核酸適配體分子信標(biāo)探針在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展△

黃晨，李婉明

中國醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點實驗室/醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教育部重點實驗室/細(xì)胞生物學(xué)教研室，沈陽110122

分子信標(biāo)在1996年由Tyaqi和Kramer[1]首次報道，有特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，是一種新型熒光探針，具有背景信號低、操作簡單、特異性識別強(qiáng)、靈敏度高，以及無需與未反應(yīng)的探針分離即可實時檢測等特點，因此近年來被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的眾多領(lǐng)域[2]。隨著分子信標(biāo)技術(shù)的發(fā)展和成熟，研究者已發(fā)展出多種新型分子信標(biāo)，使分子信標(biāo)的應(yīng)用不再受限于核酸分子的雜交檢測[3]。核酸適配體是可以折疊成明確三維結(jié)構(gòu)并通過空間構(gòu)型互補(bǔ)與靶分子結(jié)合的一段短的單鏈寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），于1990年被Ellington和Szostak[4]與 Tuerk和Gold[5]首次利用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得，因其具有靶分子廣泛、特異性及親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、變性復(fù)性快速可逆、易于化學(xué)修飾和標(biāo)記等諸多優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注并顯示出良好的應(yīng)用前景[6-7]。本文對基于核酸適配體的分子信標(biāo)探針在腫瘤研究中的進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

1 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)和原理

分子信標(biāo)是一種特殊設(shè)計的具有莖-環(huán)（loopstem）結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其中環(huán)部是目標(biāo)識別區(qū)，通常由25～35個堿基組成；莖部由5～8個堿基互補(bǔ)序列組成，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別共價的連接在莖部的兩個末端。當(dāng)目標(biāo)分子不存在時，兩側(cè)堿基配對形成雙螺旋，使分子信標(biāo)呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，繼而使分別修飾在5'末端的熒光基團(tuán)和3'末端的淬滅基團(tuán)相互接近，二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（直接能量轉(zhuǎn)移或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移），熒光幾乎被淬滅。當(dāng)目標(biāo)存在時，分子信標(biāo)的環(huán)部與目標(biāo)結(jié)合，分子間強(qiáng)雜交作用力打開莖部螺旋，導(dǎo)致分子信標(biāo)的構(gòu)象改變，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止，熒光基團(tuán)恢復(fù)熒光，且熒光強(qiáng)度與目標(biāo)濃度呈正比[8]。但是，因為分子信標(biāo)是一段核苷酸序列，易被核酸酶分解且容易與單鏈DNA結(jié)合蛋白非特異性結(jié)合，限制了其在臨床生物學(xué)中的應(yīng)用[9-10]。因此，設(shè)計生物穩(wěn)定性和特異性高的分子信標(biāo)，使其更好地應(yīng)用于臨床，具有重要的意義。

2 核酸適配體的結(jié)構(gòu)和原理

核酸適配體是通過SELEX從隨機(jī)寡核苷酸庫中篩選出來的，能與靶點特異性結(jié)合的寡核苷酸（DNA或RNA）序列。核酸適配體的靶點類型非常廣泛，包括酶、核苷酸、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、多肽、氨基酸、抗生素、有機(jī)染料及重金屬離子，甚至完整的病毒和病原體以及完整的細(xì)胞[11]。核酸適配體本質(zhì)上是由一段單鏈核酸分子折疊成的特殊三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾（hairpin）、內(nèi)環(huán)（internal loops）、假結(jié)（pseudoknot）、凸環(huán)（bulge）、G-四聚體（G-tetramer）等，與靶點高親和力、高特異性結(jié)合[12]，被稱為“化學(xué)抗體”。與蛋白抗體相比，核酸適配體具有親和力及特異性高、合成簡單、相對分子質(zhì)量低、化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高、不良反應(yīng)少、免疫原性低和便于修飾多種功能基團(tuán)或材料等優(yōu)點[13-14]。利用核酸適配體的分子識別特性，可設(shè)計多種針對不同類型靶點的核酸適配體分子探針，極大地擴(kuò)展了核酸探針在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

3 核酸適配體分子信標(biāo)探針的設(shè)計

核酸適配體分子信標(biāo)是將核酸適配體和分子信標(biāo)結(jié)合起來的一種新型分子信標(biāo)，其在分子信標(biāo)的基礎(chǔ)上，對核酸適配體進(jìn)行合適的剪切、延長和合并，使核酸適配體融合到分子信標(biāo)中，從而完成高效熒光探針的設(shè)計，它的出現(xiàn)極大地擴(kuò)展了檢測目標(biāo)的范圍并提高了檢測的靈敏度[15-16]。核酸適配體分子信標(biāo)的莖、環(huán)部分是由某種待檢測物的核酸適配體構(gòu)成。核酸適配體在分子信標(biāo)的設(shè)計中作為識別單元，結(jié)構(gòu)靈活，與靶點作用后其結(jié)構(gòu)可發(fā)生改變或重構(gòu)，是實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的理想選擇[17]。這類分子信標(biāo)的優(yōu)點首先在于只要篩選出目標(biāo)物的核酸適配體，就可以設(shè)計出相應(yīng)的分子信標(biāo)并對其進(jìn)行檢測；其次，核酸適配體的靶點類型廣泛，以其為基礎(chǔ)設(shè)計的分子信標(biāo)的應(yīng)用范圍也廣泛，在各領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景；最后，核酸適配體對靶點具有高親和力與高特異性，因此可以明顯提高被檢測靶點的靈敏度和選擇性。Hamaguchi等[18]通過延長核酸適配體的一端使其自雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一種靶向凝血酶的檢測下限可達(dá)10 nmol/L的核酸適配體分子信標(biāo)探針。Yamamoto等[19]發(fā)展了一種“拆分型”的核酸適配體分子信標(biāo)探針，當(dāng)目標(biāo)蛋白的濃度為200 nmol/L時，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約14倍，可實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的高靈敏檢測。

4 核酸適配體分子信標(biāo)探針在腫瘤中的應(yīng)用

近年來，SELEX篩選技術(shù)不斷發(fā)展和完善，逐步篩選出越來越多的核酸適配體，核酸適配體分子信標(biāo)探針為生物成像領(lǐng)域，尤其是腫瘤領(lǐng)域的發(fā)展提供了大量性能優(yōu)異的分子研究工具。

4.1 體內(nèi)核酸的分析和檢測

細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的表達(dá)水平和亞細(xì)胞分布可以很好地反映生物體內(nèi)的遺傳程序和應(yīng)激反應(yīng)，對細(xì)胞內(nèi)mRNA的監(jiān)測和檢測可為生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷及治療、藥物開發(fā)等提供有價值的信息[20]。經(jīng)典的分子信標(biāo)是一種性能優(yōu)異的核酸分子檢測工具，但是分子信標(biāo)本質(zhì)上也是核酸，作為一種帶負(fù)電荷的親水性生物大分子，難以跨越同樣帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，很大程度上限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用[21]。某些功能性核酸適配體具有細(xì)胞特異性內(nèi)化功能，可作為靶向腫瘤細(xì)胞的輸送載體，以其為基礎(chǔ)設(shè)計的分子信標(biāo)探針，可實現(xiàn)活細(xì)胞的靶向穿膜[22]。Qiu等[23]將靶向核仁素的核酸適配體SA1411作為靶向輸送內(nèi)化載體，成功地將分子信標(biāo)高效地輸送到乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并利用光照調(diào)控，既控制了分子信標(biāo)的細(xì)胞內(nèi)化功能，又實現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶點mRNA的高時空監(jiān)測和追蹤。Ying等[24]設(shè)計了一種新型Light-up RNA適配體傳感器，成功用于活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞微小RNA（microRNA）的定量檢測，實現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的可視化和高靈敏檢測，這為其在腫瘤細(xì)胞中功能的闡明提供了可能性。

4.2 蛋白質(zhì)的檢測

核酸適配體具有與靶點結(jié)合力強(qiáng)、特異性高、可體外合成、易功能修飾等諸多優(yōu)點，在一定程度上彌補(bǔ)了抗體技術(shù)的不足。目前，運用SELEX已篩選出多種靶向蛋白質(zhì)的核酸適配體，大部分為腫瘤相關(guān)標(biāo)志物，并被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床診療[25]。利用核酸適配體的特性，無需分離洗脫樣品就可以快速、實時測定組分中的靶蛋白，這使其在腫瘤的早期診斷、臨床用藥等方面具有更重要的應(yīng)用價值。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）是一種具有誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成以及直接或間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移的促血管生長因子。Yang等[26]設(shè)計了芘標(biāo)記的核酸適配體分子信標(biāo)探針，并對PDGF進(jìn)行檢測，此探針在細(xì)胞培養(yǎng)基中對PDGF的檢測極限可達(dá)10-12mol/L級，可有效減少復(fù)雜基質(zhì)中背景信號的干擾。Zhao等[27]也設(shè)計了一種靶向PDGF的核酸適配體分子信標(biāo)探針，當(dāng)探針結(jié)合PDGF時，核酸適配體發(fā)生構(gòu)象改變，因其熒光基團(tuán)相互靠近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生熒光信號。將探針固定在間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，實現(xiàn)了對外加的或相鄰細(xì)胞分泌的PDGF高時空分辨的定量檢測，并可在單細(xì)胞水平上對細(xì)胞遷移進(jìn)行實時監(jiān)測。

4.3 腫瘤細(xì)胞的成像

以完整活細(xì)胞為靶點的cell-SELEX篩選出的核酸適配體可直接用于靶細(xì)胞的識別，這為腫瘤的診斷和治療提供了頗有潛力的分子識別成像探針[28]。Shi等[29]設(shè)計了一種可激活的核酸適配體分子信標(biāo)探針（activatable aptamer probe，APP），用于靶向活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的可視化檢測。APP處于靜止?fàn)顟B(tài)時，所帶熒光基團(tuán)被淬滅；當(dāng)其結(jié)合靶點腫瘤細(xì)胞時，APP構(gòu)象發(fā)生改變，熒光基團(tuán)被釋放，熒光被恢復(fù)。以核酸適配體sgc8為基礎(chǔ)設(shè)計的APP，在200μl的樣品中實現(xiàn)了118例人急性淋巴白血病細(xì)胞（CCRF-CEM細(xì)胞）的檢出下限，有效地提高了腫瘤細(xì)胞檢測的靈敏度，為提高腫瘤早期診斷的準(zhǔn)確性提供了新方法；APP成功用于活體成像，有效減少了非靶組織部位的背景信號，并縮短診斷時間至15 min，顯示出良好的靶細(xì)胞組織特異性。

及時進(jìn)行腫瘤的診斷和腫瘤進(jìn)展的監(jiān)測具有重要的臨床意義，尤其是對循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的監(jiān)測分析。Hwang等[30]設(shè)計了一種基于量子點（quantum dot，QD）同時靶向上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和黏蛋白 1（mucin1，muc1）（QD-EpCAM/muc1）的核酸適配體分子信標(biāo)探針，用于CTC的檢測分析。在EpCAM/muc1不存在的情況下，該分子信標(biāo)形成部分雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)并保持淬滅狀態(tài)；在EpCAM/muc1與各核酸適配體結(jié)合時，觸發(fā)分子信標(biāo)構(gòu)象改變，并釋放綠/紅熒光信號。QD-Ep-CAM/muc1核酸適配體分子信標(biāo)探針成功地用于體外和體內(nèi)EpCAM/muc1的監(jiān)測和成像，為CTC的診斷提供選擇性和特異性更高的分子工具。

5 小結(jié)與展望

核酸適配體作為“化學(xué)抗體”，具有獨特的優(yōu)勢，其作為熒光分子探針在生化分析和生物成像領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，但其應(yīng)用研究仍處于初級階段，還有許多問題需要解決：①核酸適配體的篩選方法比較繁瑣、耗時，目前被篩選出的核酸適配體數(shù)量非常有限，在一定程度上制約了核酸適配體的應(yīng)用，急需開發(fā)更有效的篩選方法；②核酸適配體與靶點的結(jié)合信號模式，在一定程度上限制了檢測的靈敏度；③體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境體系以及核酸適配體容易被核酸酶降解等因素極大地限制了核酸適配體分子信標(biāo)在體內(nèi)的應(yīng)用。目前核酸適配體分子信標(biāo)的應(yīng)用大部分仍然停留于基礎(chǔ)研究階段，且主要集中于常用的核酸適配體的研究，實際應(yīng)用遠(yuǎn)不及蛋白抗體的普及。因此，如何克服以上局限性，進(jìn)一步拓展核酸適配體分子信標(biāo)在生命科學(xué)領(lǐng)域，特別是腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用，需要科學(xué)工作者不斷努力和突破。相信隨著核酸適配體的發(fā)展，越來越多與不同靶點特異性結(jié)合的核酸適配體將被篩選出來，基于核酸適配體的分子信標(biāo)將在生命科學(xué)領(lǐng)域得到進(jìn)一步的發(fā)展。