蒲公英根水提物誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡及其作用機制研究

陳子涵，蔣繼宏，鞠秀云，劉金娟

(江蘇師范大學江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

乳腺癌是導(dǎo)致全球女性癌癥死亡的第二大原因[1]。乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，它是一種具有不同病理實體的異質(zhì)性疾病，因此需要多種治療措施。約10%～20%的浸潤性乳腺癌是三陰性的腫瘤，其定義為缺乏雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2[2]。這種乳腺癌亞型與不良預(yù)后相關(guān)，并且與其他亞型相比，轉(zhuǎn)移后的存活率更差。雖然相關(guān)研究開展多年，但由于缺乏有效的藥物靶點，大部分三陰性乳腺癌患者依然不可治愈。再加上病患對現(xiàn)有藥物的抗藥性不斷增強，促使人們必須尋找新的抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物。中藥抗腫瘤作用具有多靶點和多環(huán)節(jié)性的特征[3]，同時中藥抗腫瘤提取物還具有低毒性等優(yōu)點。因此，具有抗腫瘤功能的中藥材提取物的開發(fā)及利用，越來越受到人們的關(guān)注。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)，屬于菊科，蒲公英屬，多年生草本植物，具有極高的食用和藥用價值，屬于傳統(tǒng)的中藥材。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英具有抗腫瘤、利膽、利尿、抗氧化、抗炎、保肝等特性[4]。報道顯示，蒲公英在各種類型的惡性腫瘤中發(fā)揮著抗腫瘤作用，包括結(jié)直腸癌[5]、白血病[6]等。例如，蒲公英根提取物、根多糖等能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，以及抑制腫瘤引起的炎癥反應(yīng)[7-8]。此外，蒲公英粗提物對人黑色素瘤細胞也具有一定的抑制作用[9]。但是，關(guān)于蒲公英根水提物對于三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的影響還未見報道。因此，研究蒲公英根水提物促進三陰性乳腺癌細胞的凋亡具有重要意義。本文主要研究蒲公英根水提物對三陰性乳腺癌細胞的促凋亡作用，初步研究其促進三陰性乳腺癌細胞凋亡的分子機制，為后期活性成分的提取和新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細胞、MDA-MB-436細胞、MCF-7細胞，以及人肝細胞L02，均購自上海中科院細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 蒲公英采自徐州豐縣田間，由專業(yè)人士鑒定；Alamar blue，美國Sigma公司；caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2、p53、多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、GAPDH抗體、caspase抑制劑，均購自美國Bioworld公司；PE Annexin V凋亡檢測試劑盒，美國BD公司；細胞裂解液、DAPI試劑，均購自碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 IBE2000顯微鏡(COIC公司)；Leica DM 5000 B熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；SpectroMax M2熒光檢測儀(Molecular Device公司)；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂公司)；超聲波細胞破碎儀(美國SONICS公司)；流式細胞儀(BD 公司)。

1.2方法

1.2.1蒲公英水提物的制備 將新鮮的蒲公英洗凈后，晾干表面水分，取葉(包括葉柄)和根，分別置于家用榨汁機中榨成汁液，4 ℃、4 000 r·min-1離心30 min,取上清液，于-80 ℃冰箱過夜冷凍，隨后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，用PBS配制成100 g·L-1的母液，用0.22 μm的無菌濾膜抽濾2次，然后用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的蒲公英根水提物(0、1.5、3、7.5、15 g·L-1)。置于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2細胞培養(yǎng)與體外抗腫瘤活性實驗 采用Alamar blue法，檢測蒲公英根和葉水提物體外對正常細胞及腫瘤細胞的增殖抑制活性[10]。抑制率=(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)×100%，式中A對照代表陽性對照組的熒光值，A樣品代表實驗組的熒光值，A空白代表空白組的熒光值。

1.2.3倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，用胰酶消化后，以2×108·L-1接種于6孔培養(yǎng)板，24 h細胞貼壁后，加入不同濃度的蒲公英根水提物(0、1.5、3、7.5、15 g·L-1)培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察形態(tài)并拍照。

1.2.4DAPI染色分析細胞凋亡 將MDA-MB-231細胞接種于6孔板中(2×108·L-1)，待24 h細胞貼壁后，加入不同濃度蒲公英根水提物(0、1.5、3、7.5、15 g·L-1)處理。在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，4 000 r·min-1離心5 min收集細胞，用PBS重懸細胞，4 000 r·min-1離心5 min，去除PBS，向清洗后的細胞中每組加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定10 min，4 000 r·min-1離心5 min，去除多聚甲醛，再用PBS重懸細胞，4 000 r·min-1離心5 min，清洗4次，去除PBS后，再加入100 μL DAPI染色液輕輕吹勻，室溫避光孵育10 min。去除DAPI染色液，用PBS洗滌3次，每次5 min。最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測MDA-MB-231細胞的凋亡 實驗步驟參照PE Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書。收集經(jīng)過蒲公英根水提物(0、1.5、3、7.5、15 g·L-1)處理48 h的MDA-MB-231細胞，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用冷PBS重懸細胞，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，然后以每100 μL含1×105個細胞的濃度重懸于Annexin V結(jié)合緩沖液中，再加入5 μL PE Annexin V和5 μL 7-AAD。輕輕重懸細胞，在室溫(25 °C)避光孵育15 min。最后向細胞懸液中加入400 μL Annexin V結(jié)合緩沖液。1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測。

1.2.6Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 不同濃度的蒲公英根水提物(0、1.5、3、7.5、15 g·L-1)處理MDA-MB-231細胞48 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入2 mL PBS洗滌細胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，每孔加入100 μL細胞裂解液RIPA(含PMSF)，冰上放置30 min，每隔10 min混勻1次，使細胞充分裂解。12 000 r·min-1離心30 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1 ∶1 000)4 ℃ 封閉過夜，TBST清洗4次，每次5 min；二抗(1 ∶1 000)封閉2 h，TBST清洗4次，每次5 min，利用化學發(fā)光系統(tǒng)進行顯色拍照。

1.2.7caspase-3、caspase-8和caspase-9抑制劑對蒲公英根水提物抗腫瘤活性的影響 將MDA-MB-231細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待24 h細胞貼壁后，加入100 μL 20 μmol·L-1caspase-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)、caspas-8抑制劑(Z-IETD-FMK)和caspase-9抑制劑(Z-LEHD-FMK)孵育2 h后，加入100 μL不同濃度的蒲公英根水提物繼續(xù)孵育48 h，Alamar blue法檢測細胞活性。

2 結(jié)果

2.1蒲公英各部位水提物體外對正常細胞及乳腺癌細胞增殖的影響如Fig 1、2所示，不同濃度的蒲公英根和葉水提物0、1.5、3、7.5、15 g·L-1作用于人正常肝細胞L02和各乳腺癌細胞48 h后，對正常細胞的生長沒有明顯的抑制作用，但高濃度的蒲公英根水提物對人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-436的生長具有明顯的抑制作用，尤其是對MDA-MB-231細胞的抑制作用最為明顯，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系。接下來，選取MDA-MB-231細胞進行有關(guān)蒲公英根水提物影響三陰性乳腺癌細胞生長和活性的分子機制研究。

Fig 1 Effect of water extracts from various parts of dandelion on viability of L02 cells n=3)

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Inhibitory effect of water extracts from various parts of dandelion on proliferation of three different breast cancer cells n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2蒲公英根水提物對人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響

2.2.1倒置顯微鏡觀察蒲公英根水提物對MDA-MB- 231細胞形態(tài)的影響 不同濃度的蒲公英根水提物處理細胞48 h后，對照組生長狀態(tài)良好、貼壁較牢固，且細胞間緊密相連。隨著蒲公英根水提物濃度的增加，細胞間距逐漸變大，貼壁能力逐漸下降，部分細胞變圓、脫落，但細胞膜依然完整(Fig 3)。結(jié)果表明，蒲公英根水提物能夠促進MDA- MB-231細胞凋亡。

2.2.2DAPI熒光染色檢測蒲公英根水提物誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞的凋亡 將不同濃度的蒲公英根水提物處理過的MDA-MB-231細胞，進行DAPI染色分析。如Fig 4所示，對照組細胞核形完整、大小均一，染色質(zhì)比較均勻。隨著蒲公英根水提物濃度的增加，細胞核逐漸解體，破裂成碎片，形成很多顆粒狀物質(zhì)。結(jié)果表明，隨著蒲公英根水提物濃度的增加，細胞凋亡數(shù)量也逐漸增多。

2.2.3流式細胞術(shù)檢測蒲公英根水提物對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染，通過流式細胞術(shù)檢測MDA-MB-231細胞的凋亡情況。如Fig 5所示，陰性對照組和不同濃度蒲公英根水提物處理細胞48 h后，MDA-MB-231細胞的凋亡率隨著蒲公英根水提物濃度的增加而明顯增加。當蒲公英根水提物濃度達到15 g·L-1時，MDA-MB-231細胞的凋亡率約達到85%。該結(jié)果與DAPI熒光染色結(jié)果相一致，說明蒲公英根水提物確實能夠促進MDA-MB-231細胞的凋亡，為今后新藥的開發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)。

Fig 3 The cell morphology of MDA-MB-231 cells treated with water extract of dandelion root

Fig 4 DAPI staining of apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by water extract of dandelion root (×400)

Fig 5 Effect of water extract of dandelion root on cell apoptosis of MDA-MB-231 cells by flow cytometry n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2.4蒲公英根水提物對MDA-MB-231細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 不同濃度蒲公英根水提物處理MDA-MB-231細胞48 h后，F(xiàn)ig 6的Western blot結(jié)果顯示，細胞凋亡的末端效應(yīng)蛋白酶cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9的蛋白水平隨蒲公英根水提物濃度的增加而增加，同時促進凋亡相關(guān)蛋白(Bax、p53)的表達量也逐漸升高；而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯受到蒲公英根水提物的抑制，均呈明顯的濃度依賴性。提示蒲公英根水提物可能是通過外源性細胞凋亡途徑和內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，共同作用于MDA-MB-231細胞，并誘發(fā)細胞凋亡。

Fig 6 The protein expression of apoptosis-related factor in MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of water extract of dandelion root

2.2.5caspase抑制劑對蒲公英根水提物促凋亡作用的影響 如Fig 7所示，caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK、caspase-9抑制劑Z-LEHD-FMK和caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO在蒲公英根水提物濃度為7.5 g·L-1以下時，能夠明顯提高各處理組中MDA-MB-231細胞的活性；在蒲公英根水提物濃度為15 g·L-1時，逆轉(zhuǎn)細胞損傷效率較弱，可能是細胞在該濃度下發(fā)生了不可逆性損傷。

Fig 7 Effect of caspase inhibitors on apoptosis induced by water extract of dandelion root n=3)

**P<0.01vscontrol

3 討論

蒲公英長期以來作為我國民間藥食同源的植物，國內(nèi)外大量實驗都揭示了其廣泛的藥理作用，為后續(xù)的深入開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。之前有研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英能夠有效抑制肝癌細胞的增殖[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英根水提物對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，這種現(xiàn)象可能與根部的某些化學成分有關(guān)。

本研究通過光學顯微鏡、DAPI熒光染色、流式細胞術(shù)均證實，蒲公英根水提物處理MDA-MB-231細胞后，均出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。caspase-3的活化是誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵核心步驟，caspase-3的活化又離不開其上游因子caspase-8或caspase-9的激活。PARP是DNA修復(fù)酶，在細胞修復(fù)與凋亡的調(diào)控中起重要作用，是caspase-3的底物之一，可以被活化的caspase-3切割分解而失活，從而促使細胞凋亡[12]。Western blot結(jié)果顯示，蒲公英根水提物處理MDA-MB-231細胞后，隨著濃度的增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性明顯增加。另一方面，線粒體在細胞凋亡中也處于重要位置，蒲公英根水提物抑制了線粒體膜上抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而使Bcl-2/Bax的比值明顯降低。它們都能阻止或促進線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放，進而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡[13-14]。之前研究表明，活化的p53可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達[15]。本研究中，蒲公英根水提物處理MDA-MB-231細胞后，p53的含量也明顯增加，這可能與p53在蒲公英根水提物誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡過程中，是通過Bcl-2家族蛋白起作用有關(guān)。為了進一步驗證蒲公英根水提物誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡的信號通路，采用caspase抑制劑(Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK、Ac-DEVD-CHO)處理細胞，結(jié)果顯示，caspase抑制劑能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)蒲公英根水提物誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡的作用。

綜上所述，蒲公英根水提物對正常細胞幾乎沒有不利影響，而對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長具有明顯的抑制作用，并能夠促進MDA-MB-231細胞凋亡，為后期活性成分的提取和新藥開發(fā)提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。