辣蓼總黃酮提取工藝篩選及優(yōu)化

向 蓉，何立美，陳文露，高 彪，袁明貴，羅勝軍，徐志宏，彭新宇

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣州510640)

辣蓼(Polygonum hydropiper Linn.) 為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物，別名蓼子草、紅辣蓼、斑蕉草等。全國各地均有分布，但主產(chǎn)于廣東、廣西及南方各省，生長在水邊潮濕的地方［1］。全草均可入藥，本品味辛，性溫;具有祛風利濕、消腫解毒、散淤止痛、止癢殺蟲等功效;用于腸胃炎、痢疾、腹瀉、跌打腫痛、風濕關(guān)節(jié)痛、功能性子宮出血等;外用治皮膚濕疹、毒蛇咬傷等癥狀［2］。臨床研究表明，辣蓼具有殺蟲、抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、抑腫瘤、鎮(zhèn)痛止血等多種生物活性［3－5］。因此在農(nóng)藥、醫(yī)藥、獸藥、食品及飼料添加劑等方面都有著良好的開發(fā)前景，特別在畜禽安全健康養(yǎng)殖業(yè)和生產(chǎn)安全畜禽產(chǎn)品中有廣泛的應(yīng)用前景［6］。

黃酮類是辣蓼的主要活性成分，目前已從辣蓼的不同部位中分離得到金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、3＇－甲基槲皮素、7，4＇－二甲基槲皮素、異鼠李素、山萘酚、兒茶素、表兒茶素等［7－10］。根據(jù)設(shè)備與操作方式不同，總黃酮的提取方法可分為:滲漉法、浸漬法、索氏提取法、加熱回流提取法等，不同操作方法各有優(yōu)劣。本文分別比較熱水提取法、超聲提取法、乙醇加熱回流法、索氏提取法對辣蓼總黃酮的提取效率，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化提取工藝，獲得最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 蘆丁對照品(批號:100080－200707，中國食品藥品鑒定研究院，純度≥98%);亞硝酸鈉(分析純，批號20120314，上海凌峰化學試劑有限公司);硝酸鋁(分析純，批號 20120304－2，廣州化學試劑廠);氫氧化鈉(分析純，批號12082311422，南京化學試劑有限公司);甲醇(分析醇，批號2013062005，廣州市東紅化工廠);辣蓼(廣東廣州，批次201309)經(jīng)廣東藥學院李書淵教授鑒定為蓼科植物水辣蓼Polygonum hydropiper Linn.。藥材經(jīng)低溫干燥后，粉碎，過20目篩，備用。

1.2 儀器 UV－3100PC紫外－可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);BS 123S Sartorius萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);SHZD－D(Ⅲ)循環(huán)式水泵(鞏義市予華儀器有限責任公司);RE－5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DL－720A超聲波清洗器(600 w，上海之信儀器有限公司);KQ－100B型超聲波清洗器(100 w，控溫0～85℃，昆山市超聲儀器有限公司);HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州奧華儀器有限公司)。

1.3 總黃酮測定方法建立

1.3.1 線性關(guān)系考察

1.3.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品10 mg，精密稱量，置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，水浴40℃使溶解，放冷至室溫，加60%乙醇至刻度，搖勻，得蘆丁儲備液。精密量取5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每1 mL含蘆丁0.2 mg)。按NaNO2－Al(NO3)3－NaOH顯色體系進行顯色，精密量取對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加5% 亞硝酸鈉溶液1.00 mL，混勻，放置6min;再加10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻，放置6min;加氫氧化鈉溶液10.00 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白。

1.3.1.2 供試品溶液的制備 取樣品 1.0 g，精密稱定，提取次數(shù)為2次，過濾，合并兩次濾液。取濾液1.0 mL置于 25 mL容量瓶中，按上述 NaNO2－Al(NO3)3－NaOH顯色方法進行顯色，扣除背景后測定吸光度。

1.3.1.3 檢測波長的選擇 對照品溶液及供試液按以上顯色方法顯色后，按各自空白對照進行校準，在200～700 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.3.1.4 標準曲線的建立 以吸光度為縱坐標，蘆丁標準液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 方法學考察

1.3.2.1 精密度試驗 日內(nèi)精密度:取供試液1.25 mL于25 mL容量瓶中，顯色后于同一條件下測定6次吸光度，代入標準曲線，求得總黃酮濃度，計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來考察儀器日內(nèi)精密度。

日間精密度:取供試液1.25 mL于25 mL容量瓶中顯色后平行操作3份，測定吸光度，代入標準曲線，求得總黃酮濃度，同法連續(xù)操作3天，計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來考察儀器日間精密度。

1.3.2.2 穩(wěn)定性試驗 取供試液1.25 mL于25 mL容量瓶中，顯色后，定容，放置15 min后開始計時，于 0、10、20、30、40、50、60 min 后，測定吸光度值，利用標準曲線計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來考察樣品顯色后的穩(wěn)定時間。

1.3.2.3 重復性試驗 取供試品溶液1.25 mL于25 mL容量瓶中，顯色后平行操作6份，分別測定吸光度，代入標準曲線方程，計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來考察供試品的重復性。

1.3.2.4 加樣回收率試驗 平行取9份辣蓼粉末樣品，每份1.0g，精密稱定，平均分成3組，按供試品處理方法處理后，各取5.0 mL分別加入一定量的對照品，使加入量分別約為化合物原始含量的80%(低濃度組)、100%(中濃度組)、和 120%(高濃度組)，顯色后測定其吸光度，計算加標回收率及相應(yīng)的RSD值。

1.4 提取方法的篩選

1.4.1 熱水提取法 取辣蓼粉末100.00 g，第1次加8倍水浸泡2 h后，煎煮1.5 h，過濾，濾渣繼續(xù)加6倍水煎煮1 h，過濾，合并2次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，離心(3500 r/min，10 min)取上清液，濃縮至 1000 mL(生藥濃度 0.1 g/mL)。

1.4.2 超聲提取法 精密稱取辣蓼樣品10.0 g置于具塞錐形瓶中，加入200.0 mL 60%乙醇，浸泡2 h，80 ℃超聲處理30 min，離心，濾渣繼續(xù)加200.0 mL 60%乙醇，超聲30 min，離心，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL(生藥濃度0.1 g/mL)。

1.4.3 加熱回流提取法 精密稱取辣蓼樣品10.0 g置于500 mL圓底燒瓶中，精密加入200.0 mL 60%乙醇，88℃水浴加熱回流4 h，離心，濾渣繼續(xù)加200.0 mL 60%乙醇，回流4 h，離心，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL(生藥濃度0.1 g/mL)。

1.4.4 索氏提取法 精密稱取辣蓼樣品10.0 g于500 mL索氏回流管中，加入200.0 mL 60%乙醇，88℃水浴加熱回流4 h，離心，濾渣繼續(xù)加200.0 mL 60%乙醇，回流4 h，離心，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL(生藥濃度0.1 g/mL)。

1.5 提取工藝的優(yōu)化 以辣蓼總黃酮含量為考察指標，選擇乙醇濃度、料液比、提取時間及提取溫度作為考察超聲提取法的四個影響因素，按4因素3水平進行L9(34)正交試驗設(shè)計，因素水平見表1。

表1 辣蓼總黃酮提取工藝正交實驗因素水平Tab 1 The orthogonal experiment factor level of extraction of total Flavonoids from Polygonum hydropiper

1.6 驗證實驗 按照最佳工藝條件乙醇濃度60%，料液比1∶30，超聲提取時間50 min，超聲提取溫度80℃，進行重復實驗驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮測定方法建立

2.1.1 線性關(guān)系考察

2.1.1.1 檢測波長的選擇 由蘆丁和樣品的光譜圖可知，在波長為345 nm、510 nm處，溶液的吸光度達到兩個峰值，考慮到許多物質(zhì)(溶劑等非黃酮類物質(zhì))在345 nm左右均有吸收，雜質(zhì)干擾較大，故選擇510 nm作為最大吸收波長。蘆丁、供試品經(jīng)顯色后吸收曲線如圖1、2。

2.1.1.2 標準曲線的建立 以吸光度為縱坐標，蘆丁標準液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸，回歸方程為 y=12.003x+0.0037，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。蘆丁的標準曲線如圖3。

圖1 蘆丁顯色后吸收光譜圖Fig 1 Absorption spectra of Rutin after coloration

圖2 辣蓼供試品顯色后吸收光譜圖Fig 2 Absorption spectra of Polygonum hydropiper after coloration

圖3 蘆丁標準曲線圖Fig 3 Standard Curves of Rutin

2.1.2 方法學考察

2.1.2.1 精密度試驗 日內(nèi)精密度:同一條件下測定6次吸光度，代入標準曲線，求得總黃酮濃度，計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。日內(nèi)RSD=1.01%，試驗結(jié)果見表2。

2.1.2.2 日間精密度 平行操作3份，測定吸光度，同法連續(xù)操作3 d，計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。日間RSD=0.58%，試驗結(jié)果見表3。

表2 日內(nèi)精密性試驗結(jié)果Tab 2 The result of within－day precision test

表3 日間精密度試驗結(jié)果Tab 3 The result of intraday precision test

2.1.2.2 穩(wěn)定性試驗 分別于 0、10、20、30、40、50、60 min測定的吸光度值，利用標準曲線計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。結(jié)果顯示顯色后的供試品在40 min內(nèi)是穩(wěn)定的，超過 40 min后，RSD＞2.0%，吸光度明顯降低，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 4 The result of stability test

2.1.2.3 重復性試驗 平行操作6份，分別測定吸光度，代入標準曲線方程，計算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。結(jié)果見表5，RSD為1.45%，說明該方法的重復性良好。

表5 重復性試驗結(jié)果Tab 5 The result of reproducibility test

2.1.2.4 加樣回收率試驗 低濃度組、中濃度組和高濃度組分別顯色后測定其吸光度，計算加標回收率及相應(yīng)的RSD值。結(jié)果見表6，以蘆丁為對照品，檢測樣品的平均回收率，RSD＜2%(n=3)，均符合要求。

表6 加樣回收試驗結(jié)果(n=3)Tab 6 The result of recovery test

2.2 提取方法的篩選 不同提取方法的總黃酮含量總黃酮含量結(jié)果詳見表7，提取率從大到小依次為:超聲提取法＞加熱回流提取法＞索氏提取法＞熱水提取法，超聲提取法與加熱回流提取法總黃酮得率相差不大，但加熱回流提取時間長，能耗較大，所以本研究選用超聲提取法。

2.3 提取工藝的優(yōu)化 正交試驗中各因素和水平之間的9種組合方式及每組結(jié)果見表8。由表8可知，最佳提取工藝條件組合為:A2B3C3D3，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，可選擇A2B2C3D3即乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，超聲提取時間為50 min，超聲提取溫度為80℃。由RB＞RA＞RD＞RC得其因素影響順序為料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。

2.4 驗證實驗 按照最佳工藝條件乙醇濃度60%，料液比1∶30，超聲提取時間50 min，超聲提取溫度80℃，進行重復實驗驗證，驗證試驗結(jié)果見表9。從表9可看出，最佳提取工藝條件下RSD為0.68%，具有較好的重復性。

表7 辣蓼不同提取方法的總黃酮含量(單位:mg/g)Tab 7 The total flavonoid content of four kinds of method(unit:mg/g)

表8 辣蓼超聲提取法正交實驗k(34)設(shè)計及結(jié)果Tab 8 Design and result of orthogonal experiment of ultrasonic extraction

表9 辣蓼提取工藝最佳條件驗證(單位:mg/g)Tab 9 The result of verifying test(unit:mg/g)

3 討論與結(jié)論

根據(jù)設(shè)備與操作方式不同，總黃酮的提取方法可分為:滲漉法、浸漬法、索氏提取法、加熱回流提取法等，不同操作方法各有優(yōu)劣［11－14］。辣蓼中總黃酮的不同提取方法也有很多文獻報道，羅文涓［15］等采用浸提法、水煎醇沉法、超聲法、超聲酶解法(加纖維素酶)、超聲酶解法(加果膠酶)和超聲配合酶解法進行辣蓼總黃酮的提取，結(jié)果表明，超聲法能耗低、得率高，所得的黃酮種類多于浸提法與水煎醇沉法。利用超聲提取配合酶解法對辣蓼總黃酮進行提取，得到的黃酮母體結(jié)構(gòu)具有多樣性，因此，采用超聲提取配合酶解法獲得的辣蓼總黃酮得率最高。

實驗采用熱水提取法、超聲提取法、乙醇加熱回流法、索氏提取法分別對辣蓼總黃酮進行提取，最終總黃酮含量從大到小依次為超聲提取法(52.90 mg/g)＞加熱回流提取法(50.97 mg/g)＞索氏提取法(41.80 mg/g)＞熱水提取法(17.97 mg/g)。其中熱水提取法為最傳統(tǒng)的水煎煮法，不借助任何儀器，也無需添加任何溶劑，因此提取率最低;超聲提取法為超聲輔助醇提法，無論是有效物質(zhì)的釋放，還是釋放后的溶解性都比水煎煮法要顯著高出很多;而加熱回流法和索氏提取法都是借用不同裝置和處理進行的醇提法，提取總黃酮含量比超聲提取法略低。熱水提取法操作簡便，試劑廉價易得，但提取率太低;索氏提取法無論在提取率方面還是節(jié)約資源方面都并不理想;加熱回流提取法與超聲提取法總黃酮得率相差不大，但加熱回流法兩次提取共耗時超過8 h，且能耗大，超聲提取大大縮短了提取時間(只需1 h)，提取充分，能耗低，操作方便，是較為理想的提取辣蓼總黃酮的方法，所以本次研究最終選用超聲提取法進行優(yōu)化。

正交實驗結(jié)果顯示因素影響順序為料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間，乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，超聲提取時間為50 min，超聲提取溫度為80℃時，總黃酮提取濃度最高，為53.3 mg/g。這與張晶［16］等人利用單因素試驗和正交試驗得出的超聲波輔助提取辣蓼中總黃酮條件略有不同，但與其可提取到的黃酮類化合物含量(55.8 mg/g)相差不大，這可能是因為不同產(chǎn)地的辣蓼對不同條件的適應(yīng)性不一樣，但超聲處理均可有助于辣蓼中總黃酮的釋放和提取。