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    菲脅迫下蒿柳抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)

    2020-04-21 04:00:22馬曉東鄒竣竹周曉星孫振元
    林業(yè)科學(xué)研究 2020年2期
    關(guān)鍵詞:抗氧化劑活性氧抗氧化

    李 霞,馬曉東,鄒竣竹,周曉星,孫振元,韓 蕾*

    (1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所,國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100091;2. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院(牡丹學(xué)院),山東 菏澤 274000;3. 岳陽市林業(yè)科學(xué)研究所,湖南 岳陽 414000)

    人類的生存環(huán)境離不開地表水體和土壤,然而,由于工業(yè)化進(jìn)程的加速,有害物質(zhì)的種類和數(shù)量急劇增加,破壞生態(tài)平衡,且易通過食物鏈的富集作用危及人類健康。多環(huán)芳烴(PAHs)具有難降解性、毒性(致癌、致突變、致畸效應(yīng))和生物蓄積性[1-2],是各國優(yōu)先控制的一類污染物,美國國家環(huán)保局(EPA)將萘、菲、芘、苯并[α]芘等16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物[3]。在中國東部109個農(nóng)業(yè)土壤點(diǎn)收集的表層土壤樣本中,PAHs的總濃度從 8.8 到 3 880 μg·kg-1不等[4]。菲是三環(huán)的PAHs類,主要來源于焦化廠、煉油廠等企業(yè)生產(chǎn)的廢水、廢氣及汽車的尾氣排放、垃圾焚燒等,是PAHs的代表,通常在土壤、水體和沉積物中的含量較高。

    植物修復(fù)是一種利用根系和地上部分修復(fù)污染土壤和沉積物的低成本修復(fù)技術(shù),近年來得到了廣泛的研究;但目前植物修復(fù)多環(huán)芳烴的研究多以草本植物為主,而木本植物具有生物量大、根系發(fā)達(dá)及地上部分可多年生長等優(yōu)點(diǎn)。生長較快的洋白蠟(Fraxinus pennsylvanicaMarsh.) 、 DN 34楊(Populus deltoidesMarsh.×P. nigraL. DN 34)和黑柳(Salix nigraMarsh.)相比,黑柳對土壤中PAHs的降解率最高[5]。Hultgren等[6]溫室實(shí)驗(yàn)表明,蒿柳(Salix viminalisL.)種植土壤中菲和芘的降解率分別是沒有植物存在的1.47倍和1.27倍。

    植物在修復(fù)PAHs的過程中,應(yīng)能承受由污染物引起的脅迫,但高濃度PAHs對植物具有毒害作用,導(dǎo)致其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及代謝紊亂[7],甚至死亡[8]?;钚匝酰≧OS)是逆境下破壞植物防御系統(tǒng),使細(xì)胞中毒死亡的重要因素,而抗氧化系統(tǒng)(AOS)在活性氧的清除中起重要作用,常被用于植物的抗性評價[9]。關(guān)于植物對PAHs脅迫活性氧生成及抗氧化反應(yīng)的研究有少量報道,如Salehi-Lisar等[10]用芴處理小麥(Triticunt aestivumL.)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)和向日葵(Helianthus annuusL.),認(rèn)為過氧化氫酶(CAT)是植物抵御脅迫的重要酶。Weisman等[11]研究表明,PAHs可誘導(dǎo)擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性增加。Shen等[7]認(rèn)為,類胡蘿卜素和超氧化物歧化酶(SOD)是菲脅迫下參與活性氧清除的最有效的抗氧化劑。這些報道表明了抗氧化系統(tǒng)和PAHs之間的關(guān)系,但關(guān)于木本植物這方面的研究未見報道,而揭示植物膜脂過氧化的原因及關(guān)鍵抗氧化劑的響應(yīng)是提高植物在PAHs污染環(huán)境中抗性的關(guān)鍵。因此,本研究以蒿柳為研究對象,通過前期濃度篩選試驗(yàn)得出其在1.0 mg·L-1菲處理下,植物的生長及根系生理指標(biāo)受到顯著影響,因此,研究該濃度下抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng),為提高木本植物在PAHs脅迫下的抗性及加強(qiáng)修復(fù)效應(yīng)的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試植物

    選取蒿柳同一無性系、直徑為(1.0±0.2)cm的1年生枝條,在水中剪成10 cm長插條,扦插在灰色塑料箱(容量20 L)內(nèi),用PVC板支撐并用海綿固定。用自來水培養(yǎng)2周后抹芽,保留1個枝芽,改用1/2 Hoaglang營養(yǎng)液培養(yǎng),每3 d換1次營養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)在玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行,自然光照。

    1.2 有機(jī)污染試劑

    供試有機(jī)污染物為菲(純度>97%),其分子量 為 178.238 g·mol-1, 25℃ 純 水 中 溶 解 度 為7.3 μmol·L-1,辛醇-水分配系數(shù)(LogKow)為 4.46。用甲醇(色譜純)做溶劑配制菲的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.3 試驗(yàn)設(shè)計

    將長勢一致的植株移入玻璃容器中適應(yīng)1周后處理。菲標(biāo)準(zhǔn)溶液與蒸餾水配制的改良1/2Hoagland營養(yǎng)液混合,配制成菲濃度為1.0 mg·L-1的處理液,以未加菲的蒸餾水配制的改良1/2 Hoagland營養(yǎng)液為對照,pH值為6.0,處理液中甲醇的濃度為 0.05%。Chapin等[12]報道,甲醇濃度小于0.1%的營養(yǎng)液對植物根系生長沒有影響。每個處理3個重復(fù),每個重復(fù)15根插條。容器外壁用錫箔紙包裹,保持根系和溶液避光且防止菲的光降解,每2 d更換1次處理液,每4 d隨機(jī)交換容器在溫室中的位置。自然光照,對培養(yǎng)液全程通氧。分別于試驗(yàn)第0、4、8、12、16天采樣,測定葉片的O2·-生成速率、H2O2含量,SOD、過氧化物酶(POD)、CAT、GST、谷胱甘肽還原酶(GR)的活性,還原型谷胱甘肽(GSH)、還原型抗壞血酸(AsA)以及丙二醛(MDA)的含量。

    1.4 指標(biāo)測定方法

    1.4.1 O2·-生成速率和H2O2的測定及原位染色每個重復(fù)將3棵植株中上部葉片剪碎混勻,放入液氮迅速冷凍并研磨。每個重復(fù)稱取0.1 g,O2·-生成速率的定量測定采用鹽酸羥胺法[13],H2O2含量的測定參考Brennan等[14]的方法進(jìn)行。原位染色取上部第7~9片成熟葉,用打孔器形成圓形葉盤(直徑1 cm),采用NBT染色法測定O2·-(圖1A),DAB染色法測定H2O2(圖1B)。

    1.4.2 抗氧化物質(zhì)及MDA含量的測定 取樣方法同1.4.1節(jié)。SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法[15];POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[16];CAT活性測定采用紫外吸收法[17];GST活性測定參考Habdous等[18]的方法;GR活性測定采用Parida等[19]的試驗(yàn)方法。GSH含量測定參考Baker等[20]的方法;AsA含量測定參考Foyer等[21]的方法。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[22]。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    用Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,用GraphPad PrismVersion7.0( GraphPad software, La Jolla,CA,USA)對測定數(shù)據(jù)作圖,并進(jìn)行單因素、雙因素方差分析和多重比較。圖中數(shù)據(jù)均為重復(fù)測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菲脅迫下 O2·-生成速率和 H2O2的變化

    圖1表明:O2·-生成速率與H2O2均在菲處理后即大幅度增加。O2·-生成速率在處理后一直極顯著高于對照(p<0.01),其中,第4天上升最快,為對照的2.42倍,之后有所下降。H2O2在菲處理后第4天和第8天與對照達(dá)極顯著差異(p<0.01),分別為對照的1.95倍和1.92倍,之后呈下降趨勢,處理第16天時與對照相比無顯著差異(p>0.05)。

    圖 1 菲處理下蒿柳活性氧的動態(tài)變化Fig. 1 Changes of ROS contents under phenanthrene treatment

    2.2 菲脅迫下SOD、POD和CAT活性的變化

    圖2 表明:菲脅迫下,SOD、POD和CAT活性均升高。與對照相比,SOD活性和POD活性均在處理第8天出現(xiàn)顯著變化(p<0.05),分別為對照的1.32和1.23倍,之后 SOD的變化不大,POD一直升高,第16天時達(dá)到最高,為對照的2.03倍。CAT在處理第4天迅速升高,為對照的2.69倍,之后出現(xiàn)下降,但與對照相比一直呈顯著(p<0.05)或極顯著差異(p<0.01)。

    圖 2 菲處理下蒿柳SOD、POD、CAT活性的變化Fig. 2 Changes of SOD、POD、CAT activity under phenanthrene treatment

    2.3 菲脅迫下GST和GR活性的變化

    圖3 表明:菲處理后,GST和GR活性均上升;GST活性在處理第4天和第8天與對照相比差異不顯著,第12~16天迅速上升,第16天時為對照的1.94倍,差異極顯著(p<0.01)。GR活性在處理后即迅速上升,與對照相比呈極顯著差異(p<0.01),第16天為對照的2.24倍。

    2.4 菲脅迫下GSH和AsA含量的變化

    圖4表明:菲處理后,GSH含量迅速升高,且一直處于較高水平,與對照相比呈極顯著差異(p<0.01),最大為對照的2.43倍。AsA的含量處理后即低于對照,第4天時為對照的60.6%,但隨著脅迫時間的延長呈上升趨勢,第16天時高于對照(p<0.01),為對照的1.23倍。

    圖 3 菲處理下蒿柳GST和GR活性的變化Fig. 3 Changes of GST and GR activity under phenanthrene treatment

    圖 4 菲處理下蒿柳GSH和AsA含量的變化Fig. 4 Changes of GSH and AsA contents under phenanthrene treatment

    2.5 菲脅迫下MDA含量的變化

    圖5 表明:菲脅迫下,MDA含量一直高于對照,第8天上升最快,與對照相比差異極顯著(p<0.01),為對照的1.24倍,第16天時有所下降,為對照的1.14倍。

    圖 5 菲處理下蒿柳MDA含量的變化Fig. 5 Changes of MDA contents under phenanthrene treatment

    3 討論

    3.1 菲脅迫下活性氧的動態(tài)變化

    植物遭受脅迫后往往體內(nèi)活性氧增加,主要包括 O2·-、 H2O2、 單 線 態(tài) 氧 (1O2) 和 羥 自 由 基(·OH)。O2·-和H2O2能直接氧化細(xì)胞內(nèi)的許多組分,破壞生物大分子,造成膜脂過氧化。本試驗(yàn)中,O2·-生成速率在菲處理后一直高于對照,這是因?yàn)镻AHs被植物吸收后首先在體內(nèi)發(fā)生羥基化反應(yīng),單加氧酶(如細(xì)胞色素P-450)可使單環(huán)和PAHs轉(zhuǎn)化為羥基化合物,在此過程中可能把電子漏給O2形成O2·-,或者在無氧條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)形成超氧化物和過氧化物[23-24]。隨著處理時間的延長,O2·-生成速率的增加量有所下降,這與SOD活性的升高有關(guān),SOD歧化O2·-生成H2O2,但SOD的升高不足以清除產(chǎn)生的O2·-,因此,O2·-一直高于對照。菲處理后H2O2含量迅速升高,之后一直下降,最后與對照無顯著差異,這說明CAT和POD活性的上升可以清除多余的H2O2。較高濃度的H2O2可以在過氧化物酶體和乙醇酸循環(huán)中被CAT催化轉(zhuǎn)化為O2和H2O,而在不含CAT的葉綠體、細(xì)胞質(zhì)及含CAT很少的線粒體中,H2O2又在POD的催化下反應(yīng)生成O2和H2O[25]。

    3.2 菲脅迫下抗氧化物質(zhì)的動態(tài)變化

    誘導(dǎo)植物氧化應(yīng)激是PAHs已知的效應(yīng)[26],研究表明,抗氧化酶對PAHs有不同的響應(yīng),依據(jù)植物種類和PAHs的濃度而不同。擬南芥在0、0.25、0.5 mmol·L-1菲處理下,CAT活性無顯著變化,SOD和POD活性上升[27]。在熒蒽處理下,擬南芥隨熒蒽濃度的升高葉片SOD活性提高,GSH、H2O2和MDA含量均有不同程度的增加[28]。本試驗(yàn)中,3種酶活性在菲處理后都升高,對于緩解氧化脅迫起重要作用。SOD以O(shè)2·-為底物,將其歧化為H2O2。CAT可直接清除H2O2,是早期反應(yīng)的重要保護(hù)酶。POD則有不同的反應(yīng)機(jī)制,Chroma等[29]研究得出,POD和細(xì)胞色素P450這2種酶系統(tǒng)在植物體內(nèi)對外源物質(zhì)多氯聯(lián)苯(PCBs)和PAHs的解毒機(jī)制中都有部分參與。本研究中,POD與H2O2成顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),POD可能利用H2O2氧化菲或其代謝中間產(chǎn)物,使其變成低毒或無毒的物質(zhì),這與Gao等[30]的研究結(jié)果一致。

    GSH和AsA是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑。本試驗(yàn)中,菲處理后GSH含量迅速上升,GR的活性上升使蒿柳保持較高的GSH含量。GSH除清除活性氧外以外,對有毒的外來化合物具有解毒作用,是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分[31]。GST專一催化GSH的巰基與其它化合物的親電基團(tuán)作用,生成谷胱甘肽衍生物[32]。本試驗(yàn)中,菲誘導(dǎo)了GST活性上升,且在第16天時達(dá)到對照的2.1倍,說明隨著菲向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)增多,經(jīng)細(xì)胞色素第一步代謝后,代謝生成的羥基化合物等中間產(chǎn)物可以在GST的催化下與GSH結(jié)合,從而達(dá)到解毒的目的。AsA含量與對照相比降低,Caviglia等[33]也報道了類似的結(jié)果,長期(2周和4周)施用除草劑百草枯后,植物組織中的抗氧化劑濃度顯著降低,植物組織產(chǎn)生大量草酸鈣,草酸鈣的前體是抗壞血酸。這是因?yàn)橹参锝M織中的AsA可以被在細(xì)胞中積累的H2O2迅速轉(zhuǎn)化。Wieczorek等[34]把蒽和苯并[k]熒蒽噴灑在芹菜葉片上,導(dǎo)致AsA含量降低,總酸含量升高,可以間接證明這種轉(zhuǎn)化。本研究在處理過程中,雖然AsA低于對照,但一直呈上升趨勢,而H2O2的含量一直下降,間接證明了這種相關(guān)性。

    3.3 菲脅迫下MDA的動態(tài)變化

    MDA含量是活性氧積累和脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物[35],通常用于說明植物對氧化應(yīng)激的敏感性[36]。植物中PAHs毒性引起的MDA積累在擬南芥和菜心(Brassica campestrisvar.campestrisL.)中已有報道[27,37]。本研究中,MDA在脅迫過程中一開始上升,后呈下降趨勢,這與Salehi-Lisar等[10]用芴處理下盆栽小麥、紫花苜蓿和向日葵的研究結(jié)果一致。這是由于蒿柳在一開始產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),應(yīng)激條件下的代謝失衡導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生,活性氧作為信號分子被傳導(dǎo)到植物體內(nèi),觸發(fā)抗氧化系統(tǒng)的防御機(jī)制,從而達(dá)到適應(yīng)環(huán)境的目的,從而緩解應(yīng)激條件[36,38]。

    4 結(jié)論

    PAHs是一種能誘導(dǎo)蒿柳葉片細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的污染物。菲處理下,首先,O2·-和H2O2大量增加,MDA含量升高,蒿柳表現(xiàn)出積極的防御措施,表現(xiàn)為抗氧化酶和抗氧化劑的上升;SOD活性升高,但不足以清除多余的 O2·-,O2·-是造成細(xì)胞膜脂過氧化的主要活性氧;CAT與POD的升高可以清除菲脅迫下產(chǎn)生的過量H2O2,對于緩解氧化脅迫起重要作用,其中,CAT是蒿柳早期響應(yīng)的重要標(biāo)志物;抗氧化劑中,GSH對PAHs的反應(yīng)最敏感,GSH是蒿柳應(yīng)對菲脅迫的重要抗氧化劑,并通過GST的催化對植物體內(nèi)菲的代謝中間產(chǎn)物進(jìn)行解毒。

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