一株大蒜根際細(xì)菌特性研究及其對田間大蒜產(chǎn)量和土壤酶活性的影響

崔 曼，尹彥舒，張夢琦，卜 寧，陳云云，高 淼*，馬蓮菊*

（1．沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實驗室，北京 100081）

植物根際促生細(xì)菌（PGPR）是定殖在植物根部周圍，具有促進(jìn)植物生長，增加植物產(chǎn)量，抵抗植物病害等功能的一類有益菌群［1-2］。大部分PGPR具有生物固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等特性及生防作用或其中之一的某種特性［3］。根際環(huán)境中，植物與微生物形成的有益關(guān)系可使植物健康生長并且維持土壤肥力［4］。近年來植物根際促生菌的篩選成為研究熱點(diǎn)［5］。到目前為止關(guān)于PGPR的報道遍布國內(nèi)外，其中包括常見的芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、固氮菌屬（Azotobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等［1-2，6-10］。大蒜是一種忌連作的蔬菜，作物連作是導(dǎo)致大蒜品質(zhì)和產(chǎn)量下降的主要因素。連作障礙產(chǎn)生的主要原因是由于土壤養(yǎng)分元素的不均衡、化感物質(zhì)積累、土壤微生態(tài)及微生物區(qū)系變化等方面導(dǎo)致的［11］。前人研究發(fā)現(xiàn)，大蒜連作15～20年后，可導(dǎo)致土壤中酶活性降低，產(chǎn)生明顯的連作障礙現(xiàn)象［12］。連作障礙產(chǎn)生后，大蒜根腐病的發(fā)病情況也隨之增加［13］。本研究中的根際細(xì)菌為前期實驗室人員在山東省金鄉(xiāng)縣大蒜田中收集的連作大蒜根際土壤，在連作土壤中分離獲得的根際細(xì)菌。篩選出對大蒜根腐病和其他植物上的病害病原菌具有拮抗作用的菌株進(jìn)行功能特性、田間增產(chǎn)及對土壤有改良作用的菌株，為更好的改善土壤，解決大蒜產(chǎn)量及病害等多重問題發(fā)掘潛在菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

根際微生物：連作大蒜根部中分離純化的細(xì)菌。

大蒜根腐病病原真菌：H5（Setophoma terrestris）為前期實驗室人員在有根腐病的大蒜根部分離得到的大蒜病原真菌，H9（Fusarium solani）由中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

對峙檢驗：PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 L，瓊脂 15 ～ 20 g，pH 值 7.0。

產(chǎn) HCN 能力檢驗：King’s B 培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，甘油 10 mL［14］，1.8% 瓊脂，蛋白胨 20 g，pH 值 7.2。

產(chǎn)蛋白酶能力檢驗：蛋白酶檢測培養(yǎng)基［14］。

溶解磷能力檢驗：溶解有機(jī)磷能力：有機(jī)磷卵黃培養(yǎng)基［14］；溶解無機(jī)磷能力：無機(jī)磷培養(yǎng)基［14］。

IAA能力測定：DF培養(yǎng)基［14］。

ACC 能力測定：ADF 培養(yǎng)基［14］。

固氮能力檢驗：無氮培養(yǎng)基［15］。

1.3 測定菌株對病原真菌的拮抗能力

采用兩點(diǎn)對峙法［16］。在PDA平板上，用直徑5 mm打孔器取大蒜根腐病病原真菌菌餅接于距離平板圓2 cm處的一點(diǎn)上，在同一直線距圓心等距反方向的另一點(diǎn)上滴加 2 μL待測菌液，每組設(shè)置3個重復(fù)。H9及處理置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，H5及處理置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，測定抑菌半徑，計算抑菌率。

抑菌直徑和抑菌率計算公式：

抑菌直徑=對照菌落直徑-處理菌落直徑

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100

1.4 菌株16S rRNA基因序列測定

1.4.1 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增

取單菌落，于裝有100 μL 無菌水的EP管中混勻，95℃水浴15 min后，于-20℃冰箱冷凍1 min，12 000 r/min 條件下離心 2 min，4℃冰箱保存，模板為上清液［14］。PCR 擴(kuò)增引物采用通用引物。擴(kuò)增后的樣品送往北京生工有限公司進(jìn)行測序，在EzTaxon數(shù)據(jù)庫上將獲得的序列進(jìn)行序列比對。

1.4.2 菌株gyrB基因的PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌DNA試劑盒方法提取菌株DNA，引物為：UP-1和UP-2r。反應(yīng)過程為：95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，30 個循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增后的樣品處理同 1.4.1。

1.5 菌株促生特性測定及方法

1.5.1 溶解磷能力測定

收集了2 μL的細(xì)菌懸浮液，然后將其接到有機(jī)磷和無機(jī)磷培養(yǎng)基中。Ca3（PO4）2作為無機(jī)磷源，新鮮蛋黃溶液作為有機(jī)磷源。每組3次重復(fù)，放入培養(yǎng)箱28℃，14 d。是否有透明圈圍繞形成，來判定其是否具有溶解磷的能力。

1.5.2 固氮能力測定

挑取單菌落在無氮平板上劃線，28℃培養(yǎng)，在第3 d時觀察平板上菌株生長狀況，菌落可在無氮培養(yǎng)基中生長表示其具有固氮能力。對有固氮能力的細(xì)菌進(jìn)行乙炔還原法測定固氮酶活性［17］。并對具有固氮酶活性的菌株進(jìn)行nifH基因的擴(kuò)增，反應(yīng)過程為：95℃ 1 min。58℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35個循環(huán)。

固 氮 酶 活 性［nmol/（mg·h），protein］=C2H4（nmol）/［菌體蛋白量（mg，protein）× 反應(yīng)時間（h）］。

1.5.3 IAA能力測定

IAA產(chǎn)生的能力用比色法測定［18］。在DF培養(yǎng)基中接種菌株生長24 h后轉(zhuǎn)移到含有0.1% L色氨酸的DF培養(yǎng)基中。置于28℃培養(yǎng)箱中，7 d后，8 000 r/min 離心 10 min。

懸浮液與Fe-H2SO4溶液（1∶2）混合，暗室放置45 min，通過測量450 nm處樣品吸光度和標(biāo)準(zhǔn)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 ACC脫氨酶活性菌株的篩選

參考 Glick［19］的方法，在 5 mL固氮液體培養(yǎng)基上接入菌種，28℃ 200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 d，吸取0.1 mL懸浮液至5 mL的DF培養(yǎng)基中，同條件繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，吸取0.1 mL懸浮液至5 mL的ADF培養(yǎng)基中，同條件繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d。將可在ADF培養(yǎng)基中生長的菌種再轉(zhuǎn)接一次，用不含ACC的ADF培養(yǎng)基為陰性對照。分別以不接菌的ADF和不含ACC的ADF培養(yǎng)基為對照，測定600 nm處菌液的吸光度值，確定ACC脫氨酶的陽性菌株。

1.5.5 產(chǎn)鐵載體能力檢測

采用藍(lán)色定性檢測培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行定性測定［20］。在CAS試驗板上能產(chǎn)生橙色暈圈的菌株被鑒定為可產(chǎn)鐵載體的陽性菌株。具有產(chǎn)鐵載體能力。

1.6 田間接種

在田間小區(qū)（每個小區(qū)6 m2）中設(shè)置2組試驗：第一組：施用DS7菌劑；第二組：不施用DS7菌劑的對照組。每塊小區(qū)前后間隔5 m，每組試驗進(jìn)行3個平行重復(fù)。

1.7 土壤樣品采集和酶活性測定

用蛇形5點(diǎn)采樣法，在田間小區(qū)中采集5～20 cm土樣，用于土壤酶活性的測定。播種前在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)取樣，采集大蒜根際土壤樣品。

采用高錳酸鉀滴定法測定土壤過氧化氫酶活性；采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性；土壤蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法測定［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

供試根際細(xì)菌為前期在山東省金鄉(xiāng)縣大蒜田中采集的連作大蒜根際土壤中分離純化的細(xì)菌，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行對峙實驗，經(jīng)兩點(diǎn)對峙實驗，發(fā)現(xiàn)菌株DS7對兩種大蒜根腐病病原真菌均有拮抗效果，DS7對H5（Setophoma terrestris）抑制率達(dá)到 51.72%，對 H9（Fusarium solani）抑制率達(dá)到42.31%（圖 1）。

圖1 菌株DS7對大蒜根腐病病原真菌的拮抗能力

2.2 菌株DS7的16S rRNA基因序列分析

將菌株DS7基于16S rDNA獲得的基因序列和基于gyrB獲得的基因序列，分別與相近種屬的基因序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對后，根據(jù)鄰近法則結(jié)合MEGA 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖2、圖3。結(jié)合其菌落形態(tài)確定菌株DS7為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）［22］。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株DS7系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 基于gyrB基因序列構(gòu)建菌株DS7系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 菌株DS7的功能特性研究

菌株DS7能在蛋白酶檢測平板上出現(xiàn)明顯透明水解圈，表明其具有蛋白水解能力；在 King’s B 培養(yǎng)基上，含菌株DS7的濾紙出現(xiàn)深黃色變化，說明其具有產(chǎn)HCN能力；菌株DS7可以使CAS 藍(lán)色檢測液產(chǎn)生橘黃色透明圈，說明其具有產(chǎn)鐵載體能力。DS7具有產(chǎn)鐵載體的能力；具有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力；具有水解蛋白能力；有產(chǎn)IAA能力；不具有產(chǎn)生ACC脫氨酶的能力，結(jié)果如表1所示。菌株DS7在平板上的情況，如圖4所示。

表1 菌株Bacillus sp. DS7的功能機(jī)制

圖 4 菌株 Bacillus sp. DS7 的功能特性

DS7可以在無氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其固氮酶活性為（0.41±0.09）nmol/（mg·h）；菌株和陽性對照固氮菌株的固氮酶nifH基因擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示。從分子學(xué)角度上再一次確定菌株DS7為固氮菌，具有固氮能力。

圖5 菌株 Bacillus sp. DS7固氮酶nifH基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 接種菌株DS7對田間大蒜產(chǎn)量的影響

田間測產(chǎn)結(jié)果如表2，施用DS7菌劑后大蒜的產(chǎn)量比不施用任何產(chǎn)品的對照組的大蒜產(chǎn)量增加約15.42%。

表2 田間測產(chǎn)結(jié)果

2.5 接種菌株DS7對田間大蒜根際土壤酶活性的影響

測量接種菌株DS7后土壤中的蔗糖酶活性、過氧化氫酶活性和脲酶活性3種指標(biāo)檢測土壤酶活性。接種DS7菌液后，土壤蔗糖酶活性相對于對照組提高12.95%，可見接種DS7菌液后土壤肥力有所提高并改善。過氧化氫酶活性并沒有提高，反而降低2.75%，土壤中微生物的生命活動速度減慢，可能因為接種DS7后會抑制土壤中其他微生物的活動。接種DS7可加速氨的生成，與對照組相比增長率為6.80%，結(jié)果見表3。

表3 土壤酶活性結(jié)果

3 結(jié)論與討論

植物根際促生菌（PGPR）在植物生長過程中對植物生長來說是一類有意義的菌群，PGPR在植物的根莖或根表面定殖，通過吸收礦物質(zhì)的方式來幫助植物快速生長［23］。目前常用的根際微生物是具有生物防治功能的促生菌［24］，例如：假單胞菌屬（pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium），這些微生物大多具有防病促生功能，可以有效用于防治植物病害。部分PGPR在對植物促生時可對土壤進(jìn)行修復(fù)［25］，所以在肥料開發(fā)的過程中充分利用PGPR的功能特性是解決田間植物生長、土壤修復(fù)等問題的一種環(huán)保的方法。在實際生產(chǎn)中已出現(xiàn)商家利用PGPR做成肥料并投入生產(chǎn)的情況［26］。芽孢桿菌屬主要應(yīng)用在田間農(nóng)蔬作物，前期對種子進(jìn)行處理，可防治各種苗期出現(xiàn)的病害［27］。王娜娜［28］從白皮大蒜中共分離出62株內(nèi)生菌對4種病原菌都具有拮抗作用，其中芽孢桿菌屬的數(shù)量占到84.2%。解淀粉芽孢桿菌對果蔬上的病原菌有很好的防治效果，例如：山茶灰斑病，獼猴桃灰霉病等［29-30］。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有抑制真菌和細(xì)菌的活性的作用，與菌株在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有關(guān)［31］。本研究篩選到的根際細(xì)菌DS7（Bacillus amyloliquefaciens）對大蒜根腐病病原菌抑制效果：對H5（Setophoma terrestris）抑制率達(dá)到51.72%，對H9（Fusarium solani）抑制率達(dá)到42.31%，實驗結(jié)果表明，菌株DS7對大蒜根腐病病害具有較好拮抗效果。

產(chǎn)鐵載體的PGPR能吸收土壤中的鐵元素提供給植物，還能夠抑制病原菌繁殖［32］。具備固氮能力、溶解磷能力的根際微生物，可以為自身和植物在一定程度上提供可利用的氮和磷，加快植物的生長速度［33-34］。PGPR菌，例如：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），能促進(jìn)玉米生長，具有溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷，分泌IAA能力［35］。Burkholderia sp.7016具有固氮、溶磷、產(chǎn)ACC脫氨酶，促進(jìn)番茄生長及拮抗番茄土傳病害等多種功能特性［33］。本實驗研究篩選出的DS7具有多種功能特性：水解蛋白、產(chǎn)鐵載體、固氮、溶解有機(jī)磷、無機(jī)磷和產(chǎn)IAA的能力。土壤酶活性反映了土壤中營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化以及土壤生物的生命活動能力的強(qiáng)弱。土壤中的酶活性與土壤中各種代謝過程和能量轉(zhuǎn)換息息相關(guān)［36-37］，是土壤生物化學(xué)特征的重要組成部分。在評價土壤肥力、環(huán)境監(jiān)測、衡量土地利用等方面有廣泛的作用，可為土壤健康管理提供科學(xué)依據(jù)［38］。土壤中脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、土壤全氮、速效氮等密切相關(guān)［39］；蔗糖酶是一種重要水解酶，蔗糖酶斷裂蔗糖分子鍵后產(chǎn)生葡萄糖、果糖，為植物和微生物提供營養(yǎng)的碳源［40］。土壤過氧化氫酶活性與土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動相關(guān)，能有效防止過氧化氫的毒害，是重要的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子［40-42］。趙晶等［43］發(fā)現(xiàn)長期施用有機(jī)肥能夠增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，并且與土壤脲酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性呈相關(guān)性。接種類芽孢桿菌（Paenibacillus spp.）后土壤酶活性與植物的生物量呈正相關(guān)，能夠提高土壤質(zhì)量，同時具有促進(jìn)植物產(chǎn)量功能［44］。田間試驗結(jié)果可看出，接種DS7（Bacillus amyloliquefaciens）后大蒜產(chǎn)量比對照組增產(chǎn)15.42%，接種DS7有助于提高產(chǎn)量。收集接種過DS7菌液的土壤和未做處理的對照組土壤，測定土壤中酶的活性，從過氧化氫酶活性指標(biāo)可看出，DS7可能會抑制土壤中某些細(xì)菌的生命活動。但通過蔗糖酶活性及脲酶活性可看出，DS7可幫助土壤加快氨的轉(zhuǎn)化速率，改善土壤肥力，起到改良土壤的作用。因此，DS7具備多種功效，對大蒜根腐病病原真菌有良好的拮抗效果，在增產(chǎn)的同時可以改善土壤肥力，是一種良好的微生物肥料資源菌種。