IL-18水平表達及IL-18基因多態(tài)性與哮喘病的相關性研究

鐘丹丹 馬紅慧 劉加順

(濰坊護理職業(yè)學院，濰坊262500)

哮喘是一種慢性炎癥性呼吸道疾病,其發(fā)病率有逐年升高趨勢[1]。遺傳及環(huán)境等因素密切影響哮喘的病理過程,但作用機制尚未闡明[2]。細胞因子介導的免疫反應在包括哮喘在內的各種免疫性疾病中起主導作用，尋找新的細胞因子和其他治療哮喘方法是最近研究的熱點。IL-18是IL-1家族成員[3]，在細胞免疫微調過程中發(fā)揮著重要作用[4]，也可作為Th2細胞發(fā)育和IgE產生的輔因子，并在Th1細胞的分化中起重要作用[5]。Wild等[6]研究發(fā)現(xiàn)IL-18的表達水平與哮喘的發(fā)病有關，哮喘患者血清中IL-18水平較健康人顯著升高，并報道了哮喘易感性的IL-18的多態(tài)性，表明IL-18可能與哮喘治療有關。Rovina等[7]通過動物實驗證實IL-18蛋白水平在肺炎加重期間升高，小鼠通過IL-18激活Th2細胞因子和氣道嗜酸粒細胞增多而產生變應性哮喘。此外，李鑫等[8]在嚴重的哮喘患者痰液上清中也檢測到IL-18。

諸多基因與哮喘易感性相關已經被國內外研究者發(fā)現(xiàn)，但因人體、地理位置、種族、生活環(huán)境等都存在差異，哮喘與IL-18的相關性研究報道在國內比較罕見。本文探究了IL-18-137G/C、-607C/A基因的多態(tài)性與哮喘患者的易感性是否相關，從遺傳學角度進一步揭示哮喘的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 參照《全球哮喘防治指南》納入自2016年3月到2017年9月我院就診哮喘患者301例為研究對象(哮喘組)，年齡為18～77歲，平均年齡(48.60±7.80)歲[9]；選擇同期于醫(yī)院健康體檢288例志愿者為對照組(健康組)。健康組年齡為18～79歲，平均年齡(49.30±7.80)歲;其他呼吸系統(tǒng)疾病均排除。本研究均獲家屬和患者同意并簽同意書。

1.2實驗方法

1.2.1DNA 提取 抽取所有研究對象空腹靜脈血2 ml，于-80℃保存樣本。使用DNA試劑盒(上海遠見生物科技有限公司，D3392-01)，依說明書操作，提取DNA。DNA濃度檢測提取采用核酸蛋白儀(MPfastprep-24)，DNA樣本在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增 引物按照Primer 5.0以及Oligo 6軟件設計，IL-18基因-607位點、-137位點的特異性引物，見表1。

表1引物序列信息

Tab.1Primersequence

GenePrimer sequencLocus -607Forward5′- GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAC-35′-GT-TGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAA-3′Reverse5′-TAACCTCATTCAGGACT-3 ′Quality control forward5 ′-CTTTGCTATCATTCCAG-3 ′Locus -137Forward5 ′-CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAG-3 ′5 ′-CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAC-3 ′Reverse5 ′-AGGAGGGCAAAATGCACTGG-3Quality control forward5 ′-CCAATAGGACTGATTATTCCGCA-3 ′

1.2.3測定血清IL-18水平 采集研究對象的空腹靜脈血2 ml，血清離心備用，以-80℃保存。參照ELISA試劑盒(北京奧維亞生物技術有限公司)說明書測定血清IL-18水平。

2 結果

2.1測序和分型結果

2.1.1IL-18/-137G/C、-607C/A 基因分型PCR產物測序圖 向反應體系中放入的引物為通用反向引物和內參照正向引物，在相同的條件下進行PCR反應，反應后的產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR成功后，進行基因測序。IL-18-607C/A測序結果，IL-18-137G/C基因分型PCR反應產物測序結果見圖1和圖2。

2.1.2IL-18基因多態(tài)性位點(IL-18/-607C/A，IL-18/-137G/C)電泳結果 IL-18基因-607位點、137位點的PCR總體系分別為25 μl，其中包括0.25 mmol/L dNTP，約30 ng的基因組DNA和1U Taq聚合酶，10×PCR緩沖液2.5 μl(含2.0 mmol/L MgCl2)。0.4 μmol/L特異性正向引物，0 .4 μmol/L質控正向引物，0.8 μmol/L共同反向引物。擴增參數(shù)：先預變性94℃ 4 min后相同溫度變性20 s，然后退火62℃ 40 s，再延伸40 s溫度控制在72℃，總計7個循環(huán)；再變性20 s溫度控制為94℃，55℃退火40 s，然后72℃延伸40 s，總計35個循環(huán)。將特異性正向引物分別擴增的PCR產物2條進行電泳(在瓊脂糖凝膠上20 g/L)，40 min，80 V，采用溴化乙錠染色，觀察結果和鑒定基因型采用紫外線凝膠成像系統(tǒng)。我們每份標本的PCR均分別采用兩條特異性正向引物做兩管，301 bp為質控條帶處，196 bp為A/C等位基因特異性擴增片段處。

圖3為IL-18 基因-607位點多態(tài)性檢測結果。標本1、2只觀察到長196 bp特異性擴增片段在C等位基因處,其基因型為CC；標本3、4長196 bp特異性擴增片段均可在PCR產物電泳后出現(xiàn)，其為CA基因型；標本5長196 bp特異性擴增片段均可在A 等位基因處再現(xiàn)，其為AA基因型。

圖4為標本 IL-18/-137位點多態(tài)性檢測電泳結果，質控條帶在446 bp 處,G/C 等位基因特異性擴增片段為261 bp處。標本2、4、5只在G等位基因處觀察到長261 bp特異性擴增片段,為GG基因型;標本3長261 bp特異性擴增片段在PCR產物電泳后可見，其為GC基因型；標本6為261 bp特異性擴增片段只在C等位基因處觀察到，為CC基因型。

2.2IL-18基因多態(tài)性位點(IL-18/-607C/A，IL-18/-137G/C)的基因型及等位基因頻率分布及影響哮喘風險基因 遺傳平衡定律經Hardy-Weinberg檢驗后全部符合該定律(P>0.05)，顯示兩組都具備群體代表性。與對照組相比IL-18基因(-607C/A)、3種基因型、等位基因等差異較大(P<0.05)，差異具有顯著統(tǒng)計學意義。差異性風險因子OR>1，這種情況的等位基因患病風險加大；哮喘組基因位點-137G/C的CC與GG基因型差異較大，對比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.023，P<0.05)，其等位基因頻率則差異較小，比較差異無顯著統(tǒng)計學意義(P=0.054，P>0.05)。見表2。

圖1 IL-18/-607C/A多態(tài)性位點測序圖Fig.1 IL-18/-607C/A polymorphism site sequencing diagramNote: The polymorphic loci of IL-18/-607C/A were AC type，CC type and AA type.

圖2 IL-18/-137G/C多態(tài)性位點測序圖Fig.2 Sequence map of IL-18/-137G/C polymorphic lociNote: The polymorphism of IL-18/-137G/C locus is classified into GG type，GC type and CC type.

2.3哮喘組與健康組兩組不同IL-18水平對比 對照組IL-18水平(457.00±82.11)pg/ml高于哮喘組患者(48.68±7.03)pg/ml，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(t=85.34，P<0.001),說明血清中IL-18的水平與哮喘相關(圖5)。

2.4不同基因型患者IL-18水平變化比較 哮喘患者血清IL-18的基因多態(tài)性位點(-607C/A)基因型AA與CC型差異極大(P<0.01)，比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義，提示AA基因有增加患哮喘的風險。哮喘患者血清IL-18基因多態(tài)性位點(-137G/C)3種基因型差異較小(P>0.05)，比較差異無顯著統(tǒng)計學意義，見表3。

圖3 IL-18/-607C/A位點多態(tài)性電泳圖譜Fig.3 Polymorphism of IL-18/-607C/A locusNote: M.Standard reference material;1，2.CC genotype;3，4.CA genotype;5.AA genotype.

圖4 IL-18/-137G/C位點多態(tài)性電泳圖譜Fig.4 Polymorphism of IL-18/-137G/C locusNote: M.Standard reference materials；1.Negative control；2，4，5.GG genotype;3.GC genotype;6.CC genotype.

表2IL-18基因多態(tài)性位點的基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

Tab.2GenotypeandallelefrequencydistributionofIL-18genepolymorphicloci[n(%)]

SNPAsthma group(%)Healthy group(%)OR (95% CI)PIL-18/-607C/AAlleleC309(51.3)349(60.6)1A293(48.7)227(39.4)1.458(1.157-1.837)0.002GenotypeCC73(24.3)136(47.2)1AC163(54.1)77(26.7)3.944(2.662-5.842)<0.001AA65(21.6)75(26.1)1.615(1.043-2.500)0.031AC+AA228(75.7)152(52.8)2.795(1.968-3.969)<0.001IL-18/-137G/CAlleleC69(11.5)88(15.3)1G533(88.5)488(84.7)1.393(0.993-1.954)0.054GenotypeCC4(1.3)11(3.8)1GC41(13.6)68(23.6)1.507(0.443-5.120)0.508GG256(85.0)209 (72.6)4.063(1.104-14.96)0.029GC+GG297(98.7)278(96.2)2.671(0.828-8.617)0.088

圖5 哮喘組和健康組外周血IL-8水平比較Fig.5 Comparison of IL-8 levels in peripheral blood of asthma group and healthy group

表3不同基因型患者IL-18水平變化比較(pg/ml)

Tab.3ComparisonofIL-18levelsindifferentgenotypes(pg/ml)

SNPIL-18FPIL-18/-607C/ACC18.02±3.92AC31.68±7.24213.3<0.001AA41.68±8.08IL-8/-137G/CGG31.51±7.31GC32.58±8.630.2810.755CC28.68±7.24

3 討論

哮喘作為一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，遷延難愈，治療困難，不僅對患者的生活質量造成了影響，還給患者造成了沉重的經濟負擔。目前世界上哮喘患病率在各國不斷升高[10]，生活環(huán)境及基因與哮喘病的發(fā)生關系密切[11]。

免疫球蛋白E(IgE)和T輔助細胞2型(TH2)細胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)的過度產生可導致過敏性疾病。在哮喘發(fā)病機制中IL-4發(fā)揮著關鍵的介導作用，它在與對應的受體結合后通過轉錄激活子6(STAT6)與信號傳導子的磷酸化介導產生相應的DNA轉錄，相應的細胞從而產生。在Th2細胞的分化和IgE的類別轉換過程中，IL-4與 STAT6不可缺少[12]。IL-18可促進肥大細胞、T細胞、嗜堿性粒細胞分泌Th2細胞因子，同時可增加CD4+T細胞IL-4和STAT6依賴性方式IgE的產生。IL-18和T細胞受體介導的刺激可以誘導幼稚CD4+T細胞在體外發(fā)育成IL-4產生細胞。Th1/Th2 細胞釋放的細胞因子不平衡是哮喘發(fā)病機制的關鍵。有學者證實，在哮喘患者血清中Th2類細胞因子IL-13、IL-4 等高表達，而IL-12、IL-2等Th1類細胞因子表達減弱明顯。IL-18則能促進 T 細胞、嗜堿性粒細胞等分泌IL-4、IL-13，同時增強Th1免疫應答[13]，Ghoreschi等[14]研究表明 IL-18 基因多樣性與哮喘的惡化程度密切相關。這與IMBOD等[15]研究的關于過敏性哮喘和IL-18基因啟動子1-137等位基因有關相符，且認為IL-18基因變異是過敏性哮喘重要遺傳決定因素。

本研究顯示對照組IL-18水平(457.00±82.11)pg/ml高于哮喘組患者(48.68±7.03)pg/ml，說明血清中IL-18的水平與哮喘相關；同時對IL-18編碼基因-137G/C、-607C/A多態(tài)性的分析結果表明，哮喘患者血清IL-18的基因多態(tài)性位點(-607C/A)基因型AA與CC型差異極大(P<0.01)，比較差異有顯著統(tǒng)計學意義。提示AA基因有增加患哮喘的風險；表明攜帶AA基因型的人群患哮喘風險更大。這與楊慧等[16]提出IL-18在哮喘和過敏性鼻炎發(fā)病機制中所起的作用相符。

綜上，哮喘患者血清IL-18表達水平降低，提示患者血清IL-18水平低下與哮喘的發(fā)病機制關系密切。IL-18多態(tài)性位點(IL-18/-607C/A，IL-18/-137G/C)的基因分型中攜帶(-607C/A)AA基因型的人群患哮喘風險更大。但考慮遺傳因素、種族差異、環(huán)境因素、地域差異、樣本大小之間有著復雜的相關性等原因，還需要進一步大樣本、多中心的開展研究揭示哮喘的遺傳學發(fā)病機制，為臨床治療提供循證學依據(jù)。