皮特不動(dòng)桿菌、醫(yī)院不動(dòng)桿菌感染的臨床特點(diǎn)及同源性

鄧德耀,袁文麗,張 喚,龍湖波,呂紅玲,沈彥均,王筱棽,楊寶瑞,侯 霞,顧津伊

(昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 云南省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,云南 昆明 650021)

鮑曼不動(dòng)桿菌因其具有強(qiáng)大的獲得性耐藥和克隆傳播能力而受到廣泛關(guān)注。目前，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室多采用自動(dòng)化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)或生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定不動(dòng)桿菌，由于醋酸鈣不動(dòng)桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、皮特不動(dòng)桿菌(Acinetobacterpittii，不動(dòng)桿菌基因型3)和醫(yī)院不動(dòng)桿菌(Acinetobacternosocomialis，不動(dòng)桿菌基因型13TU)生化表型或蛋白指紋圖譜接近，較難區(qū)分，大多被鑒定并報(bào)告為鮑曼不動(dòng)桿菌。醋酸鈣不動(dòng)桿菌多分布于自然環(huán)境中，臨床送檢標(biāo)本中分離到的不動(dòng)桿菌則多為其余三種。鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染常見的條件致病菌，而皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌約占臨床分離醋酸鈣不動(dòng)桿菌-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumanniicomplex, ACB)的10%～66%[1-4]。需要引起重視的是，上述三種細(xì)菌感染患者的臨床特點(diǎn)可能存在差異[5-6]。關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染的文獻(xiàn)[7-8]較多，本研究重點(diǎn)關(guān)注皮特不動(dòng)桿和醫(yī)院不動(dòng)桿菌，回顧性分析其分離患者的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，探討OXA-51基因擴(kuò)增在臨床ACB快速鑒定中的價(jià)值，并對(duì)同期分離的皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性分析。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2016年1—12月分離自云南省第二人民醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室335株ACB非重復(fù)菌株，同一患者僅選取首次培養(yǎng)分離的菌株。

1.2 資料收集 收集細(xì)菌培養(yǎng)ACB陽性患者的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，包括：(1)患者的年齡、性別；(2)是否入住重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)，ICU入住天數(shù)，出院或死亡前的住院時(shí)間；(3)患者的基礎(chǔ)疾病(肺部疾病、心血管疾病、高血壓、糖尿病)；(4)有創(chuàng)操作，分離前1個(gè)月內(nèi)是否行機(jī)械通氣(氣管切開和氣管插管)，中央動(dòng)脈/靜脈置管、留置導(dǎo)尿管≥3 d；(5)對(duì)常用抗菌藥物的藥敏情況、多重耐藥菌檢出情況；(6)轉(zhuǎn)歸：是否死亡；(7)分離前最后一次實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清尿素氮(BUN)、球蛋白。

1.3 方法

1.3.1 主要儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀、細(xì)菌鑒定卡和藥敏卡由法國BioMerieux 公司生產(chǎn)，培養(yǎng)皿為鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)，抗菌藥物藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品。PCR儀購自北京安杰思，電泳儀、電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。PCR Master Mix試劑購自擎科生物技術(shù)有限公司，引物合成及DNA測(cè)序均交由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，部分藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922和銅綠假單胞菌 ATCC 27853，購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。多重耐藥菌(MDR)判定為對(duì)5類抗菌藥物中(第三代頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑)3類或以上抗菌藥物耐藥的細(xì)菌。

1.3.3 細(xì)菌總DNA的提取 煮沸法提取細(xì)菌DNA。

1.3.4 16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列分析 引物序列及操作方法參見文獻(xiàn)[9]。

1.3.5 PCR擴(kuò)增OXA-51基因 (1)引物序列，上游引物：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，下游引物：5’- TGGATTGCACTTCATCTTGG -3’。(2)反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板5 μL，無核酸酶雙蒸水4 μL。(3)擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，選取部分陽性基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.3.6 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌同源性 取細(xì)菌DNA模板進(jìn)行同源性分析。(1)引物ERIC-2和DAF4參照文獻(xiàn)[10]合成引物，DAF4：5’-CGGCAGCGCC-3’, ERIC-2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。 (2)反應(yīng)體系(30 μL)：2×PCR Mix 12.5 μL,ERIC-2引物5 μL,DAF4引物5 μL,DNA模板5 μL,無核酸酶雙蒸水2.5 μL。(3) 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，24℃退火1 min，75℃延伸2 min，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后根據(jù)擴(kuò)增帶的有無統(tǒng)計(jì)所有細(xì)菌的二元數(shù)據(jù)。利用NTSYSpc version 2.10e軟件對(duì)RAPD電泳結(jié)果進(jìn)行遺傳相似性聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果

2.1 16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列測(cè)序比對(duì)結(jié)果 335株ACB包括皮特不動(dòng)桿菌18株，醫(yī)院不動(dòng)桿菌23株和鮑曼不動(dòng)桿菌284株，其余10株為不動(dòng)桿菌屬其他種的細(xì)菌(未列入分組)。

2.2 ACB感染患者臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 見表1。

2.3 ACB對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率 皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌對(duì)大部分抗菌藥物的耐藥率均低于鮑曼不動(dòng)桿菌；皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌對(duì)哌拉西林和頭孢他啶的耐藥率高，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率則均<50%。皮特不動(dòng)桿菌與醫(yī)院不動(dòng)桿菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 325例ACB感染患者臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

*：與鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表2 325株ACB對(duì)11種抗菌藥物的耐藥情況

*：與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；3、18泳道分別為皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌臨床分離株，其余為鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株

圖1ACB細(xì)菌OXA-51 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1Electrophoresis map of amplified product of OXA-51 gene of ACB bacteria

2.4 OXA-51基因擴(kuò)增情況 18株皮特不動(dòng)桿菌和23株醫(yī)院不動(dòng)桿菌均未見OXA-51基因擴(kuò)增陽性，284株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA-51基因PCR檢測(cè)均陽性。見圖1。

2.5 RAPD同源性分析 遺傳相似性系數(shù)在0.65時(shí)，18株皮特不動(dòng)桿菌可分為克隆A、B、C和D；23株醫(yī)院不動(dòng)桿菌分為克隆E、F、G和H。其中，克隆A(66.67%)、克隆F(56.52%)分別為皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌的主要克隆。見圖2。

注：a、b分別為皮特不動(dòng)桿菌的RAPD電泳圖、聚類分析樹狀圖；c、d分別為醫(yī)院不動(dòng)桿菌的RAPD電泳圖、聚類分析樹狀圖

3 討論

根據(jù)分子遺傳學(xué)技術(shù)，不動(dòng)桿菌至少可以分為45個(gè)基因型，其中28種已正式命名，以前的基因3型現(xiàn)為皮特不動(dòng)桿菌，基因型13TU為醫(yī)院不動(dòng)桿菌[11]。在表型上此兩種細(xì)菌與鮑曼不動(dòng)桿菌十分接近，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室使用的商品化鑒定方法常會(huì)將其誤鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌[12-13]，因此，皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌在臨床工作中少見報(bào)告。近年來，隨著分子生物學(xué)鑒定方法的普及，越來越多文獻(xiàn)報(bào)道臨床分離皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌相關(guān)的醫(yī)院感染[1-4,14]。本研究結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌在ACB中最常見，其次為醫(yī)院不動(dòng)桿菌，皮特不動(dòng)桿菌檢出率僅為5.37%。醫(yī)院不動(dòng)桿菌和皮特不動(dòng)桿菌占ACB臨床分離株的12.24%，遠(yuǎn)低于以往報(bào)道的美國29%[1]、中國(臺(tái)灣地區(qū))24%～45%[2]、韓國50%[3]及挪威66%[4]，說明不同國家或地區(qū)醫(yī)院內(nèi)菌群感染的流行方式及種群的進(jìn)化程度不同。國內(nèi)關(guān)于此兩種細(xì)菌臨床分布的文獻(xiàn)報(bào)道較少，多中心研究及區(qū)域性細(xì)菌監(jiān)測(cè)工作的重要性日益凸顯，有條件的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)積極探索分子遺傳學(xué)鑒定方法，以及應(yīng)用現(xiàn)代質(zhì)譜和測(cè)序技術(shù)對(duì)醫(yī)院感染復(fù)合菌群及少見菌進(jìn)行鑒定。

不同文獻(xiàn)報(bào)道中皮特不動(dòng)桿菌/醫(yī)院不動(dòng)桿菌的臨床檢出率存在較大差異，但大多數(shù)研究[1-6]認(rèn)為，與感染鮑曼不動(dòng)桿菌的患者相比，皮特不動(dòng)桿菌或醫(yī)院不動(dòng)桿菌感染患者往往表現(xiàn)出更低的耐藥率和病死率，以及更輕的并發(fā)癥和更好的臨床預(yù)后，因此，鮑曼不動(dòng)桿菌和皮特不動(dòng)桿菌/醫(yī)院不動(dòng)桿菌應(yīng)該被視為不同的種群而區(qū)分對(duì)待。在本研究中，分離皮特不動(dòng)桿菌或醫(yī)院不動(dòng)桿菌的患者均以男性為主，較鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者而言，此部分患者較年輕，血清球蛋白水平更高，可能具有較強(qiáng)的免疫力，從而抵御毒力較高細(xì)菌的定植與感染。本研究中鮑曼不動(dòng)桿菌和皮特不動(dòng)桿菌/醫(yī)院不動(dòng)桿菌分離患者間ICU入住率、侵入性操作情況、肺部感染率、住院期間死亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與其他文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道一致。機(jī)械通氣往往跨越了咽喉部自然屏障，同時(shí)削弱氣道纖毛清除系統(tǒng)功能，氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜形成，并保護(hù)病原微生物不受抗菌藥物以及宿主防御作用的影響，導(dǎo)致肺部感染的難治和反復(fù)發(fā)生[15]。因此，對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者或高危人群，應(yīng)盡早拔管或采用有創(chuàng)-無創(chuàng)序貫通氣策略，減少肺部感染的發(fā)生，進(jìn)而降低患者的病死率。本研究中皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌的MDR率和碳青霉烯類抗生素的使用率均低于鮑曼不動(dòng)桿菌；除哌拉西林、頭孢他啶和左氧氟沙星外，皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌對(duì)其他抗菌藥物，特別是碳青霉烯類抗生素的耐藥率均低于鮑曼不動(dòng)桿菌，提示臨床實(shí)驗(yàn)室需使用分子遺傳學(xué)方法對(duì)ACB進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，有助于臨床醫(yī)生合理選擇抗菌藥物，降低碳青霉烯類抗生素的選擇壓力，縮短住院時(shí)間，減輕患者痛苦，降低社會(huì)、醫(yī)院、患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

blaOXA-51-like是一大類鮑曼不動(dòng)桿菌天然攜帶的D類β-內(nèi)酰胺酶基因，多定位在染色體上并具有很高的種屬特異性[16]。然而，也有研究[17]報(bào)道含ISAba1-blaOXA-51-like的質(zhì)粒在鮑曼不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌間互相播散。本組皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌均未擴(kuò)增出OXA-51基因，284株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA-51基因PCR檢測(cè)均陽性，OXA-51基因擴(kuò)增在快速區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌和皮特不動(dòng)桿菌/醫(yī)院不動(dòng)桿菌中的敏感性和特異性均為100%，與王賀等[13]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，OXA-51基因擴(kuò)增可以作為一種簡(jiǎn)便快捷、成本低廉且易于推廣的技術(shù)，作為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室商品化表型鑒定系統(tǒng)的補(bǔ)充。

本研究RAPD分型結(jié)果顯示，遺傳相似性系數(shù)在0.65時(shí)，18株皮特不動(dòng)桿菌和23株醫(yī)院不動(dòng)桿菌均可分為4個(gè)不同的克隆，其中克隆A和克隆F分別為皮特不動(dòng)桿菌、醫(yī)院不動(dòng)桿菌的流行株，提示該院存在醫(yī)院內(nèi)皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌的克隆傳播或科室間的交叉感染。根據(jù)RAPD基因分型結(jié)果可以推斷，細(xì)菌克隆株的傳播流行可能是皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染逐年增加的主要原因之一。

皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一，區(qū)域性細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)工作應(yīng)正確區(qū)分該菌群。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室開展ACB的準(zhǔn)確鑒定對(duì)于病原菌流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。OXA-51基因擴(kuò)增可以考慮作為一種簡(jiǎn)便快捷的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌的快速鑒定。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)對(duì)皮特不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌的檢測(cè)和監(jiān)控，以期為臨床合理使用抗菌藥物及控制醫(yī)院克隆株播散提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。