豬瘟、豬藍(lán)耳病、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌多重混合感染的診斷

梁海英，張愛瓊，曾智勇，王 彬，徐 國(guó)，咸 文，何小莉，陳 娟，吳好葉

（貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

豬瘟（CSF）是由于豬只感染豬瘟病毒（CSFV）后所引起的一種具有傳染性的疾病。該病高度接觸性傳染，短時(shí)間內(nèi)急性發(fā)病可導(dǎo)致豬只死亡，臨床感染表現(xiàn)為持續(xù)性高熱、全身性點(diǎn)狀出血、脾臟出現(xiàn)梗死阻塞，通常又稱為 爛腸瘟”。因其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成巨大的危害，在我國(guó)將其列為一類傳染病[1]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)一種以損害母豬繁殖系統(tǒng)以及豬只呼吸系統(tǒng)疾病的病毒性傳染病，因感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV）而引起，通常稱為 豬藍(lán)耳病”。懷孕母豬感染 PRRSV后會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，后期產(chǎn)出胎兒死亡、孱弱以及呈木乃伊樣等；PRRSV對(duì)保育豬的感染率和死淘率較妊娠母豬高，導(dǎo)致豬只生長(zhǎng)發(fā)育性能很大程度上降低，臨床上豬只大多表現(xiàn)為呼吸不暢、食欲不佳、持續(xù)高熱不下、精神萎靡，感染高致病性豬藍(lán)耳病的豬只發(fā)病率和死亡率均較高[2]。副豬嗜血桿菌?。℉SP）是豬只感染副豬嗜血桿菌所引起，具有傳染性，臨床上常出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和漿膜炎等癥狀又稱革拉氏病，其對(duì)保育階段的豬只造成的威脅最大，常與其他病毒或細(xì)菌以混合感染的形式存在[3]。豬鏈球菌病是一種發(fā)病急、傳染性高的人畜共患病，因接觸致病性豬鏈球菌而導(dǎo)致感染[4]。

2018年7月，貴州某養(yǎng)殖場(chǎng)育肥豬在隔離免疫期間發(fā)病，出現(xiàn)高熱稽留、喘氣、呼吸困難、食欲不振等癥狀，豬場(chǎng)使用多種抗生素，未見有明顯效果，先后死亡400余頭，導(dǎo)致豬場(chǎng)損失慘重。為確診育肥豬發(fā)病死亡病因，故將2頭癥狀較為典型的發(fā)病豬送檢，現(xiàn)將檢測(cè)診斷結(jié)果報(bào)告如下，以供參考。

1 臨床及發(fā)病特征

據(jù)述，2018年7月，貴州某養(yǎng)殖場(chǎng)從貴州多個(gè)地方收購育肥仔豬800余頭，在隔離期間免疫豬瘟疫苗后豬只相繼出現(xiàn)病癥，臨床上表現(xiàn)為高燒不退、飲食不佳、精神萎靡、呼吸急促，采用多種抗生素藥物治療未見有效，發(fā)病期間豬只先后死亡400余頭；送檢豬只體表污穢，極度消瘦。

2 病理解剖特征

將2頭極度消瘦的送檢病豬進(jìn)行剖檢觀察，可見其中1頭育肥豬胸腔積液呈典型 絨毛心”、肺臟與胸腔粘連，腹腔臟器表面有纖維素性滲出物（圖1）；另1頭脾臟嚴(yán)重腫大，肺炎病癥明顯，在肺門、腹股溝等處的淋巴結(jié)有嚴(yán)重的腫大出血現(xiàn)象（圖2，3）；2頭病豬腎臟均有散在出血點(diǎn)（圖4）。

3 病毒學(xué)和細(xì)菌學(xué)診斷檢測(cè)

通過對(duì)送檢豬的臨床發(fā)病特性和病理剖檢觀察結(jié)果，初步確定送檢病豬可能存在細(xì)菌和病毒混合感染。根據(jù)送樣要求，對(duì)病豬組織樣品進(jìn)行CSFV和PRRSV的RT-PCR檢測(cè)，同時(shí)對(duì)豬圓環(huán)病毒病和豬偽狂犬病2種病毒進(jìn)行檢測(cè)，以及細(xì)菌檢測(cè)。

圖1 腹腔臟器表面有纖維素性滲出物

3.1 病毒檢測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，適量采集2頭送檢病豬內(nèi)臟組織（脾、肺、淋巴結(jié)等）合在一起，勻漿反復(fù)凍融3次后13 000 r/min離心7 min，取上清， 應(yīng)用 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 核酸提取試劑盒提取核酸，分別對(duì) CSFV、PRRSV、 PRV 和 PCV2 進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR 反應(yīng)體系（25.0 μL）：2 倍一步法的 Buffer 12.5 μL， 核酸模板 4.5μL， 引物 F/R 各 0.5μL， 一步法的酶 1.0 μL，RNase Free ddH2O 6.0 μL，反應(yīng)條件為50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，37個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系為（25.0 μL）：2hTaq酶 12.5 μL，ddH2O 6.0 μL， 引 物R/F各1.0 μL，核酸模板4.5 μL。PRV反 應(yīng) 條 件 為：94℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并拍照記錄。結(jié)果顯示，CSFV和PRRSV均呈陽性，PCV2和PRV均呈陰性（如圖5）。

圖2 腹股溝等處的淋巴結(jié)嚴(yán)重的腫大出血

圖3 肺門淋巴結(jié)腫大出血

3.2 細(xì)菌檢測(cè)

圖4 病豬腎臟出現(xiàn)散在出血點(diǎn)

圖5 病毒PCR檢測(cè)結(jié)果

無菌剪取少量的病豬新鮮肺臟、脾臟分別于胰酪大豆胨（TSB）液體培養(yǎng)基（含5%的胎牛血清）中培養(yǎng)12 h后，分別取新鮮培養(yǎng)的脾臟和肺臟菌液進(jìn)行革蘭氏染色。在顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫大的脾臟培養(yǎng)物中有鏈球菌（圖6 A）和肺臟培養(yǎng)物中疑似副豬嗜血桿菌樣的革蘭氏陰性小桿菌（圖6 B）。

為確定該革蘭氏陰性菌是否為副豬嗜血桿菌，將培養(yǎng)的菌液離心，用 PBS清洗處理2次，使用生工生物公司細(xì)菌 DNA提取試劑盒根據(jù)革蘭氏陰性菌提取方法提取細(xì)菌 DNA，反應(yīng)體系為（25.0 μL）：金盾Mix 21.0 μL，引物R/F各1.0 μL，DNA核酸模板2.0 μL。副豬嗜血桿菌PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min ；94 ℃ 50 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1min，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將反應(yīng)后獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。檢測(cè)結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌病為陽性（如圖7）。

4 討論

根據(jù)PCR/RT-PCR檢測(cè)，可以確診該送檢發(fā)病豬除感染有PRRSV外，CSFV也呈陽性，據(jù)述該豬群近期先后做了2次豬瘟疫苗免疫，因此該CSFV系疫苗毒的可能性較大。結(jié)合病理剖檢和檢測(cè)結(jié)果，病豬發(fā)病與PRRSV相關(guān)性較大，PRRSV為免疫抑制性病原，豬只感染后免疫調(diào)節(jié)受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)其他病原體的抵抗力降低，自身免疫調(diào)節(jié)能力極度下滑，繼而出現(xiàn)多種病毒或細(xì)菌的混合感染情況。根據(jù)發(fā)病豬解剖病癥以及細(xì)菌的初步染色鏡檢結(jié)果可知，發(fā)病豬同時(shí)還存在副豬嗜血桿菌和鏈球菌的感染。副豬嗜血桿菌病主要導(dǎo)致肺臟、胸腔和關(guān)節(jié)漿膜出現(xiàn)纖維素性炎癥，臨床特征為咳喘、呼吸不暢、體態(tài)消瘦、皮毛粗亂[5]，在養(yǎng)豬業(yè)飼養(yǎng)管理過程如CSFV和PRRSV等病毒感染或是飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)纫蛩鼐烧T發(fā)該病的發(fā)生。豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病是現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖中常見的兩種細(xì)菌性傳染病，通過呼吸與排泄物感染各個(gè)階段的豬只，鏈球菌病最早發(fā)生在仔豬10日齡左右，而副豬嗜血桿菌病在仔豬斷奶后逐漸顯現(xiàn)，兩者相互促進(jìn)使其對(duì)豬只的危害加深[6]。

對(duì)于該豬場(chǎng)CSFV、PRRSV、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌多病原感染的情況，應(yīng)制定科學(xué)的免疫程序，對(duì)豬只進(jìn)行豬瘟兔化弱毒疫苗和PRRSV疫苗的免疫接種，并且對(duì) CSFV和 PRRSV的抗體進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格控制病毒的感染及蔓延，以降低危害，對(duì)于豬瘟感染的情況可用豬瘟血清抗體，硫酸慶大霉素進(jìn)行肌肉注射或靜射，1次/d，持續(xù)3 d，對(duì)于重癥豬，要及時(shí)治療[7]。PRRS和 CSF目前尚無特治療效藥，但可以通過疫苗接種進(jìn)行預(yù)防，以減少其帶來的危害，在飼料中添加適當(dāng)?shù)目咕幬镆苑乐关i群的繼發(fā)性感染，在哺乳仔豬在斷奶前后，可飼料中添加適量的黃芪多糖和抗生素，以提高豬只自身免疫力和抵抗力，以預(yù)防豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征繼發(fā)的細(xì)菌性感染。預(yù)防副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌的感染，應(yīng)適當(dāng)降低飼養(yǎng)密度、減少溫度差異等環(huán)境可能帶來的應(yīng)激因素，注重藥物保健，在飼料中添加適量的抗菌藥物[8]，同時(shí)要強(qiáng)化飼養(yǎng)管理，尤其是圈舍要經(jīng)常性消毒，保持通風(fēng)和環(huán)境干燥，在購進(jìn)豬只隔離期間，消毒工作不能懈怠，在飲水中可適量添加電解多維，飼料中可添加氟苯尼考或替米考星等藥物進(jìn)行保健7 d以上，并及時(shí)監(jiān)測(cè)豬群疫苗免疫水平，適時(shí)做好相關(guān)疫苗的有效免疫。

圖6 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果

圖7 細(xì)菌PCR檢測(cè)結(jié)果