抗菌藥物敏感性體外檢測系統(tǒng)質(zhì)量控制標準

郭世富 編譯

(1 國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械標準管理中心，北京 102629)2 中國食品藥品檢定研究院，北京102629)

1 前言

多年來，由于臨床上廣泛大量使用種類繁多的抗菌藥物，細菌的耐藥性越來越普遍，有的細菌可同時耐受多種藥物，耐藥菌株的廣泛傳播給臨床治療帶來了很大的困難。同時，臨床診治手段不斷更新，在提高診斷和治療效果同時，也帶來了更多的交叉感染機會，使機體的免疫狀態(tài)趨于低下。感染類型的變化對臨床微生物藥敏的檢測提出了更高的要求。

藥物敏感試驗是指抗菌藥物在體外對病原體有無抑制或殺滅作用的實驗?？咕幬锩舾行泽w外檢測，目的是了解病原微生物對各種抗生素的敏感程度，以指導(dǎo)臨床合理選用抗生素藥物。實施抗菌藥物敏感性試驗可預(yù)測抗菌治療的效果，包括“敏感”治療可能有效，“耐藥”肯定失敗，提供所選擇藥物的依據(jù)，監(jiān)測耐藥性，分析耐藥菌變遷，掌握耐藥菌感染病流行病學(xué)，控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。

各種細菌對不同抗菌藥物的敏感性不同，同一種細菌中不同菌株的藥敏也常有差異。藥敏實驗結(jié)果對臨床合理選用抗菌藥物有重要的參考價值。

2 抗菌藥物敏感性檢測的方法

為測定微生物對某一抗感染藥的敏感性，通常應(yīng)用最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)表示，MIC值越高說明該微生物對該抗生素的敏感性越低。葡萄球菌藥敏板使用微量稀釋法進行MIC值的測定。

目前，被普遍應(yīng)用的臨床藥敏試驗方法和“抗藥”或“敏感”的分界點判定標準是美國臨床標準實驗室(CLSI)上世紀七十年代年提出的。通常以瓊脂或肉湯稀釋法和紙片擴散法測定最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，并根據(jù)藥敏分界點(breakpoint)判定標準判斷敏感與抗性。

紙片擴散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，通過細菌生長情況來判斷藥物對微生物的MIC值。紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成一種濃度梯度。不同抗菌藥物抑菌圈的直徑因受藥物在瓊脂中的擴散速率的影響而可能不同，抑菌圈的大小可反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負相關(guān)，即抑菌圈越大，MIC越小。此法在臨床實驗中存在一次性檢測藥物少、無法定量MIC值的缺點。

稀釋法是在肉湯或瓊脂中將抗菌藥物進行一系列(對倍)稀釋后，定量接種待檢菌，一定溫度一定孵育時間后觀察。抑制待檢菌肉眼可生長的最低藥物濃度，即為該藥物對待檢菌的最低抑菌濃度(MIC)。

稀釋法通常通過微生物藥敏板進行，但存在藥敏板條種類較少，不能滿足各種類型細菌的藥敏實驗的情況，與此同時，藥敏板條中抗生素的濃度梯度較少，大部分只可報告定性的敏感、中度敏感和耐藥結(jié)果，而不能準確的報告出藥物的MIC值。對藥物抗菌的評價有三種：敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。

“敏感”類是指分離菌株能被使用推薦劑量在感染部位通?？蛇_到的抗菌藥物濃度所抑制。

“中介”類包括這些菌株，其抗微生物藥物MIC接近于血液和組織中通?？蛇_到的水平，而抗微生物藥治療的反應(yīng)率可能低于敏感株?！爸薪椤狈诸愐馕吨幬镌谏頋饧牟课痪哂信R床效力[如尿液中的喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類)或者可用高于正常劑量的藥物進行治療(如β-內(nèi)酰胺類)。此分類還包括一個緩沖區(qū)，它可以避免微小的、未能控制的技術(shù)因素造成重大的結(jié)果解釋錯誤，特別是對那些藥物毒性范圍窄的藥物]。

“耐藥”類是指分離菌株不被常規(guī)劑量用藥通?？蛇_到的藥物濃度所抑制，和/或證明抑菌環(huán)直徑落在可存在某些特定的微生物耐藥機制范圍(如β-內(nèi)酰胺酶)，并且治療研究顯示藥物對分離菌株的臨床療效不可靠。

近年來Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)對于一些藥敏試驗判定標準變動頻繁，尤其是Beta-lactam類抗生素，包括腸道菌屬對Carbapenem類抗生素之藥敏試驗等。

3 抗菌藥物敏感性試驗質(zhì)量控制標準

CLSI制定了一系列關(guān)于抗菌藥物敏感性試驗質(zhì)量控制標準文件。例如：

M2抗菌藥敏試驗的性能標準；

M6脫水Mueller Hinton瓊脂的評價方法；

M7有氧培養(yǎng)的細菌稀釋抗生素敏感性試驗方法；

M11厭氧菌的藥敏試驗方法；

M23維生素E檢測標準及質(zhì)量控制參數(shù)的研究進展；

M39累積抗生素敏感性試驗數(shù)據(jù)的分析和介紹；

M21血清殺菌試驗方法學(xué)研究；

M24分枝桿菌、Nocardia和其他有氧放線菌的藥敏試驗；

M26抗菌藥物殺菌活性測定方法；

M27酵母菌稀釋液抗真菌藥敏試驗的參考方法；

M31抗菌菌的性能標準和動物分離細菌的稀釋敏感性試驗；

M37獸用抗菌藥物易感性檢測標準及質(zhì)量控制指標的研究進展；

M38肉湯稀釋法絲狀真菌藥敏試驗的參考方法；

CLSI，M7-稀釋的方法抗生素敏感性測試有氧生長的細菌；批準的標準(最近批準的補充)；

CLSI，M11-厭氧細菌的抗菌藥敏試驗方法；批準的標準(最近批準的補充)；

CLSI，M100-抗菌藥敏試驗的性能標準。(最近的信息補充)；

CLSI，M23-體外藥敏試驗標準和質(zhì)量控制參數(shù)的制定；批準的指南(最近批準的補充)；

M2——即紙片擴散法(DD)描述了如何執(zhí)行紙片擴散散測試文件M2-A11；

M7即MIC文件，描述如何對需氧菌進行最小抑菌濃度(MIC)試驗M7-A9。

利用CLSI M2-A11 M7-A9操作藥敏試驗，結(jié)果解釋表參照M100-S26，M100包含用于解釋紙片擴散法的表和MIC試驗表，其中，M100每年更新一次；M2、M7每3年更新一次，以下舉例說明M100-25、26、27的區(qū)別。

2016年CLSI M100-S26，更新了細菌抗生素敏感性報告判讀標準，主要變動包括以下：

一是針對大腸埃希菌(E.coli)、克雷伯菌屬(K.pneumoniae)、奇異變形桿菌(P.mirabilis)三只常見之腸內(nèi)菌(Enterobacteriaceae)，新增尿道感染尿液樣本對Cefazolin藥物的判讀標準(表1)。因?qū)嶒炇覠o法判定病人臨床診斷是否為尿道感染，因此會同時出現(xiàn)以下兩種判讀標準CZ(其他)及CZ(尿液)。臨床醫(yī)生根據(jù)病人臨床診斷及送驗類別進行判讀。二是腸內(nèi)菌(Enterobacteriaceae)于Cefepime的判讀標準變動如下(表2)，報告格式由I(intermediate)變?yōu)镾DD(susceptible-dose dependent)，判讀為SDD的結(jié)果將以「D」格式核發(fā)。

表1 三只常見腸內(nèi)菌判讀標準的變化

表2 腸內(nèi)菌判讀標準的變化

三是不動桿菌屬(Acinetobacter spp).于Imipenem的判讀標準變化如下(表3)。

四是假中間葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)對于Oxacillin藥物敏感性試驗方法變化。

當(dāng)菌株生長狀況不好時，VITEK2自動化藥敏試驗無法判讀時，需要以disk diffusion方法進行測試。S.pseudintermedius由30μg Cefoxitin(surrogate test for Oxacillin)更改為1μg Oxacillin disk diffusion。變化前后標準如下(表4)。

表3 腸內(nèi)菌判讀標準的變化

表4 假中間葡萄球菌判讀標準的變化

五是綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)對于Piperacillin-tazobactam(TZP)藥物敏感性試驗判讀標準變化如下(表5)。

另外，因CLSI已于2010年修改Cefazolin、Cefuroxime、Cefotaxime藥敏判讀標準；Cefepime判讀標準也于2014年進行更改，上述四種抗生素藥敏試驗的判讀標準更為嚴謹，可取代ESBL報告，且自2010年CLSI也不需再報告ESBL結(jié)果，所以刪除ESBL字段。

表5 綠膿桿菌判讀標準的變化

同時，Streptococcus agalactiae不再用于核發(fā)Erythromycin藥敏試驗結(jié)果：因CLSI與美國CDC等機構(gòu)均建議Erythromycin不適用于Streptococcus agalactiae的治療。

ISO/TC212也制定了相關(guān)質(zhì)量控制ISO16256描述了一種檢測酵母抗真菌劑敏感性的方法，包括引起感染的念珠菌和新生隱球菌。描述的參考方法尚未用于研究雙態(tài)真菌的酵母形式，如皮炎桿菌和/或莢膜變種莢膜。ISO 16256描述了肉湯微稀釋參考方法，該方法可以通過兩種途徑之一實現(xiàn)。一條途徑涉及MIC的可視測定(CLSI法)，第二條途徑涉及MIC的分光光度測定(EUCAST法)。

ISO 16256給出了MIC值的解釋，指出酵母抗真菌劑通過肉眼確定MIC的方法也是基于CLSI最新出版指南，而通過光度法確定MIC的方法宜使用來自EUCAST最新折點解釋。

ISO 16256給出了質(zhì)量控制的標準。指出試驗結(jié)果的質(zhì)量應(yīng)通過伴隨使用的質(zhì)控菌株(見表6和表7)來監(jiān)測。儲存質(zhì)控菌株應(yīng)凍干或冷凍保存(肉眼判讀法-70℃保存，光度判斷法-60℃保存)。質(zhì)控菌株的工作培養(yǎng)物可通過儲存菌株在非抑制性瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種培養(yǎng)獲得。工作培養(yǎng)物只能從第一代工作培養(yǎng)物傳代，定期用從冷凍供應(yīng)中制備新的斜面培養(yǎng)，至少每兩周進行一次。如可能，每個測定日宜至少選取兩株相關(guān)類型的質(zhì)控菌株和日常標本按同樣方式試驗，且各質(zhì)控菌株對各抗真菌劑的MIC檢測結(jié)果應(yīng)該在表6和表7規(guī)定的范圍內(nèi)。如果遇到超出質(zhì)控值，宜首先重復(fù)試驗以確定程序的關(guān)鍵步驟是否很好控制。如果還繼續(xù)觀察到失控值，應(yīng)認真檢查程序的所有方面。并且進一步參考測試應(yīng)暫停直到質(zhì)控值再回到正確的范圍。

4 抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果臨床應(yīng)用討論

醫(yī)生可根據(jù)藥敏試驗決定某種抗生素不能使用，不能根據(jù)藥敏試驗結(jié)果向醫(yī)生推薦使用何種抗生素。每種藥物都有自己的抗菌譜，在開發(fā)研究時，就確定了它的抗菌范圍。剛投入使用時，抗菌譜范圍內(nèi)的細菌一般都是敏感的，隨著使用時間的延長及濫用，細菌就產(chǎn)生了耐藥性。如果不做藥敏試驗，醫(yī)生只能根據(jù)以往的經(jīng)驗用藥，往往誤用已耐藥的抗生素進行治療而導(dǎo)致失敗。所以，藥敏試驗的目的是合理選用抗生素、提高療效、防止抗生素的濫用和誤用。

體外藥敏試驗和體內(nèi)藥物療效確實有差異，主要是因為體外和體內(nèi)的環(huán)境不同。導(dǎo)致差異原因有多種。一是病原菌鑒定不正確或者一些混合感染的病原菌沒有明確鑒定。一般醫(yī)院臨床微生物實驗室的標本分離培養(yǎng)和細菌檢驗大多局限于需氧非苛養(yǎng)菌，而對于一些對氧或營養(yǎng)有特殊要求的細菌如厭氧菌和苛養(yǎng)菌，由于分離培養(yǎng)較困難，故未能獲培養(yǎng)和鑒定。二是會存在有正常菌群存在的部位，如呼吸道。

表6 肉眼判讀肉湯微量稀釋試驗兩個質(zhì)控菌株的24h和48hMIC(mg/L)推薦限值

表7 光度判讀肉湯微量稀釋試驗質(zhì)控菌株的MIC推薦限值

要選擇合適的藥敏試驗方法。藥敏試驗方法選擇不當(dāng)會導(dǎo)致藥敏結(jié)果的不正確。例如，對于CLSI規(guī)定藥敏試驗必須用稀釋法(MIC法)測定的菌株，如許多不發(fā)酵糖革蘭陰性菌，如果采用紙片擴散法測定，其結(jié)果可能會不能正確反映菌株對抗菌藥物的敏感性。對抗菌藥物的敏感性試驗不同國家或有不同的判斷標準。某些耐藥細菌體外藥敏試驗結(jié)果是敏感的，但臨床治療或許無效。