中國(guó)綠水?？箟难徇^氧化物酶基因的克隆、抗體制備及表達(dá)分析

張 行 田曉曉 董文芳 王茹夢(mèng) 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000)

即使在最適條件下, 植物的葉綠體、線粒體以及與生物膜偶聯(lián)的電子傳輸系統(tǒng)都能產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)[1—3], 根據(jù)是否含有靜電荷可分為自由基ROS (含靜電荷)和非自由基ROS(不含靜電荷), 其中H2O2是相對(duì)穩(wěn)定的非自由基ROS。在正常生理狀態(tài), 包括H2O2在內(nèi)的ROS作為光合氧化碳循環(huán)及光呼吸作用等代謝途徑副產(chǎn)物在植物細(xì)胞中不斷合成[4, 5]; 而在病原體感染、植株被外力傷害、紫外線輻射、強(qiáng)光輻射、干旱、鹽堿腐蝕及溫度劇烈變化等生物或非生物壓力脅迫時(shí), 植物細(xì)胞內(nèi)ROS含量會(huì)明顯增加即所謂的氧化迸發(fā)[6]。ROS在細(xì)胞內(nèi)的累積會(huì)引起氧化壓力, 從而對(duì)蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生氧化性損傷, 因此ROS的產(chǎn)生和清除之間的平衡對(duì)于保持植物細(xì)胞正常生理功能非常關(guān)鍵[7, 8]。植物細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)是抵抗ROS的主要因子, 其中APX是植物細(xì)胞清除H2O2代表性的抗氧化酶[9]。APX利用抗壞血酸(Ascorbate, AsA)作為特殊電子供體將H2O2還原為H2O, 同時(shí)伴隨著單脫氫抗壞血酸(Monodehydroascorbate, MDAsA)的產(chǎn)生。植物細(xì)胞有2種途徑可以把MDAsA還原成AsA。第一種途徑是通過NAD (P)H依賴的單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAsA reductase)的作用直接把MDAsA還原成AsA; 第二種途徑是MDAsA可以自發(fā)地轉(zhuǎn)變成AsA和脫氫抗壞血酸(Dehydroascorbate, DAsA), 接著脫氫抗壞血酸還原酶(DAsA reductase)利用谷胱甘肽(Glutathione, GSH)把DAsA還原成AsA, 而被氧化的GSH再通過GSH還原酶的作用被還原成GSH[10]。因此, 植物細(xì)胞清除H2O2主要賴以APX與AsA-GSH循環(huán)的協(xié)同作用。

綜上所述, APX是植物細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶,還由于目前已鑒定的APX酶蛋白或克隆到的APX基因絕大部分來(lái)自植物界物種[11], 所以一般認(rèn)為APX是植物界特有的蛋白。盡管如此, 在非植物界的少量物種中也發(fā)現(xiàn)了APX蛋白或APX基因[12, 13],Mathews等[12]通過生物化學(xué)方法測(cè)定到了棉鈴蟲(Helicoverpa zea)整體勻漿液具有APX活性, 這是在動(dòng)物體中首次發(fā)現(xiàn)APX, 但未見后續(xù)關(guān)于棉鈴蟲APX基因克隆的相關(guān)研究; 隨著核酸測(cè)序技術(shù)特別是高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 獲得的各類動(dòng)物表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence tags, ESTs)及基因組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng), 通過生物信息學(xué)分析陸續(xù)在鞭毛蟲(Thecamonas trahens)、堡礁海綿(Amphimedon queenslandica)、2種水螅(H. vulgaris及H. viridissima)[14, 15]、3種寄生于鮭魚體內(nèi)的甲殼綱動(dòng)物(Caligus clemensi,C.rogercresseyi和Lepeophtheirus salmonis)及腕足動(dòng)物海豆芽(Lingula anatina)中發(fā)現(xiàn)了APX基因序列, 但目前對(duì)非植物界物種的APX基因的來(lái)源及其編碼蛋白的生理功能知之甚少?；诖? 本研究基于刺胞動(dòng)物門兩種水螅(H.vulgaris及H. viridissima)APX基因比對(duì)后保守區(qū)序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物[14, 15], 運(yùn)用RACE技術(shù)克隆了中國(guó)綠水螅(H. sinensis)APX基因全長(zhǎng)cDNA序列, 并進(jìn)一步利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組APX蛋白, 再把該重組蛋白作為抗原免疫新西蘭兔制備APX多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上, 采用實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡方法對(duì)中國(guó)綠水螅APX表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析。因此, 本研究為探討水螅APX基因的來(lái)源和進(jìn)化、以及進(jìn)一步了解APX在水螅生理活動(dòng)過程中的作用等方面提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中國(guó)綠水螅(H. sinensis)原種采集于廣東省惠州市東江流域, 從野外采集的水?；铙w標(biāo)本中選取1只個(gè)體單獨(dú)培養(yǎng), 據(jù)此建立中國(guó)綠水螅單克隆無(wú)性繁殖系。每天用豐年蟲(Artemiasp.)幼蟲喂食水螅1次, 喂食后及時(shí)更換培養(yǎng)液。水螅培養(yǎng)液由冷卻后充氧的單蒸水配制(配方為: 1 mmol/L NaCl,1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L MgSO4,1 mmol/L Tris, pH 7.4)。中國(guó)綠水螅單克隆無(wú)性繁殖系長(zhǎng)期保持在培養(yǎng)條件穩(wěn)定的光照培養(yǎng)箱內(nèi)[溫度(25±0.5)℃, 光照度2000 lx, 每天光照12h]。

1.2 中國(guó)綠水螅SMART RACE cDNA文庫(kù)的制備

挑取50只中國(guó)綠水螅, 饑餓2d后采用RNA抽提試劑盒(Sangon, 中國(guó))提取總RNA, 再使用mRNA分離提純?cè)噭┖?Sangon, 中國(guó))從總RNA中純化mRNA。以mRNA為模板, 采用SMART RACE cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Clontech, 美國(guó))制備RACE cDNA文庫(kù)[16],cDNA文庫(kù)凍存于-80℃低溫冰箱備用。所有實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3 5′RACE及3′RACE

根據(jù)GenBank中2種水螅(H. vulgaris, XM_002158468;H. viridissima, AY608909)APX基因cDNA序列, 運(yùn)用Clustal 2.0軟件[17]比對(duì)二者序列數(shù)據(jù)以分析保守序列, 再采用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)兩條引物5′APX及3′APX(表 1)。其中引物5′APX與試劑盒接頭引物5′adapter primer(表 1)配對(duì)進(jìn)行5′ RACE;引物3′APX與試劑盒接頭引物3′ adapter primer(表1)配對(duì)進(jìn)行3′ RACE。RACE PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照SMART RACE cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒說(shuō)明書。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后與pMD 18-T克隆載體連接, 連接液轉(zhuǎn)化E. coliJM109菌株。菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆, 陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 APX基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆

根據(jù)5′RACE和3′RACE PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增中國(guó)綠水螅APX基因全長(zhǎng)cDNA序列的特異性引物APX-F及APX-R(表 1), PCR反應(yīng)體系含10×buffer 5.0 μL, 25 mmol/L MgCl26.0 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,TaqDNA聚合酶1.2 μL(5 U/μL), 模板(中國(guó)綠水螅SMART RACE cDNA文庫(kù))3 μL, 使用滅菌去離子水將反應(yīng)總體積補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)體系在94℃預(yù)變性5min, 然后進(jìn)入如下循環(huán): 94℃變性30s, 48℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)次數(shù)為35, 循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后與pMD18-T克隆載體連接, 連接液轉(zhuǎn)化E. coliJM109菌株。菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆, 陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。再采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Sangon, 中國(guó))提取重組質(zhì)粒pMD18-T-APX。

1.5 APX基因編碼區(qū)全長(zhǎng)DNA序列的克隆

挑取50只中國(guó)綠水螅, 饑餓2d后采用動(dòng)物細(xì)胞總DNA抽提試劑盒(Sangon, 中國(guó))提取總DNA, 再使用DNA純化試劑盒(Sangon, 中國(guó))純化總DNA。以總DNA為模板, 使用Long PCR試劑盒(Sangon, 中國(guó))擴(kuò)增APX基因編碼區(qū)全長(zhǎng)DNA。Long PCR實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表 1 本文所用引物序列Tab. 1 PCR primers used in the study

1.6 生物信息學(xué)分析

將測(cè)得的中國(guó)綠水螅APX基因全長(zhǎng)cDNA序列通過DNAClub軟件進(jìn)行編碼蛋白的氨基酸序列的預(yù)測(cè), 在SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/secpred_sopma.pl)網(wǎng)站在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu), 在SWISS-MODEL網(wǎng)站(http://swissmodel.expasy.org/interactive)通過同源建模方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)3-D圖像文件通過生物圖像分析軟件AntheProt_3D進(jìn)行解析。

將預(yù)測(cè)的中國(guó)綠水螅APX氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)BLAST在線分析, 獲得相應(yīng)的同源序列; 再將中國(guó)綠水螅APX氨基酸序列與其同源蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)通過Clustal 2.0軟件[17]進(jìn)行比對(duì)。基于APX氨基酸序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析時(shí), 內(nèi)群包括不同來(lái)源的44個(gè)同源序列, 外群為來(lái)自于真菌界的3個(gè)同源序列。使用Modeltest 3.7檢驗(yàn)序列數(shù)據(jù)并選擇合適的建樹參數(shù)模型[18]。通過PAUP 4.0b10軟件[19], 基于Jones-Taylor-Thornton模型用最大似然法(Maximum-likelihood, ML)重建分子系統(tǒng)發(fā)生樹。ML系統(tǒng)發(fā)生樹中各節(jié)點(diǎn)的置信度由全部運(yùn)算1000次自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗(yàn)。另外, 使用MrBayes 3.2.3軟件[20], 基于Jones-Taylor-Thornton模型并同時(shí)啟動(dòng)4條馬爾可夫鏈(包括冷鏈1條, 熱鏈3條)。以隨機(jī)樹為起始樹, 運(yùn)行3×106代, 每100代對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行重新取樣構(gòu)建貝葉斯樹(Bayesian inference tree, BI), 系統(tǒng)發(fā)生樹各節(jié)點(diǎn)的置信度通過后驗(yàn)概率(Posterior probability, PP)檢測(cè)。

1.7 APX基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化、濃縮與鑒定

為制備中國(guó)綠水螅APX重組蛋白, 根據(jù)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST的多酶切位點(diǎn)種類及目的基因核苷酸序列特征設(shè)計(jì)及合成引物PE-APS-F(含BamHⅠ酶切位點(diǎn))及PE-APS-R(含EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))(表 1)。但中國(guó)綠水螅APX基因編碼區(qū)的586—591位點(diǎn)有一個(gè)BamH Ⅰ酶切位點(diǎn), 1044—1049位點(diǎn)有一個(gè)EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。為人工突變(核苷酸位點(diǎn)突變但對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)不變化)這2個(gè)酶切位點(diǎn), 我們?cè)O(shè)計(jì)了APS-OEP-1, APS-OEP-2及APSOEP-3等3條引物用于重疊延伸PCR(表 1)。引物PE-APS-F和引物APS-OEP-2配對(duì)、以本研究制備的重組質(zhì)粒pMD18-T-APX為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅰ;引物APS-OEP-1和引物APS-OEP-3配對(duì)、以質(zhì)粒pMD18-T-APX為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅱ; 再以上述的PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物Ⅱ?yàn)橐?50 μL PCR反應(yīng)體系中各加1 μL)、無(wú)需添加模板進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅲ; 最后引物PE-APS-F和引物PE-APS-R配對(duì)、以PCR產(chǎn)物Ⅲ為模板擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Ⅳ。

采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa, 日本)進(jìn)行上述的系列PCR反應(yīng), PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書。PCR產(chǎn)物Ⅳ及原核表達(dá)質(zhì)粒pETGST[21]分別用BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ雙酶切, 酶切產(chǎn)物各自經(jīng)切膠純化后連接, 再通過分子克隆方法制備重組質(zhì)粒pET-GST-APS。重組質(zhì)粒pET-GSTAPS轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)菌株, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)后的E. coliBL21 (DE3)菌體經(jīng)超聲破碎后采用Ni-NTA His-Band樹脂親和層析柱試劑盒(Qiagen, 德國(guó))純化重組蛋白, 再使用蛋白質(zhì)濃縮管通過離心方法濃縮重組蛋白。濃縮后的重組蛋白先進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 然后再電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 再按照潘紅春等[22]的方法測(cè)定重組蛋白N末端10個(gè)氨基酸殘基的序列以鑒定重組蛋白。

1.8 多克隆抗體制備

用于免疫的新西蘭兔分為免疫組(1只)與對(duì)照組(3只), 免疫組被注射弗氏佐劑與重組APX蛋白的乳化劑, 對(duì)照組被注射弗氏佐劑和PBS的乳化劑。每組動(dòng)物在第0、第2、第4及第6周各免疫1次, 共4次。第1次基礎(chǔ)免疫使用弗氏完全佐劑, 后3次加強(qiáng)免疫均使用弗氏不完全佐劑, 采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫方法。分別于第0、第2、第4、第6及第8周靜脈采血, 共5次。通過ELISA方法確定抗血清針對(duì)抗原蛋白的效價(jià), 采用Protein A sepharose CL-4B親和層析試劑盒(PrimeGene, 中國(guó))從抗血清中分離純化APX多克隆抗體[23]。

1.9 APX基因表達(dá)分析

在不同光照時(shí)長(zhǎng)條件下培養(yǎng)中國(guó)綠水螅 準(zhǔn)備7臺(tái)光照培養(yǎng)箱[溫度(25±0.5)℃, 光照度2000 lx],光周期分別設(shè)置為0 L∶24D(在1個(gè)24h周期內(nèi)光暴露0h、黑暗24h)、4 L∶20D、8 L∶16D、12 L∶12D、16 L∶8D、20 L∶4D及24 L∶0D。每個(gè)培養(yǎng)箱放3個(gè)培養(yǎng)盒, 每盒放中國(guó)綠水螅200只。每天喂食1次,喂食后30min時(shí)換培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)水螅30d。

qPCR分析 在不同光照時(shí)長(zhǎng)條件下培養(yǎng)中國(guó)綠水螅的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 從每個(gè)培養(yǎng)盒中挑取50只中國(guó)綠水螅, 饑餓2d后采用RNA抽提試劑盒(Sangon, 中國(guó))提取總RNA。以總RNA為模板, 采用Prime Script? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 日本)試劑盒合成第一鏈cDNA。具體實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

根據(jù)本研究得到的中國(guó)綠水螅APX基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)用于qPCR的引物Q-APX-F及Q-APXR(表 1), 再根據(jù)3種刺胞動(dòng)物Actin基因cDNA序列(AY423388, XM_002154426及M32364)比對(duì)后結(jié)果選取其中完全保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物Q-Actin-F及QActin-R(表 1)。采用SYBR?Premix ExTaq?(TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa, 日本)和CFX96實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國(guó))進(jìn)行qPCR反應(yīng)。具體qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書。同一樣品重復(fù)3個(gè)反應(yīng), 以actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出各樣本的Ct (threshold cycle)值, 隨后采用2-ΔΔCt法[24]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和表達(dá)差異分析。采用SSPS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析, 使用Duncan’s multiple-range test進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析,P＜0.05表示存在顯著性差異。

Western blotting分析 采用Western Blotting檢測(cè)試劑盒(Baiaolaibo, 中國(guó))進(jìn)行Western Blotting分析[25], 實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)所用一抗為本研究制備的APX多克隆抗體, 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)(Baiaolaibo,中國(guó))。另外, 本實(shí)驗(yàn)以Actin為內(nèi)參蛋白, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 所用中國(guó)綠水螅Actin多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自備。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 采用Tanon全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon, 中國(guó))對(duì)PVDF膜進(jìn)行圖像采集和密度掃描分析。采用SSPS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析, 使用Duncan’s multiple-range test進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析,P＜ 0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)綠水螅APX基因cDNA序列及DNA序列分析

依據(jù)近緣種APX基因序列設(shè)計(jì)引物, 進(jìn)行了3′RACE及5′RACE, 再根據(jù)RACE產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物通過分子克隆方法克隆了中國(guó)綠水螅APX基因cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào):KU981066)。中國(guó)綠水螅APX基因cDNA序列總長(zhǎng)1357 bp, 包括5′非編碼區(qū)107 bp, 3′非編碼區(qū)146 bp及開放閱讀框(Open reading frame, ORF)1104 bp,共編碼367個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為40.79 kD,等電點(diǎn)為8.36。BLAST分析顯示中國(guó)綠水螅APX氨基酸序列中第50—229位點(diǎn)的區(qū)域?qū)儆谥参镄訟PX結(jié)構(gòu)域同源片段。SOPMA在線分析顯示中國(guó)綠水螅APX二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋占比38.42%, β-折疊15.26%, β-轉(zhuǎn)角6.81%及無(wú)規(guī)則卷曲線39.51%?；谥袊?guó)綠水螅APX氨基酸序列數(shù)據(jù)首先在SWISSMODEL網(wǎng)站上在線篩選用于建模的合適模型(5amm.1.A), 再基于這個(gè)模型進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模和檢驗(yàn)。該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主體框架和內(nèi)核主要由α-螺旋構(gòu)成, 而β-折疊主要分布在蛋白質(zhì)的表面(圖 1)。

為探討中國(guó)綠水螅APX基因在基因組水平上的基因結(jié)構(gòu), 本研究依據(jù)其cDNA編碼區(qū)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(DNA-APX-F及DNA-APX-R, 表 1),以水?？侱NA為模板擴(kuò)增了APX基因DNA序列,PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明APX基因在基因組中沒有內(nèi)含子。

2.2 APX蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹的重建

基于中國(guó)綠水螅APX氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析時(shí)發(fā)現(xiàn)與之同源的蛋白質(zhì)序列絕大部分屬于植物界物種, 少數(shù)序列屬于真菌界及動(dòng)物界(涉及原生動(dòng)物門、海綿動(dòng)物門、刺胞動(dòng)物門、節(jié)肢動(dòng)物門及腕足動(dòng)物門)物種。46個(gè)代表性同源序列與中國(guó)綠水螅APX氨基酸序列比對(duì)后進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生分析, 結(jié)果表明, 以真菌界3個(gè)物種APX序列為外群, 植物界物種的APX序列聚為一單系群, 而動(dòng)物界物種的APX序列聚為另一單系群(圖 2)。

2.3 中國(guó)綠水螅APX基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

通過在引物DNA序列中加入酶切位點(diǎn)的方法在中國(guó)綠水螅APX基因編碼區(qū)兩端加上酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ及BamHⅠ, 采用重疊延伸PCR方法優(yōu)化了APX基因編碼區(qū)cDNA序列, 再通過分子克隆方法制備了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-GST-APX, 測(cè)序及雙酶切方法顯示中國(guó)綠水螅APX基因的編碼區(qū)cDNA序列成功插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GST。原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-GST-APX被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3)中, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)重組融合蛋白GST-APX, 其分子量與預(yù)期大小(69.36 kD)接近, 并且該重組蛋白在誘導(dǎo)溫度為32℃時(shí)主要以可溶性形式表達(dá)(圖 3A—E)。先通過親和層析方法純化重組蛋白(圖 3F), 再經(jīng)濃縮后其濃度約為410 μg/mL。重組蛋白N末端10個(gè)氨基酸殘基的序列測(cè)定結(jié)果(MSPILGYMKI)也直接證實(shí)了本研究成功表達(dá)了重組融合蛋白GST-APX。

圖 1 中國(guó)綠水螅APX三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig. 1 The deduced tertiary structure of APX from H. sinensis

以上述純化及濃縮后的重組蛋白GST-APX為抗原, 對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行了4次免疫。以1∶500起始稀釋度按3倍的稀釋倍率逐級(jí)稀釋抗血清用于ELISA實(shí)驗(yàn), 其中以首次免疫之前的兔血清(1∶500稀釋)為陰性對(duì)照組, 以第4次免疫后的兔血清(1∶500稀釋)為陽(yáng)性對(duì)照組, 以樣品稀釋液為空白對(duì)照組。結(jié)果表明, 得到的兔抗血清效價(jià)為1∶1093500(圖 4)。

2.4 中國(guó)綠水螅APX基因表達(dá)分析

在不同光照時(shí)長(zhǎng)梯度(光強(qiáng)度恒定)下培養(yǎng)中國(guó)綠水螅30d, qPCR結(jié)果表明, 每天光照0、4h及8h實(shí)驗(yàn)組之間水螅APX基因轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著, 每天光照12h實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄水平開始明顯升高, 每天光照16h、20h及24h實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄水平約為每天光照0實(shí)驗(yàn)組的2.5倍(圖 5)。WB檢測(cè)結(jié)果表明光照時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)(每天光照12h以上)綠水螅APX表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的上調(diào)(圖 6)。

圖 2 基于APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列數(shù)據(jù)重建的ML樹及BI樹Fig. 2 Maximum likelihood tree and Bayesian inference tree based on amino acid sequences of APX domains

3 討論

圖 3 融合蛋白GST-APX的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE of recombinant fusion protein GST-APX

圖 4 基于ELISA方法的融合蛋白GST-APX抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果Fig. 4 Titration of antiserum to recombinant fusion protein GSTAPX using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

圖 5 基于實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示的中國(guó)綠水螅在不同光照時(shí)長(zhǎng)條件下APX基因相對(duì)表達(dá)水平Fig. 5 Relative expression levels of APX gene of H. sinensis under different illumination times

圖 6 基于免疫印跡分析顯示的中國(guó)綠水螅在不同光照時(shí)長(zhǎng)條件下APX蛋白表達(dá)模式Fig. 6 APX protein level of H. sinensis under different illumination times

本研究從中國(guó)綠水螅中克隆到了APX基因, 該基因共編碼367個(gè)氨基酸, 其中長(zhǎng)度為180個(gè)氨基酸位點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橹参顰PX蛋白結(jié)構(gòu)域同源片段。目前絕大部分已發(fā)現(xiàn)的APX酶蛋白或APX基因均來(lái)自植物界物種[26], 這主要是因?yàn)锳PX生理功能決定的。含有葉綠體的光合生物細(xì)胞中光合氧化碳循環(huán)及光呼吸作用等生理過程的副產(chǎn)物H2O2能引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的氧化性損傷, 而APX能利用抗壞血酸(作為電子供體)、同時(shí)協(xié)同AsA-GSH循環(huán)將H2O2還原為H2O, 從而防止H2O2在光合生物體中的毒性堆積, 所以APX是植物細(xì)胞中不可或缺的抗氧化體系重要組成部分[26]。問題是包括本研究實(shí)驗(yàn)材料中國(guó)綠水螅在內(nèi)的非植物界的少量物種(主要涉及真菌界及動(dòng)物界)中也發(fā)現(xiàn)了APX蛋白或APX基因[12, 13], 特別是動(dòng)物界中的原生動(dòng)物門、海綿動(dòng)物門、刺胞動(dòng)物門、腕足動(dòng)物門及節(jié)肢動(dòng)物門等類群的一些物種中發(fā)現(xiàn)了APX基因存在[7](圖 2)。這些動(dòng)物APX基因的起源及進(jìn)化歷程值得深入探討, 目前有以下3個(gè)方面的線索: 首先, APX前體或相關(guān)蛋白的編碼基因可能在早期生命體中普遍存在, 植物類群由于光合氧化碳循環(huán)副產(chǎn)物H2O2的壓力而保留了APX基因, 但大部分動(dòng)物細(xì)胞由于沒有光合作用產(chǎn)生H2O2的壓力、因而可能在進(jìn)化過程中逐漸舍棄了APX相關(guān)基因。如果是這樣, 海綿和水螅等低等無(wú)脊椎動(dòng)物尚且保留APX基因容易理解, 因?yàn)橛性S多低等無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)有單細(xì)胞藻類共生; 但進(jìn)化地位較高等的節(jié)肢動(dòng)物和腕足動(dòng)物還保留APX基因可能有特別的原因、或者這些動(dòng)物類群APX蛋白的功能可能進(jìn)行了相應(yīng)轉(zhuǎn)變, 值得深入探討。

其次, 有觀點(diǎn)認(rèn)為海綿動(dòng)物和刺胞動(dòng)物等低等無(wú)脊椎動(dòng)物的祖先可能是許多不同類型單細(xì)胞生物“組合”而成[27], 動(dòng)物APX基因的起源可能是這些不同單細(xì)胞生物早期融合的結(jié)果。本研究基于APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列重建的系統(tǒng)發(fā)生樹中單細(xì)胞動(dòng)物和海綿動(dòng)物聚為一支在一定程度上支持了這個(gè)假說(shuō)(圖 2)。最后, 海綿和水螅等一些低等無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中有單細(xì)胞綠藻共生, 這些動(dòng)物的APX基因也有可能是從共生綠藻水平轉(zhuǎn)移而來(lái)[28]。從基因組擴(kuò)增的中國(guó)綠水螅APX基因DNA大小和序列看, 在基因組水平上中國(guó)綠水螅APX基因沒有內(nèi)含子, 歐洲綠水螅(H. viridissima)APX基因也沒有內(nèi)含子[15], 而植物APX基因具有內(nèi)含子[29], 共生綠藻APX基因可能是通過RNA途徑水平轉(zhuǎn)移到了水螅細(xì)胞。但綠水螅APX基因不是來(lái)自現(xiàn)在的共生綠藻, 因?yàn)闅W洲綠水螅與其共生綠藻之間APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似性較低(36%)[15], 這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明綠水螅APX基因的來(lái)源及進(jìn)化經(jīng)歷了相當(dāng)復(fù)雜的歷程, 不含共生綠藻的普通水螅(H. vulgaris)具有APX基因也映襯這個(gè)推測(cè)[14]。值得注意的是, 本研究基于APX結(jié)構(gòu)域氨基酸序列重建的系統(tǒng)發(fā)生樹中植物界物種聚為一單系群, 而動(dòng)物界物種聚為另一單系群(圖 2), 這說(shuō)明動(dòng)物界的APX基因有一共同起源。如果動(dòng)物中的APX基因真是從共生的植物界物種水平轉(zhuǎn)移而來(lái), 在該系統(tǒng)樹中具有APX基因的動(dòng)物物種應(yīng)該與植物界物種混雜排列。綜上所述, 從現(xiàn)有證據(jù)看, 動(dòng)物APX基因的起源目前尚難有定論, 有待進(jìn)一步研究。

為探討中國(guó)綠水螅APX蛋白的生理功能, 本研究在不同光照時(shí)長(zhǎng)梯度下培養(yǎng)中國(guó)綠水螅, qPCR和WB檢測(cè)結(jié)果均表明光照時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)(每天光照12h以上)綠水螅APX表達(dá)呈現(xiàn)一定程度的上調(diào)(圖 5、圖 6)。中國(guó)綠水螅是一個(gè)由動(dòng)物與單細(xì)胞綠藻組成的典型共生系統(tǒng)[30], 即每個(gè)水螅內(nèi)胚層皮肌細(xì)胞內(nèi)共生20—30個(gè)綠藻個(gè)體, 宿主細(xì)胞為藻類提供CO2、含氮物質(zhì)、礦物質(zhì)、水及庇護(hù)所, 而綠藻利用光合作用為宿主提供O2、碳水化合物、氨基酸和其他有機(jī)物營(yíng)養(yǎng)[31, 32]。中國(guó)綠水螅原種生活在華南熱帶及靠近熱帶的地區(qū)[30], 水溫較高時(shí)水螅的食物水蚤等小型甲殼動(dòng)物數(shù)量較少, 綠水螅此時(shí)面臨食物缺乏的壓力, 在這種情況下水螅體內(nèi)共生綠藻向水螅細(xì)胞輸送的來(lái)自光合作用的碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是綠水螅維持正常生命活動(dòng)和保持存活的關(guān)鍵。但是, 共生綠藻對(duì)于水螅細(xì)胞來(lái)說(shuō)是雙刃劍, 一方面共生綠藻能通過光合作用給水螅細(xì)胞補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 另外一方面共生綠藻光合作用產(chǎn)生包括H2O2在內(nèi)的活性氧也能直接危害水螅細(xì)胞, 所以水螅體內(nèi)共生綠藻在長(zhǎng)時(shí)間光輻射下其連續(xù)進(jìn)行光合作用累積的大量活性氧一部分?jǐn)U散到水螅細(xì)胞內(nèi)[33—35], 此時(shí)水螅體內(nèi)表達(dá)上調(diào)的APX可能參與清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

致謝：

感謝深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院汪安泰先生協(xié)助采集實(shí)驗(yàn)材料。