脂溶性熒光染料測定微生物油脂的研究進(jìn)展*

趙 成 ，陳雪芳 ，熊 蓮 ，郭海軍 ，黃前霖 ，黃 超 ?，陳新德 ?

（1.中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣州 510640；2.中國科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3.廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

0 引 言

微生物油脂[1]是微藻、酵母、真菌、細(xì)菌等微生物在體內(nèi)合成的甘油酯，其組成與植物油脂類似。與植物油脂相比，微生物油脂的生產(chǎn)具有不受氣候、季節(jié)限制，占地少，所需人力較少等優(yōu)勢，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油的理想原料[2-4]。通常，高效篩選高油脂含量菌株是微生物油脂能源化利用的基礎(chǔ)，而如何測量微生物的油脂含量是篩選高油脂含量菌株不可缺少的步驟。目前，傳統(tǒng)氯仿/甲醇重量分析方法是測定微生物油脂含量最常用方法[5-6]，具有準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，然而其分析過程繁瑣，需要消耗大量的時(shí)間，并且還需要消耗大量的有機(jī)溶劑，易造成二次污染等問題。這些缺點(diǎn)在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。因此，開發(fā)快速、環(huán)保的方法用于測定微生物油脂含量對微生物油脂能源化利用具有重要意義。近年來，細(xì)胞熒光法因檢測速度快、準(zhǔn)確（精確到單個(gè)細(xì)胞）、操作簡便、污染少（僅需痕量的熒光染料）等優(yōu)點(diǎn)，在高通量篩選高油脂含量微生物上潛力巨大，備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[7-9]。其中，熒光染料的選擇與應(yīng)用是細(xì)胞熒光法應(yīng)用最為重要的部分，而在眾多染料中，以尼羅紅與4,4-二氟- 1,3,5,7-四甲基-4-硼-3a,4a-二氮雜-s-茚烯（4,4-difluoro- 1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene,BIODIPY 505/515）這兩種脂溶性染料應(yīng)用最為廣泛，是目前微生物油脂定性與定量分析的理想染料。因此，本文以尼羅紅與BODIPY 505/515為例，系統(tǒng)介紹微生物油脂的細(xì)胞熒光分析方法，包括應(yīng)用范圍、發(fā)展歷史、影響因素、存在問題以及未來發(fā)展趨勢等。

1 尼羅紅及其在微生物油脂測定中的應(yīng)用

1.1 尼羅紅的結(jié)構(gòu)及其光學(xué)性質(zhì)

尼羅紅是一種親脂、疏水的非極性惡嗪類熒光染料，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，化學(xué)式和光譜特性如表1所示。尼羅紅易溶于丙酮、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）等有機(jī)溶劑，在水溶液中的溶解度比較低，同時(shí)，會(huì)與水分子發(fā)生相互作用（一般為氫鍵作用）而發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象[10]。此外，尼羅紅分子苯環(huán)上含有羰基等極性取代基，使其對溶劑的極性環(huán)境比較敏感；在不同極性溶劑中，其最大熒光強(qiáng)度差別較大，由于在不同的溶劑中存在不同的化學(xué)鍵作用，染色劑分子會(huì)發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致激發(fā)光譜曲線發(fā)生一定的移動(dòng)（紅移或藍(lán)移），熒光淬滅速率也會(huì)有所不同[11-12]，會(huì)對熒光分析結(jié)果產(chǎn)生一定影響。同時(shí)，當(dāng)溶劑的極性減弱時(shí)，尼羅紅染色劑激發(fā)光譜的峰值會(huì)發(fā)生藍(lán)移，其原因可能是：（1）在激發(fā)光照射時(shí)，尼羅紅分子偶極矩發(fā)生改變，分子發(fā)生熱運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致其光學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化；（2）尼羅紅分子內(nèi)電荷的轉(zhuǎn)移，使得分子的剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致分子表面的活性基團(tuán)發(fā)生改變，進(jìn)而光學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化；（3）在染色過程中，尼羅紅染色劑與細(xì)胞內(nèi)的一些非脂類的疏水性物質(zhì)（例如蛋白質(zhì)等）結(jié)合發(fā)生聚集沉降[13-15]。研究表明，在激發(fā)波長（λex）小于570 nm時(shí)，尼羅紅可選擇性地與細(xì)胞內(nèi)的中性脂質(zhì)結(jié)合，發(fā)出金黃色的熒光；激發(fā)波長（λem）在 570～590 nm 時(shí)，尼羅紅能與細(xì)胞內(nèi)所有脂質(zhì)結(jié)合，發(fā)出橘紅色熒光；而當(dāng)激發(fā)波長大于590 nm時(shí)，尼羅紅則失去對脂質(zhì)的敏感性[16]。由此可以看出，尼羅紅對細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)具有較強(qiáng)的特異性，因而在微生物中性脂質(zhì)的測定時(shí)，激發(fā)波長一般選在570 nm處。

圖1 尼羅紅與BODIPY 505/515染色劑結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of Nile red and BODIPY 505/515

表1 中性脂質(zhì)染色劑尼羅紅和BODIPY 505/515的分子和光譜特性[8]Table 1 Characteristics of Nile red and BODIPY 505/515 for neutral lipid fluorescent dyeing

1.2 尼羅紅熒光分析方法的發(fā)展

尼羅紅熒光分析微生物油脂含量的方法由來已久。早在1985年，F(xiàn)OWLER等[17]從獼猴的身體上提取相應(yīng)的組織細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等對染色后的組織細(xì)胞脂質(zhì)的形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)分布情況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明尼羅紅染色劑比其他疏水性染色劑具有更高的選擇性，可以更清楚地觀察到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布情況。隨后，1987年COOKSEY等[18]以Amphora coffeaeformis、Naviculasp.和Tropidoneissp.等微藻為研究對象，通過一定的方法對微藻細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再經(jīng)尼羅紅熒光染料染色后，并在激發(fā)波長為488～525 nm、發(fā)射波長為 570～600 nm 時(shí)，能觀察到較強(qiáng)的熒光現(xiàn)象，同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)使用熒光分光光度計(jì)測定的熒光強(qiáng)度與通過傳統(tǒng)重量法得到的脂質(zhì)含量存在一定的線性關(guān)系，從而建立了相關(guān)性較好的熒光分析方法。1998年，LEE等[19]研究了微藻Botryococcus brauniiUTEX 572，經(jīng)過一定方法處理后，建立了相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.997的尼羅紅熒光分析方法，這一成果為取代傳統(tǒng)重量分析測定微生物油脂含量奠定了基礎(chǔ)。

20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)除了微藻，如真菌和酵母細(xì)胞等微生物也具有生產(chǎn)微生物油脂能力。因此，利用熒光分析法測量真菌和酵母細(xì)胞類微生物油脂含量得到研究人員的廣泛關(guān)注。2004年，KIMURA等[20]以油脂真菌（Mortierella isabellinaIFO-7884、Mortierella nanaIFO-8794、Mortierellaramannianavar.、angulisporaIFO-8187）和油脂酵母（Lipomyces starkeyiIFO-10381、Rhodosporidium toruloidesIFO-0559、Cryptococcus curvatusIFO-1159）為研究對象，考察了預(yù)處理方法（溫度處理、冷凍處理、電場處理等）和染色條件（染色時(shí)間、細(xì)胞濃度等）對測量結(jié)果的影響規(guī)律，篩選出最優(yōu)操作條件，在最優(yōu)條件下，建立了適用于不同真菌和酵母細(xì)胞并具有較高相關(guān)系數(shù)的熒光分析方法，從而拓展了尼羅紅的熒光分析方法在微生物油脂測定中的應(yīng)用范圍。表2是目前以尼羅紅為染料應(yīng)用于測量不同微生物脂質(zhì)含量的熒光分析方法。由表2可得，對于大多數(shù)微生物，建立的熒光分析方法的相關(guān)系數(shù)大都超過0.8，尤其是Chlorella vulgaris[21]微藻，其線性相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.99，這可能是由于此類微藻的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性比較好，染色劑比較容易進(jìn)入細(xì)胞。

表2 不同溶劑和不同微生物中尼羅紅熒光分析方法的線性關(guān)系比較Table 2 Compared with the correlation of Nile red fluorescenct method for different microbial in different solvent

1.3 尼羅紅熒光分析方法存在的問題及解決方案

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，尼羅紅熒光分析法的開發(fā)和研究取得顯著的成績，解決了許多應(yīng)用難題，并被認(rèn)為是未來最具應(yīng)用前景的微生物油脂測定方法。但其實(shí)際應(yīng)用仍受溶劑、尼羅紅染色劑特異性以及細(xì)胞通透性等因素的影響。

1.3.1 溶劑

如1.1所述，溶劑對熒光分析結(jié)果影響很大。因此，對于不同的微生物細(xì)胞，溶劑的選擇對熒光分析法的可靠性尤為重要。由表2可知在尼羅紅熒光分析中，一般選用丙酮作為溶劑，這是由于尼羅紅較易溶于丙酮，且丙酮分子小、易揮發(fā)，有助于尼羅紅進(jìn)入細(xì)胞，特別是在沒有細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁、細(xì)胞膜較薄的微生物中應(yīng)用較多[27]，而對于那些細(xì)胞壁較厚的微生物一般使用滲透能力比較強(qiáng)的DMSO作為染色劑溶劑。CHEN等[23]在微藻Dunaliella tertiolecta的油脂含量測定中使用DMSO溶劑增加細(xì)胞的通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞。然而，DMSO分子在細(xì)胞懸浮液中對細(xì)胞的完整性破壞要比丙酮大，當(dāng)DMSO的濃度過高時(shí)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度會(huì)顯著降低，這是由于懸浮液中細(xì)胞碎片會(huì)顯著增多，使得染色劑無法與細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合。因此，在尼羅紅熒光分析法過程中，一般先確定細(xì)胞壁的厚度和細(xì)胞膜通透性，對于沒有細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁比較薄的微生物，采用丙酮作為溶劑；而對擁有較厚細(xì)胞壁的微生物則采用DMSO作為染色劑溶劑。

1.3.2 尼羅紅染色劑的特異性

尼羅紅染色劑在細(xì)胞內(nèi)部這個(gè)疏水性的環(huán)境中，除了可以與脂質(zhì)液滴結(jié)合發(fā)出熒光之外，還有可能與疏水環(huán)境中的特定蛋白質(zhì)或其他疏水性物質(zhì)（例如葉綠素等非油脂成分）結(jié)合，同樣可以產(chǎn)生熒光現(xiàn)象[28]；同時(shí)，某些微藻中含有較多色素，在一定的激發(fā)光照射下也會(huì)產(chǎn)生一定的熒光強(qiáng)度，使尼羅紅的熒光分析過程中細(xì)胞的背景熒光值增加，影響熒光分析方法的準(zhǔn)確性和靈敏性。

1.3.3 增強(qiáng)細(xì)胞通透性的措施

在尼羅紅熒光分析方法建立中，熒光淬滅和染色劑的滲透等問題嚴(yán)重阻礙了其進(jìn)一步發(fā)展。對于熒光淬滅問題，一般考慮尋找性能更加穩(wěn)定的染色劑或?qū)θ旧珓┻M(jìn)行改性；而對于染色劑滲透問題，一般使用化學(xué)或物理方法對細(xì)胞進(jìn)行處理，從而增加細(xì)胞通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞。

（1）化學(xué)方法

化學(xué)方法主要是指使用一定百分比的有機(jī)試劑對細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理，其目的是增加細(xì)胞的通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞；同時(shí)，加入一定量的有機(jī)試劑可以增加溶液的疏水性，使染色劑更加穩(wěn)定。目前比較常見的有機(jī)試劑有DMSO、丙酮、乙醇、甘油及乙二胺四乙酸（EDTA）等[26,29]。

DMSO是一種常見的極性有機(jī)溶劑，其對細(xì)胞膜具有較強(qiáng)的親和性，使用一定百分比的DMSO溶液對細(xì)胞進(jìn)行懸浮，不僅可以一定程度上增強(qiáng)細(xì)胞的通透性，加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞，而且可以改變懸浮液的極性，使染色劑在染色過程中淬滅速率減慢，更加有利于細(xì)胞染色。同時(shí)，DMSO屬于體積較小的極性分子，而細(xì)胞膜一般是由磷脂雙分子層組成的，具有流動(dòng)性，根據(jù)滲透原理，DMSO分子可以比較容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，染色劑分子可以隨著DMSO分子一起進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)染色的目的[30]。因此，在一些較厚細(xì)胞壁或者細(xì)胞通透性比較差的細(xì)胞中，使用一定百分比的DMSO對其進(jìn)行懸浮，可以在一定程度上增強(qiáng)染色劑的熒光強(qiáng)度，提高熒光分析方法的準(zhǔn)確性。

丙三醇（甘油），與 DMSO相比其細(xì)胞毒性比較小，與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層等成份相似，根據(jù)相似相溶原理，其可以比較容易滲透進(jìn)入細(xì)胞。PICK等[27]報(bào)道了使用不同百分比的甘油作為細(xì)胞懸浮液，發(fā)現(xiàn)甘油可以顯著增加細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，其效果甚至比DMSO懸浮的效果好。但甘油與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，在染色過程中，染色劑可能會(huì)與甘油結(jié)合，導(dǎo)致熒光背景值增強(qiáng)，會(huì)降低熒光分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。

化學(xué)處理方法可以一定程度上增加細(xì)胞通透性，增強(qiáng)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，但也存在增強(qiáng)染色背景值、不利于細(xì)胞長期保存等問題。

（2）物理方法

物理處理方法一般是通過改變外界條件，對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理來增加細(xì)胞的通透性，使染色劑更加容易進(jìn)入細(xì)胞。主要包括熱處理法、凍干法、微波法、電場法、超聲法等。

①熱處理法是在一定的溫度范圍內(nèi)（30～70℃）對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行水浴加熱處理，使得懸浮液中細(xì)胞的活性降低，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減緩，從而使染色劑與細(xì)胞的接觸時(shí)間更長，更加容易進(jìn)入細(xì)胞，所得熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)[31]。但由于不同細(xì)胞的耐溫性不同，因此，對于不同的細(xì)胞，在保證細(xì)胞不失活的前提下，最大限度地加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞，選擇合適的溫度進(jìn)行處理對熒光分析方法的建立至關(guān)重要。

②冷凍干燥法，即先對細(xì)胞進(jìn)行凍干，然后磨碎，測定其熒光強(qiáng)度的一種方法。由于測定過程中不存在細(xì)胞懸浮，可以在一定程度上減少環(huán)境中熒光產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)[21]，此外，也有人在液氮保護(hù)下進(jìn)行研磨，這種方法得到的微生物菌體，避免了在研磨過程中菌體結(jié)構(gòu)和內(nèi)部脂質(zhì)液滴的破環(huán)，對測定菌體粉末中的脂質(zhì)含量具有一定的意義。冷凍干燥處理主要應(yīng)用于一些需要長期保存的細(xì)胞樣品中。

③微波處理方法。微波具有較強(qiáng)的穿透能力，可以改變細(xì)胞膜的孔通透性，從而加快染色劑進(jìn)入細(xì)胞。微波處理后，分子內(nèi)的熱運(yùn)動(dòng)加快，染色劑迅速進(jìn)入細(xì)胞，從而增加染色效果。但微波處理也很容易導(dǎo)致細(xì)胞被擊穿而失活，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性比較差等問題[32]。

④電場處理。細(xì)胞在電場力的作用下會(huì)加速自我旋轉(zhuǎn)，增加細(xì)胞與染色劑的接觸機(jī)會(huì)；同時(shí)，在電場作用下，染色劑分子在溶液中的擴(kuò)散更快，更加容易進(jìn)入細(xì)胞[33]。

與化學(xué)方法相比，物理處理方法條件比較容易控制，相對比較穩(wěn)定，操作比較簡單，同時(shí)，使用物理方法對環(huán)境的污染比較小，有利于可持續(xù)發(fā)展。但在使用物理方法處理細(xì)胞懸浮液時(shí)，也存在其處理強(qiáng)度難以控制，容易導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡等問題。

2 BODIPY 505/515及其在微生物油脂測定中的應(yīng)用

2.1 BODIPY 505/515的結(jié)構(gòu)及其光學(xué)性質(zhì)

BODIPY 505/515結(jié)構(gòu)式與分子式分別如圖1和表1所示。與尼羅紅相比，BODIPY 505/515具有較高的熒光量子產(chǎn)率和較好的摩爾消光系數(shù)，同時(shí)，對 pH和極性環(huán)境的變化不敏感，熒光強(qiáng)度比較穩(wěn)定，也具有相對較強(qiáng)的發(fā)射峰，在不同的激發(fā)/發(fā)射波長下，其熒光基團(tuán)對蛋白質(zhì)、DNA等具有一定的熒光最大值，通常應(yīng)用于細(xì)胞脂質(zhì)分析中。在熒光分析細(xì)胞脂質(zhì)中，BODIPY 505/515具有較強(qiáng)的特異性，一般不與細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)液滴結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)色素等物質(zhì)對其干擾也比較小，可用于細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)液滴可視化觀察（圖2）[28,34]。由圖2可以清楚地看出BODIPY 505/515熒光探針進(jìn)入微藻細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)結(jié)合，在一定的激發(fā)光照射下，產(chǎn)生較強(qiáng)的綠色熒光，同時(shí)與尼羅紅染色劑相比，在可視化觀察細(xì)胞脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，綠色熒光更加明顯地分布在細(xì)胞的某些位置，說明BODIPY 505/515染色劑對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)具有較強(qiáng)的選擇性。

圖2 不同微藻C.vulgaris和D. primolecta在尼羅紅和BODIPY染色下的熒光顯微照片：C. vulgaris微藻在BODIPY（a）和尼羅紅（b）染色劑染色； D. primolecta微藻在BODIPY（c）和尼羅紅（d）染色劑染色[5]Fig.2 Differential interference contrast (DIC) images of C.vulgaris, D. primolecta,respectively stained with BODIPY and Nile red: C. vulgaris stained with BODIPY (a) and Nile red (b);D. primolecta stained with BODIPY (c) and Nile red (d)

2.2 BODIPY 505/515熒光分析方法的發(fā)展和應(yīng)用

BODIPY 505/515分子量較小，化學(xué)結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)比尼羅紅穩(wěn)定，容易與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)相融合，對細(xì)胞的滲透能力較強(qiáng)，更容易進(jìn)入細(xì)胞。如表3所示，在微生物熒光分析方法中，BODIPY 505/515一般溶解在DMSO中，對不同的微生物細(xì)胞進(jìn)行熒光分析時(shí)，其激發(fā)波長存在一定差異。BODIPY 505/515熒光染色劑雖然發(fā)展歷史不長，但已有許多關(guān)于其在不同微生物中應(yīng)用的報(bào)道。2012年，GOVENDER等[28]和BRENNAN等[34]幾乎同時(shí)提出了BODIPY 505/515熒光染料在微生物油脂測定方面的應(yīng)用。GOVENDER以微藻ChlorellavulgarisCCAP 211/1113和Dunaliella primolecta11/34為研究對象，比較了尼羅紅和BODIPY 505/515染色劑對細(xì)胞的可視化觀察，發(fā)現(xiàn)BODIPY 505/515染色劑在細(xì)胞中的熒光更加穩(wěn)定，選擇性更強(qiáng)，可以更加清楚的觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴。隨后，BRENNAN等研究了Nanno chloropsis oculata等微藻，主要探究了不同溶劑對BODIPY 505/515熒光探針的染色效果，發(fā)現(xiàn)BODIOY 505/515在DMSO中的效果最好，該結(jié)果對后續(xù)的研究具有重要借鑒意義。2010年，COOPER等[35]研究一些較大體積的微藻，例如儲(chǔ)油微藻Ophiocytiummaius Naegeli Xanthophyceae、細(xì)長的單細(xì)胞微藻Chrysochromulinasp. Haptophyceae、MallomonassplendensSynurophyceae等，發(fā)現(xiàn)BODIPY 505/515熒光探針可以輕易地滲透進(jìn)入各種不同微藻細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴結(jié)合，產(chǎn)生較穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度，在熒光顯微鏡下，可以清楚地觀察到微藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液滴的分布。目前，BODIPY 505/515染色劑一般應(yīng)用于微藻細(xì)胞的研究，在酵母細(xì)胞、真菌等其他微生物中的研究還比較少，有待進(jìn)一步探究。

表3 BODIPY 505/515熒光探針的溶劑種類和激發(fā)波長Table 3 The solvent and excitation wavelength of fluorescence dye BODIPY505/515

2.3 BODIPY 505/515熒光分析方法存在問題

與尼羅紅相比，BODIPY 505/515主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)等其他疏水性物質(zhì)的可視化觀察，在熒光分析方法建立方面應(yīng)用較少。這是由于BODIPY 505/515熒光染色劑在溶液中比較穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞后其熒光淬滅比較慢，可以比較方便地應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布的觀察，但其在溶液中的熒光背景值比較強(qiáng)，建立的熒光分析方法的靈敏性比較差。除此之外，BODIPY 505/515還存在染色劑滲透問題、細(xì)胞內(nèi)熒光淬滅問題、溶劑選擇問題等。

（1）熒光背景問題。隨著對 BODIPY 505/515熒光探針研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)其溶解在有機(jī)溶劑中時(shí)，雖然可以較快速地進(jìn)入細(xì)胞、比較清晰地觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，但在熒光分析方法的線性建立過程中，細(xì)胞的脂質(zhì)含量與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系比較弱（低于尼羅紅染色劑的線性關(guān)系），主要原因是BODIPY 505/515熒光探針對溶劑的極性變化不敏感，導(dǎo)致在細(xì)胞懸浮液中其熒光背景值比較強(qiáng)[8]。

（2）滲透問題。BODIPY 505/515的分子量比尼羅紅的分子量?。ū?），分子結(jié)構(gòu)更加對稱（圖1），同時(shí)，其分子較高的油/水分配系數(shù)導(dǎo)致染色劑分子可以很輕松地通過細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[34]。一些細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較簡單的微藻細(xì)胞（例如Chrysochromulinasp、Mallomonas splendens[35]等）有較快的滲透性，在熒光顯微鏡中可以較清楚地看出染色劑進(jìn)入細(xì)胞。但在一些細(xì)胞壁較厚或細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的微藻Nannochloropsisoculata[34]觀察時(shí)，BODIPY 505/515則比較難進(jìn)入微藻細(xì)胞，同時(shí)滲透率也比較低，因此，采用相應(yīng)的方法提高細(xì)胞通透性是必要的。

（3）細(xì)胞染色過程中熒光強(qiáng)度衰退問題。熒光衰退現(xiàn)象是熒光探針分析方法普遍存在的問題。在染色的過程中，由于熒光染色劑分子在一定的激發(fā)光照射下，分子內(nèi)部發(fā)生相互作用，分子的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度衰退；同時(shí)，熒光探針與脂質(zhì)特異性結(jié)合，分子間發(fā)生一定的鍵反應(yīng)，生成相應(yīng)的聚集體，導(dǎo)致染色劑熒光強(qiáng)度衰退[27]。

（4）溶劑問題。DMSO、丙酮等有機(jī)溶劑可以增大 BODIPY 505/515的熒光強(qiáng)度，但這些有機(jī)試劑對細(xì)胞的生長具有一定的毒性，在實(shí)驗(yàn)過程中，有機(jī)試劑的濃度過高會(huì)導(dǎo)致測定細(xì)胞死亡[9]。因此，已有的研究中，一般選用低濃度的DMSO作為BODIPY 505/515的溶劑（表3）。

（5）培養(yǎng)液中其他成分的干擾。在分析樣品的預(yù)處理過程中，由于一些微生物如微藻等，其培養(yǎng)液中可能存在其他一些未知的生長習(xí)性相似的微生物，在染色過程中，這些未知的微生物也可能會(huì)被一起染色，從而影響 BODIPY 505/515熒光探針的可視化觀察和熒光分析方法的準(zhǔn)確性。這是由于在可視化觀察中，所有染色的微生物都可以被觀察到，從而無法分辨目標(biāo)微生物，不利于其結(jié)果分析；同時(shí)，在熒光定量分析中，由于每次微藻液中的未知微生物的含量不確定，從而導(dǎo)致建立的熒光分析方法的準(zhǔn)確性降低。但微藻培養(yǎng)液中的其他有機(jī)物對熒光分析結(jié)果影響較小，這些有機(jī)物在水溶液中濃度比較低，熒光探針一般都是疏水性的，其在水溶液中會(huì)迅速發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，故不會(huì)與水溶液中的有機(jī)物結(jié)合產(chǎn)生熒光，因而對熒光分析結(jié)果影響較小[8]。

3 尼羅紅和 BODIPY 505/515熒光分析方法的比較

在目前的研究中，尼羅紅熒光分析方法主要應(yīng)用于細(xì)胞的中性脂質(zhì)的定性定量測定，其對磷脂、膽固醇等類型的脂質(zhì)響應(yīng)值比較低，應(yīng)用較少[18]。尼羅紅探針的熒光分析方法研究已經(jīng)比較成熟，不少研究者建立了線性比較好的熒光分析方法應(yīng)用于不同種類的微藻、酵母、真菌等微生物[22]；然而，BODIPY 505/515作為一種相對新型的熒光探針，由于其光學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定且具有一些與尼羅紅探針相似的性質(zhì)，有研究者嘗試用其來取代尼羅紅熒光探針進(jìn)行細(xì)胞脂質(zhì)的定性定量測定[28]。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞脂質(zhì)液滴的觀察方面，BODIPY 505/515具有穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光強(qiáng)度高、可視化效果比較好等優(yōu)勢，但在細(xì)胞脂質(zhì)含量定量測定的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其建立的熒光分析方法線性較差，不利于其對脂質(zhì)的定量分析[28]。隨后，有研究者采用流式細(xì)胞儀來減弱其熒光背景，增強(qiáng)其線性關(guān)系，對一些微藻類細(xì)胞建立了一定線性關(guān)系的熒光分析方法，但也還有許多問題有待解決，例如熒光探針與脂質(zhì)液滴結(jié)合的機(jī)理、BODIPY 505/515在溶液中熒光背景值較強(qiáng)的原因等[36]?？偟膩碚f，BODIPY 505/515作為一種近年發(fā)展起來的新型熒光探針，比尼羅紅熒光探針的應(yīng)用范圍更加廣泛。

4 結(jié)論與展望

微生物油脂是一種極具發(fā)展前景的生物柴油原料，高效篩選高油脂含量菌株是實(shí)現(xiàn)微生物油脂能源化利用的關(guān)鍵。熒光分析方法可以解決目前微生物油脂含量測定方法效率低、周期長、污染大等問題。本文以典型的脂溶性熒光染料尼羅紅和BODIPY 505/515為例，介紹了熒光探針在微生物油脂測定中的應(yīng)用。對兩種熒光分析方法的準(zhǔn)確性、適用性進(jìn)行比較，并對其細(xì)胞前處理、染色條件的優(yōu)化和存在的一些問題進(jìn)行總結(jié)。

與傳統(tǒng)的油脂分析方法相比，熒光分析方法具有綠色、環(huán)保、高效等優(yōu)勢，但在實(shí)際應(yīng)用中，還存在一些問題，例如熒光探針在水溶液中的穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑使用等，這些問題也是未來熒光探針的研究方向和重點(diǎn)。其中，采用一定的方法增加熒光探針在水溶液中的穩(wěn)定性是未來的一個(gè)重要研究方向。熒光探針尼羅紅和BODIPY 505/515染色劑由于其疏水性，一般很難在水溶液存在；同時(shí)，染色劑分子在水溶液中會(huì)迅速發(fā)生褪色反應(yīng)，然后失去其特有的光學(xué)特性，因此一般采用有機(jī)試劑作為溶劑，這不利于可持續(xù)發(fā)展。為了保證染色劑的光學(xué)性能，不少研究者考慮從染色劑結(jié)構(gòu)、吸附性能入手增大其水溶性。KURNIASIH等[37]以十二烷基磺酸鈉（SDS）等表面活性劑為溶劑，對尼羅紅染色劑進(jìn)行吸附改性，發(fā)現(xiàn)尼羅紅染色劑在表面活性劑溶液中有較強(qiáng)的溶解性，發(fā)現(xiàn)其具有較好的光學(xué)性質(zhì)性能。FELBECK等[38]采用CTAB表面活性劑對水滑石進(jìn)行改性后，增加其吸附性，然后對染色劑進(jìn)行吸附處理，可以增大染色劑的溶解性。因此，對于未來熒光分析方法的發(fā)展，一方面可以考慮對染色劑本身進(jìn)行相應(yīng)的改性，例如在染色劑分子上引入一些親水性的官能團(tuán)，在增大熒光探針?biāo)苄缘耐瑫r(shí)不改變其光學(xué)性質(zhì)，同時(shí)減少熒光淬滅；另一方面可以考慮尋找熒光探針更好的附載體，其不但可以負(fù)載染色劑，使染色劑能溶解在水溶液中，而且可以產(chǎn)生較強(qiáng)的、穩(wěn)定的熒光，這是未來一個(gè)重要的研究方向。