佳靶抗原，考慮不良反應(yīng)緩解策略，以及規(guī)避潛在的CAR-T細(xì)胞耐藥性，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)AML患者的細(xì)胞免疫治療至關(guān)重要[21]。

CD19陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病的有效治療方法首選CAR-T細(xì)胞療法。CAR-T細(xì)胞療法不僅可以降低耐藥患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，還可以提高疾病緩解率[22]，在血液惡性腫瘤治療中具有良好的應(yīng)用前景[23-24]。另外，使用氟達(dá)拉濱（fludarabine，F(xiàn)DR）及馬磷酰胺（mafosfamide，MFA）改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的方法可以誘導(dǎo)CAR-T-19細(xì)胞早期凋亡，這一機(jī)制奠定了化療藥物抑制CAR-T-19細(xì)胞作用的理論基礎(chǔ)[25]。

3.3 CAR-T細(xì)胞在其他腫瘤中的應(yīng)用

CAR-T細(xì)胞作為個(gè)體化的“活藥物”，在白血病和淋巴瘤治療中抗腫瘤效果顯著[5]。除此之外，結(jié)合過(guò)繼性免疫治療的優(yōu)勢(shì)，有學(xué)者提出卵巢癌臨床治療的新方法和新策略。通過(guò)對(duì)人外周血單核細(xì)胞的感染，制備穩(wěn)定表達(dá)的CAR-T細(xì)胞，使用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)卵巢癌樣本及細(xì)胞系中間皮素（mesothelin，MSLN）表達(dá)及CAR-T細(xì)胞對(duì)MSLN陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞的殺傷能力?？筂SLN CAR-T細(xì)胞可以特異、有效、安全地殺滅卵巢癌細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)[26]。

盡管實(shí)體瘤治療中CAR-T細(xì)胞療法尚未納入臨床試驗(yàn)，但在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中獲得令人滿意的抗腫瘤效果，如Wing等[27]將溶瘤病毒與過(guò)繼性CAR-T細(xì)胞結(jié)合，提高了小鼠腫瘤模型的抗腫瘤效果，延長(zhǎng)了其存活率，克服了CAR-T細(xì)胞作為實(shí)體瘤中單一療法的關(guān)鍵限制。在通過(guò)異種膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤模型檢測(cè)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor typeⅢ variant，EGFRvⅢ）的CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷活性的研究中，體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，靶向EGFRvⅢ的CAR-T細(xì)胞組腫瘤體積在注射后3周與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）陽(yáng)性T細(xì)胞組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）[28]。在CAR-T細(xì)胞中，自然殺傷受體2D可以促進(jìn)諸多細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而使卵巢癌細(xì)胞被溶解[29]。除此之外，在肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及肝癌中，CAR-T細(xì)胞亦起到一定的抗腫瘤效果。

自首次報(bào)道CAR-T細(xì)胞起，它主要用于治療肝硬化所致的腹腔積液。此外，CAR-T細(xì)胞也可以安全地應(yīng)用于惡性腫瘤所致的腹腔積液。雖然尚無(wú)相關(guān)的證據(jù)，但CAR-T細(xì)胞可以作為一種治療頑固性腹腔積液的預(yù)期策略[30]。Kawada等[31]對(duì)1例確診胃癌[M，3型，cT4a（SE），cN0，cH0，cP1，cM1，C期Ⅳ]的患者進(jìn)行CAR-T姑息治療，隨后是FLAST方案（5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸聯(lián)合紫杉醇）化療。經(jīng)8個(gè)療程治療，無(wú)并發(fā)癥發(fā)生，癥狀改善。患者最終生存時(shí)間約18個(gè)月，并可長(zhǎng)期攝取正常飲食。

4 關(guān)于CAR-T細(xì)胞安全性的分析

4.1 細(xì)胞因子風(fēng)暴

隨著不斷積累臨床應(yīng)用強(qiáng)效免疫治療劑的經(jīng)驗(yàn)，人們逐漸意識(shí)到其內(nèi)在固有和潛在致命的不良反應(yīng)，最嚴(yán)重的是細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS）[32]。CAR-T 細(xì)胞大量輸注后，通過(guò)抗原的刺激，能夠分泌大量的細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴[33]，進(jìn)而引起多器官功能衰竭與急性呼吸窘迫綜合征。由此可見(jiàn)，多次且小劑量地輸注CAR-T細(xì)胞具有重要意義，明確最安全且有效的CAR-T細(xì)胞的劑量可作為臨床工作的重點(diǎn)。

4.2 免疫排斥反應(yīng)

目前CAR-T細(xì)胞使用的scFv基本來(lái)源于鼠源性單克隆抗體。人源化單克隆抗體的制備可通過(guò)基因工程進(jìn)行，并且其于CAR-T細(xì)胞外區(qū)整合可以減少不良反應(yīng)。因此，人源化單克隆抗體的引入將使CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用范圍再次擴(kuò)大。

4.3 脫靶效應(yīng)

CAR定向的靶抗原在正常組織中有不同程度的表達(dá)，因此CAR-T細(xì)胞與此類抗原結(jié)合會(huì)攻擊正常組織[34]，造成免疫缺陷或者組織損傷。因此，建立CAR-T細(xì)胞識(shí)別靶抗原，可以使腫瘤靶向性得到提高，進(jìn)而避免正常組織的損傷。

4.4 CAR-T細(xì)胞歸宿

如果CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)期存在于體外而無(wú)法被清除，則會(huì)影響機(jī)體正常免疫應(yīng)答反應(yīng)。于CAR-T細(xì)胞中整合caspase 9自殺基因，對(duì)其激活并進(jìn)行調(diào)控，可以有效清除CAR-T細(xì)胞。但是也有如單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）會(huì)自身激活，造成CAR-T細(xì)胞的消耗并影響其殺傷腫瘤細(xì)胞的效果[24]。Fas分子和DR5通路是通過(guò)結(jié)合Fas-Fc和DR5-Fc重組蛋白阻斷體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞起主導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[35]。

5 小結(jié)

目前CAR-T細(xì)胞在治療某些血液腫瘤時(shí)可以起到一定的效果，但在實(shí)體瘤治療方面還有待提升。隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的積累及CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)的逐漸優(yōu)化，CAR-T細(xì)胞治療的安全性可能獲得有效解決，其有望成為高效、安全的腫瘤治療方法，未來(lái)有望與化療及放療有效結(jié)合，使患者的預(yù)后得到最大程度的改善。