免疫抑制治療對兒童重型再生障礙性貧血細(xì)胞因子表達的影響

陳 慧 劉 怡 馬 潔 高 超 邢天禹 趙曉曦 陳振萍

再生障礙性貧血(AA)是一種由多種原因引起的骨髓造血功能衰竭，導(dǎo)致全血細(xì)胞減少的臨床綜合征，包括遺傳性骨髓衰竭性疾病(IBMFS)和獲得性AA(aAA)。亞裔人群中約95% AA患者為aAA[1]。aAA分為繼發(fā)性(如藥物、放射損傷、病毒感染等所致)和特發(fā)性(無明確致病因素)[2]。目前認(rèn)為T淋巴細(xì)胞異?；罨?、功能亢進造成的骨髓損傷在特發(fā)性aAA機制中占主要地位。在兒童中，重型AA(SAA)發(fā)病率高，起病急，進展迅速。抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)聯(lián)合環(huán)孢素的免疫抑制治療(IST)是缺乏人類白細(xì)胞抗原相合同胞供者SAA患兒首選的治療方案，緩解率60%～70%[2-4]。已有研究表明，aAA存在由免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子紊亂導(dǎo)致的免疫功能異常[5-7]。aAA與骨髓中造血干/祖細(xì)胞的免疫性損傷有關(guān)[8]。IFN-γ與TNF-α已被研究證實為主要的造血抑制因子[9-11]。此外，其他細(xì)胞因子，如白介素(IL)，在aAA的發(fā)生和發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要作用[12-14]。本研究回顧性分析首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)初診SAA患兒及其接受IST治療后的臨床資料，并與初診非重型AA(MAA)患兒的細(xì)胞因子水平進行比較，旨在探討血清細(xì)胞因子水平作為評價IST治療SAA療效的臨床意義。

1 方法

1.1 診斷與分型 AA的診斷及分型依據(jù)我國及英國血液學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)[15,16]。①SAA：骨髓細(xì)胞增生程度<正常的25%；如≥正常的25%但<50%，則殘存的造血細(xì)胞應(yīng)<30%。血常規(guī)需具備下列3項中的2項：中性粒細(xì)胞<0. 5 × 109·L-1、網(wǎng)織紅細(xì)胞<20 ×109·L-1、血小板<20 × 109·L-1；②極重型AA(VSAA)：中性粒細(xì)胞<0.2 × 109·L-1；③MAA：未達到SAA和VSAA診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)染色體斷裂試驗、流式細(xì)胞儀檢測糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨聯(lián)蛋白和細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，除外IBMFS (如Fanconi貧血、先天性角化不良、Shwachman-Diamond綜合征、Diamond-Blackfan貧血和先天性無巨核細(xì)胞性血小板減少癥)、腫瘤性疾病(如低增生性白血病、淋巴瘤、惡性腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移)、骨髓增生異常綜合征、原發(fā)性骨髓纖維化、溶血性疾病(如遺傳性溶血性貧血、自身免疫性溶血性貧血、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥)及其他疾病(如肝病、營養(yǎng)性貧血、病毒感染、結(jié)締組織病)。

1.2 研究對象的納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①SAA/VSAA組：納入2017年10月至2018年12月在我院住院初診為獲得性SAA/VSAA且應(yīng)用IST治療的患兒。排除非首次使用ATG患兒。②MAA組：納入同期在我院住院初診為獲得性MAA并給予環(huán)孢素A(CsA)口服治療的患兒，除外輸注依賴型MAA患兒。

1.3 治療

1.3.1 成分輸血指征 當(dāng)患兒Hb≤60 g·L-1，予輸注懸浮紅細(xì)胞；PLT≤10×109·L-1，予輸注PLT。

1.3.2 IST方案 在無感染、Hb輸至>80 g·L-1、PLT輸至>20 ×109·L-1情況下，入千級層流病房，予兔ATG(即復(fù)寧) 3.3 mg·kg-1·d-1，連續(xù)靜脈滴注5 d，每天在ATG前0.5 h開始予甲潑尼龍4 mg·kg-1·d-1靜脈滴注抑制ATG過敏反應(yīng)，并持續(xù)伴隨ATG靜脈滴注直至結(jié)束。ATG治療結(jié)束后(第6 d)，激素開始逐漸減量(3周減停)，并予CsA持續(xù)口服(3～5 mg·kg-1·d-1，間隔12 h口服)，維持有效血藥谷濃度150～200 μg·L-1。CsA口服6個月無反應(yīng)病例，則停用CsA，對癥成分輸血，并予造血干細(xì)胞移植治療；CsA口服12個月完全治療反應(yīng)或部分治療反應(yīng)患兒，12個月時CsA逐漸減量。ATG治療結(jié)束后，Hb<70 g·L-1者輸注RBC，PLT<10 × 109·L-1或感染、明顯出血時PLT<20 × 109·L-1者輸注PLT。粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)在ATG治療后2周開始使用，中性粒細(xì)胞>1.0 ×109·L-1時停用。

1.4 隨訪及療效判定

1.4.1 隨訪計劃 患兒出院后定期門診隨訪，由門診隨訪醫(yī)生評估治療反應(yīng)。開始治療后6個月內(nèi)血常規(guī)每周檢查1次，治療6個月后血常規(guī)和肝腎功能至少每月檢查1次。免疫指標(biāo)及骨髓形態(tài)和病理變化按治療開始后6個月、1年、2年、3年、5年和10年進行評估。隨訪時間截止至患兒最后一次門診就診時間，本研究隨訪日期截止至2019年6月1日。失訪患兒截止至最后一次就診時間。

1.4.2 療效判定 按照英國血液學(xué)會療效標(biāo)準(zhǔn)[15,16]。①完全緩解(CR)：停止依賴成分輸血，Hb正常(依據(jù)同年齡、同性別兒童)，中性粒細(xì)胞>1. 5 ×109·L-1，PLT>100 × 109·L-1。②部分緩解(PR)：脫離血制品輸注，血常規(guī)各項指標(biāo)未達到SAA標(biāo)準(zhǔn)。③未緩解(NR)：未脫離血制品輸注，血常規(guī)各項指標(biāo)仍達SAA標(biāo)準(zhǔn)。④治療有效：取得CR及PR定義為對治療有反應(yīng)。⑤復(fù)發(fā)：由CR轉(zhuǎn)變?yōu)镻R，或PR變?yōu)镹R，即由非輸注依賴變?yōu)檩斪⒁蕾嚒?/p>

1.5 細(xì)胞因子測定 采用CBA法檢測兩組初診時、SAA/VSAA組治療6個月和12個月、MAA組治療6個月患兒血清中T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達水平。清晨空腹經(jīng)靜脈抽取患兒外周血5 mL至促凝管，以150 g速度離心5 min后取上清液200 μL置于EP管。按人Th1/Th2亞群檢測試劑盒(江西諾德醫(yī)療器械有限公司，流式熒光法)說明書處理標(biāo)本，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；將捕獲免疫微球和血清樣本混合重懸，再與PE標(biāo)記的熒光檢測試劑結(jié)合，在BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀上獲取細(xì)胞。將上述采集到的數(shù)據(jù)經(jīng)BD CBA FCAP分析軟件處理，通過分析雙抗夾心復(fù)合物的熒光強度，得到待測樣本相關(guān)細(xì)胞因子含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 SAA/VSAA組25例，其中男15例，女10例，SAA 16例，VSAA 9例，中位年齡96個月(2～15歲)。MAA組37例，其中男20例，女17例，中位年齡132個月(2～15歲)。兩組患兒性別和年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有患兒無HLA相合同胞供者或不適于一線接受異基因造血干細(xì)胞移植。

2.2 細(xì)胞因子水平 表1顯示，初診時，SAA/VSAA組IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10濃度中位數(shù)均高于MAA組，IFN-γ和IL-6在兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10水平在兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

SAA/VSAA組經(jīng)IST治療6個月后，外周血IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10濃度均有不同程度降低，以IFN-γ、TNF-α和IL-6水平下降最明顯。經(jīng)IST治療1年后，IFN-γ和IL-6水平與治療前差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 MAA組和SAA/VSAA組治療前后細(xì)胞因子水平比較(中位數(shù))

注P1：MAA組vsMAA組治療12個月；P2：SAA/VSAA組初診vsSAA/VSAA組治療6個月；P3：SAA/VSAA組初診vsSAA/VSAA組治療12個月；P4：兩組初診比較；P5：兩組治療12個月比較

2.3 IST療效 截至末次隨訪，SAA/VSAA組失訪3例，余22例全部生存，無復(fù)發(fā)，其中6例未到12個月復(fù)查時間。治療后6和12個月總體治療反應(yīng)率均為100%(22/22，16/16)。IST治療6個月，獲得PR 14例(63.6%)，CR 8例(36.4%)；IST治療12個月，獲得PR 5例(31.2%)，CR 11例(68.8%)。

3 討論

aAA是由多種因素介導(dǎo)的骨髓造血衰竭性疾病，尤其是SAA和VSAA患兒出血和感染致死風(fēng)險較高，預(yù)后較差。aAA的發(fā)病機制復(fù)雜，免疫介導(dǎo)的造血抑制近年來受到關(guān)注。造血的免疫調(diào)節(jié)因素包括各種細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子之間的相互調(diào)節(jié)[5-8]，大多數(shù)aAA患者出現(xiàn) T、B淋巴細(xì)胞亞群失衡，T細(xì)胞異?；罨瘜?dǎo)致TNF-α與IFN-γ等造血負(fù)向調(diào)控因子水平增高，進而抑制骨髓造血功能。

T細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，可分為CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)和CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)。已有研究證據(jù)表明，活化的CD8+CTL可釋放TNF-α和IFN-γ等造血負(fù)向調(diào)控因子，并通過 Fas/FasL信號通路誘導(dǎo)造血干/祖細(xì)胞凋亡[17]。另外，細(xì)胞因子是決定CD4+Th行駛功能的重要因素。Giannakoulas等[18]報道，在aAA中Th1克隆占優(yōu)勢，分泌大量TNF-α和IFN-γ，進而抑制CD34+細(xì)胞造血集落的形成。正常情況下，機體的Th1/Th2類細(xì)胞因子趨于動態(tài)平衡，而在aAA患者機體中存在Th1的極化[9,19,20]。本研究顯示，初診SAA/VSAA患兒外周血TNF-α和IFN-γ的表達有不同程度升高，特別是IFN-γ水平，證實該疾病狀態(tài)下存在更嚴(yán)重的造血調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子失衡，造血負(fù)調(diào)控因子表達相應(yīng)增加。

也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aAA患者外周血與骨髓中Th17比例增多，同時伴隨 CD4+CD25+叉頭框蛋白(FOXP) 3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比例的減少，提示Th17與Treg比例存在負(fù)相關(guān)，免疫平衡被打破[21-24]。IL-6正是連接Treg與Th17分化的關(guān)鍵因子。TGF-β可誘導(dǎo)FOXP3表達，使初始CD4+細(xì)胞分化為Treg，但當(dāng)有較高濃度的IL-6存在時，IL-6和TGF-β共同作用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達，使初始CD4+細(xì)胞分化為Th17，而抑制其向Treg的分化[25,26]。由此可見，IL-6為Th17的分化提供了重要的細(xì)胞因子環(huán)境。除此以外，早前已有研究發(fā)現(xiàn)aAA患者CD8+CTL被激活，增加的TNF-α和IFN-γ間接刺激IL-6分泌，IL-6反過來作用于CTL，并能放大CTL的細(xì)胞毒作用[27]。本研究顯示，初診SAA/VSAA患兒外周血IL-6濃度顯著增加，參與了aAA的發(fā)病。

SAA、VSAA以及輸血依賴型MAA患兒，如有合適的骨髓造血干細(xì)胞供者，首選造血干細(xì)胞移植，療效好、復(fù)發(fā)和克隆性疾病遠期轉(zhuǎn)化風(fēng)險小[2,28]。對于缺乏全相合同胞供體的患兒，近些年相關(guān)報道顯示應(yīng)用IST治療后血液學(xué)反應(yīng)率為60%～70%[2-4,29]，甚至IST治療后2年隨訪有效率可達80%，10年生存率可達90%[30,31]。因此，IST的療效值得肯定，是無合適骨髓造血干細(xì)胞供者SAA患兒的有效治療方法。本研究SAA/VSAA組在免疫抑制治療后，IFN-γ、TNF-α和IL-6水平明顯下調(diào)，療效評價證實IST療效佳；MAA組在口服CsA治療后，血清細(xì)胞因子變化不顯著，因此推測SAA/VSAA的發(fā)病更傾向于因T淋巴細(xì)胞過度活化，致使免疫失調(diào)，IST治療可以糾正失衡的T淋巴細(xì)胞亞群，降低造血負(fù)調(diào)控因子的表達水平，從而有助于骨髓造血功能的恢復(fù)和重建。

鑒于本研究為回顧性分析，且隨訪時間較短，樣本量相對較小，aAA的發(fā)病機制以及IST治療對于造血干/祖細(xì)胞作用機制、遠期安全性等一系列問題，尚需大樣本、長期的臨床試驗及基礎(chǔ)研究證實。