呼出氣分析在胃癌篩查和診斷中的研究進(jìn)展

李琦,郭雷,李恩有

根據(jù)中國2015年的癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌的發(fā)病率和病死率在男性中均位居第二，在女性中分別位于第三位和第二位，成為僅次于肺癌的嚴(yán)重威脅中國人健康的重大疾病[1]。臨床上目前最常用的診斷胃癌的方法有X線鋇餐、磁共振成像(MRI)、纖維胃鏡以及血清腫瘤標(biāo)志物等[2]，還沒有相對操作簡單且特異性高的篩查方法，因其發(fā)病也十分隱匿，在臨床工作中許多病人對于侵入性內(nèi)鏡活檢存在恐懼而拒絕接受檢查，因此胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)，因此尋求一種行之有效且能普遍應(yīng)用的篩查技術(shù)來進(jìn)行胃癌高危人群的定期普查已成為臨床的迫切需求。

近年來，呼出氣分析提供了一種潛在的無創(chuàng)性疾病診斷工具的可能，且具有易于操作、病人依從性高等優(yōu)點(diǎn)，可提供一個(gè)窺視人體新陳代謝的 “窗口”。1972年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Teranishi首次提出呼出氣體中含有250余種可揮發(fā)的有機(jī)化合物[3]。在隨后的30年中，由于科技進(jìn)步以及各種分析儀器的發(fā)明，研究者們開始對呼出氣中揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行定性、定量分析。

目前，被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的呼氣測試如下，即(1)呼氣中乙醇濃度的檢測:用于法律實(shí)施。(2)呼氣中的氫檢測:用于分析人體中碳水化合物的代謝情況。(3)監(jiān)測呼氣中一氧化氮(NO)濃度:用于識(shí)別哮喘。(4)13C-尿素呼氣試驗(yàn):臨床上作為診斷感染幽門螺桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)之一，也是根除幽門螺桿菌治療后復(fù)查的首選方法。(5)呼氣中支鏈飽和烴類物質(zhì)的種類和濃度分析:用于檢測心臟移植手術(shù)中的排異反應(yīng)的程度。

臨床醫(yī)生一直在試圖建立一個(gè)能夠聯(lián)系呼出氣與重要腫瘤疾病的診斷關(guān)系，關(guān)于癌癥呼出氣揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)產(chǎn)生的病理生理過程，目前有假說認(rèn)為呼出氣VOCs改變是基于腫瘤細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸影響細(xì)胞氧化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因/蛋白突變以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加，進(jìn)而產(chǎn)生了新的揮發(fā)性有機(jī)物或引起正常揮發(fā)性有機(jī)物含量改變[4-6]。目前已經(jīng)成功的在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌等[7-9]疾病中發(fā)現(xiàn)了特異的呼出氣VOCs腫瘤標(biāo)志物，以色列的科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)呼出氣可以診斷17種癌癥[10]，這一研究成果已經(jīng)引起國際科技領(lǐng)域廣泛關(guān)注，這其中也包括胃癌，現(xiàn)于2017年7月將胃癌呼出氣診斷的國內(nèi)外研究進(jìn)展做一綜述，以期為呼出氣早期篩查和診斷胃癌提供更多的參考依據(jù)。

1 在胃癌病人呼出氣中檢測VOCs

由于VOCs分析技術(shù)、采樣方式、不同臨床環(huán)境下樣品的差異、混雜因素、生理因素等諸多因素的影響[11]，目前還沒有可以用于標(biāo)準(zhǔn)化臨床診斷或篩查癌癥的呼出氣檢測?，F(xiàn)就不同分析方法分組介紹胃癌呼出氣VOCs的研究。

1.1 氣相色譜--質(zhì)譜聯(lián)用儀分析胃癌呼出氣VOCs氣相色譜--質(zhì)譜聯(lián)用儀即GC-MS，呼出氣中的揮發(fā)性有機(jī)物經(jīng)過色譜高效分離后進(jìn)入質(zhì)譜后可以進(jìn)行識(shí)別和量化。GC-MS可以全面、準(zhǔn)確地分析呼出氣包括其中未知的VOCs，廣泛應(yīng)用于呼出氣研究中，但有昂貴、費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、便攜性差等缺點(diǎn)，這可能在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生困難。

Ligor等[12]使用固相微萃取(SPME)GC-MS法對3例胃癌組織細(xì)胞的頂空VOCs、3例胃癌病人和7例正常健康人的呼出氣VOCs進(jìn)行分析，檢測到丙酮、二硫化碳、異丙醇、乙醇和乙酸乙酯這幾種VOCs，認(rèn)為這些化合物是人體內(nèi)源性產(chǎn)物。

丁露等[13]使用SPME GC-MS法對37例胃癌病人、32例正常健康人進(jìn)行呼出氣分析，發(fā)現(xiàn)丙烯腈(濃度范圍14.72 ～594.29 ng/L)和甲基環(huán)己烷(濃度范圍9.20～970.89 ng/L)可以作為胃癌潛在的呼出氣揮發(fā)性標(biāo)志物。

還有研究者使用SPME GC-MS法對30例胃癌病人、20例健康人進(jìn)行呼出氣分析，發(fā)現(xiàn)己醛、5-乙基-5甲基-葵烷、壬烷僅在胃癌病人呼出氣中可檢測。同時(shí)，胃癌病人呼出氣中乙醇、丙酮、己醇、薄荷醇的相對含量明顯高于健康對照組，且呼出氣異戊二烯的濃度低于健康對照組，而在Xu等[14]使用納米傳感器分析，呼出氣異戊二烯在胃癌病人組中明顯升高，兩組研究者得出了不同結(jié)論，值得進(jìn)一步研究。

1.2 傳感器陣列分析胃癌呼出氣VOCs傳感器陣列是將納米材料或各種不同金屬、化學(xué)物質(zhì)和傳感器相結(jié)合形成一個(gè)氣體探測器來實(shí)現(xiàn)呼出氣分析，它通過識(shí)別特定呼出氣VOCs組合來進(jìn)行疾病診斷[16]。傳感器陣列易于操作、方便快捷、臨床應(yīng)用前景大，但其缺點(diǎn)是不能分析未知呼出氣揮發(fā)性有機(jī)物，且不能定量[15-16]。

Xu等[14]研究了基于納米材料的呼吸試驗(yàn)來鑒別胃癌和胃良性病變，他們使用GC-MS法以及納米傳感器法對130例胃部疾病病人的呼出氣樣本進(jìn)行檢測并采用判別因子分析(DFA)模式識(shí)別建立預(yù)測模型。結(jié)果顯示呼出氣可以區(qū)分各組亞群：胃癌與胃部良性病變靈敏度89%、特異性90%、準(zhǔn)確性90%，早期 (Ⅰ期和Ⅱ期)與晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)胃癌靈敏度89%、特異性94%、準(zhǔn)確性91%，且混雜因素不敏感。呼出氣化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了5種揮發(fā)性有機(jī)物(2-丙烯腈、2-丁氧基乙醇、糠醛、甲基庚烯酮和異戊二烯)在胃癌以及消化性潰瘍病人中明顯升高，可以作為胃癌呼出氣的生物標(biāo)志物。之后Amal等[17]進(jìn)行了進(jìn)一步研究，收集來自484例病人的968個(gè)呼出氣樣本進(jìn)行檢測，使用2種分析方法：GC-MS和與模式識(shí)別相結(jié)合的交叉反應(yīng)納米陣列。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用GC-MS可以在胃癌組和高風(fēng)險(xiǎn)胃癌組(OLGIM Ⅲ～Ⅳ)找到獨(dú)特的呼出氣VOCs組合，在各組間檢測到8種呼出氣VOCs(2-丙烯腈、糠醛、乙二醇丁醚、十六烷、4-甲基辛烷、1,2,3-三甲基苯、α-甲基苯乙烯、2-丁酮)。基于納米材料的呼出氣檢測則可以區(qū)分胃癌與胃黏膜腸上皮化生(OLGIM 0～Ⅳ)，其靈敏度73%、特異性98%、準(zhǔn)確性92%，區(qū)分胃癌與OLGIM 0～Ⅱ的靈敏度為97%、特異性84%、準(zhǔn)確性87%，區(qū)分胃癌與OLGIM Ⅲ～Ⅳ的靈敏度93%、特異性80%、準(zhǔn)確性90%，區(qū)分OLGIMⅠ～Ⅱ與OLGIM Ⅲ～Ⅳ的靈敏度83%、特異性60%、準(zhǔn)確度61%。

Chen等[18]研制了一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)傳感器來檢測胃癌呼出氣中的生物標(biāo)志物。在SERS傳感器中，還原性氧化石墨烯(RGO)可以選擇性地吸附和富集呼出氣中的生物標(biāo)志物，SPME纖維和金納米粒子分散在RGO上使SERS傳感器有效地檢測被吸附的生物標(biāo)志物。14個(gè)與生物標(biāo)志物相關(guān)的拉曼光譜被選為生物標(biāo)志物模式指紋來區(qū)分不同國家的人的呼出氣VOCs。他們應(yīng)用該方法分析了不同的呼出氣標(biāo)本和200例臨床呼出氣樣本：靈敏度83%、特異性92%,也發(fā)現(xiàn)該方法的使用不僅可以進(jìn)行胃癌診斷，更可以對早期胃癌和晚期胃癌進(jìn)行區(qū)分。

學(xué)者們[19]使用金屬氧化物半導(dǎo)體氣體傳感器陣列分析了161例志愿者的呼出氣，其中包括49例胃癌和30例胃潰瘍病人，發(fā)現(xiàn)胃癌病人呼出氣以及胃組織頂空VOCs中的丙酮、二硫化碳、異丙醇、乙醇、乙酸乙酯可以用來診斷胃癌，并采用反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法統(tǒng)計(jì)出準(zhǔn)確性93.00%、靈敏度94.38%和特異性89.93%。

1.3 選擇性離子流管質(zhì)譜分析胃癌呼出氣VOCs選擇性離子流管質(zhì)譜即SIFT-MS，它結(jié)合了流動(dòng)管技術(shù)、化學(xué)電離技術(shù)以及質(zhì)譜來對呼出氣中的VOCs進(jìn)行定性定量分析。SIFT-MS可快速實(shí)時(shí)在線分析[20]，且無須對樣品進(jìn)行吸附解吸。

Kumar等[21]利用SIFT-MS對三組受試者進(jìn)行呼出氣分析：18例胃-食管癌、18例非癌上消化道疾病、17例健康受試者。他們在呼出氣中檢測到17種VOCs，使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種VOCs(己酸、苯酚、甲基酚和乙基苯酚)在癌癥組與其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析4種VOCs組合來區(qū)分食管-胃癌組和對照組，結(jié)果顯示ROC曲線下面積(AUC)為0.91，更加說明了這些VOCs可以作為食管-胃癌潛在的非侵入性生物標(biāo)志物。

該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行進(jìn)一步研究[22]，同樣使用SIFT-MS方法對81例食管胃癌病人(食管癌48例，胃腺癌33例)、129例對照病人(Barrett化生16例，良性上消化道疾病62例，正常健康人51例)進(jìn)行呼出氣分析，發(fā)現(xiàn)了12種VOCs，并認(rèn)為脂肪酸、苯酚和醛類化合物可以作為食管和胃腺癌潛在的生物標(biāo)志物。

2 胃癌呼出氣中檢測冷凝液(EBC)

受試者平靜呼吸，其呼出氣體通過特殊的裝置冷凝后形成液態(tài)，即EBC。據(jù)研究報(bào)道，在EBC中可以檢測到的物質(zhì)高達(dá)數(shù)千種[23-24]，且不斷有新的物質(zhì)被檢測出來，它們主要源于下呼吸道的內(nèi)襯液[25]。通過研究發(fā)現(xiàn)于EBC中尋找肺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，或是多種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用來診斷肺癌，對其篩查、早期診斷、監(jiān)測病情及判斷預(yù)后情況均有著重大的臨床實(shí)用價(jià)值[26-28]。而相比傳統(tǒng)檢測手段，EBC的采集是一個(gè)完全無創(chuàng)的過程，不會(huì)對支氣管黏膜產(chǎn)生傷害，且EBC直接來源于下呼吸道[29]，沒有被稀釋的可能，故而其結(jié)果可信度高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性好，瞬時(shí)可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，且EBC采集技術(shù)適用于任何年齡、任何身體狀況的病人，在臨床上有很好的應(yīng)用前景。

王兵等[30]應(yīng)用 EcoScreen冷凝器采集了66例胃癌病人及60例健康受試者的呼出氣冷凝液，并使用免疫酶法對胃癌呼出氣EBC中的P53蛋白水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：胃癌病人組的呼出氣EBC中P53蛋白水平高于正常對照組(P<0.01)，較之Ⅰ期，Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期的胃癌病人EBC中P53蛋白濃度較高(P<0.05)，胃鱗癌和胃腺癌病人EBC中的P53蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EBC中P53蛋白檢測的靈敏度和特異性分別為42.4%和93.4%，由此得出結(jié)論：檢測胃癌病人EBC中P53蛋白可用于胃癌的輔助診斷及病情監(jiān)測。他們還發(fā)現(xiàn)免疫組化(SP)法檢測胃癌組織P53蛋白與免疫酶法檢測EBC中 P53蛋白這兩種檢測途徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 胃癌呼出氣VOCs的地域差異

Amal等[31]使用GC-MS方法對中國和拉脫維亞共260位病人呼出氣進(jìn)行分析，觀察到中國和拉脫維亞的胃癌病人呼出氣是不同的。在兩個(gè)國家中,受試者呼出氣6-甲基-5-庚烯-2-酮可以區(qū)分胃癌組和健康對照組，呼出氣中芳香族化合物和醇類可以區(qū)分消化性潰瘍組和健康對照組，胃癌組與消化性潰瘍組沒有被區(qū)分開。研究中發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性有機(jī)物的組成可能受到地理、環(huán)境和生活方式的影響，這可能是由于不同種族之間遺傳和營養(yǎng)差異引起個(gè)體之間細(xì)胞氧化速度不同，從而造成VOCs差異，因此建立一個(gè)該地區(qū)人群適用的呼出氣診斷模型是必要的。

4 腸道微生物環(huán)境對胃癌VOCs影響

Leja等[32]使用GC-MS和納米傳感器分析了10例同一個(gè)胃癌病人連續(xù)3 d呼出氣、17例胃癌病人幽門螺桿菌治療前后的呼出氣、61例胃癌病人腸道清洗前后的呼出氣，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)病人3 d內(nèi)呼出氣VOCs是穩(wěn)定的，證明了VOCs分析的可復(fù)性和重現(xiàn)性，α-蒎烯(P=0.028 0)、乙酸乙酯(P=0.030 0)在抗生素應(yīng)用后增加，丙酮在結(jié)腸鏡檢查前腸道準(zhǔn)備后增加(P=0.000 1)，說明抗生素和腸道準(zhǔn)備重建的腸道微生物環(huán)境影響了呼出氣VOCs的結(jié)果。所以需要進(jìn)行更多研究來驗(yàn)證VOCs分析的準(zhǔn)確性。在這些標(biāo)志物成功轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐之前仍需要克服許多挑戰(zhàn),樣品采集和處理的標(biāo)準(zhǔn)化也是臨床研究的關(guān)鍵因素[33]。

綜上所述，目前胃癌呼出氣的研究主要是在GC-MS、傳感器陣列、SIFT-MS、EBC這幾個(gè)方面，國內(nèi)外相關(guān)研究還相對甚少。因此，更多關(guān)于胃癌呼出氣診斷方面的研究需要探索，未來的研究領(lǐng)域包括胃癌呼出氣VOCs可能的生化通路研究，標(biāo)準(zhǔn)化呼吸試驗(yàn)和特定胃部疾病大型多中心人群呼出氣診斷研究。