土槿乙酸C-18醇酯衍生物的合成及其體外免疫抑制活性研究

曾憲杰，張 猜，陳守強(qiáng)，陳 虹

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；2.武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室，天津300309）

土槿皮（pseudolarixkaempferi，PAB）是我國南方特有松科植物金錢松（Pseudolarixamabilis）的根皮或近根部樹皮，最早見于清代趙學(xué)敏所著《本草綱目拾遺》,性辛、溫、有毒；歸肺、脾經(jīng)；功能殺蟲止癢，用于疥癬瘙癢[1-2]。土槿乙酸（pseudolaric acid B，PAB，圖1）為土槿皮的主要活性成分[3]，其基本母核是特殊的薁類結(jié)構(gòu),并具有內(nèi)酯環(huán)和共軛雙烯酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu),這類結(jié)構(gòu)在天然產(chǎn)物中是很少見的。我們課題組研究顯示土槿乙酸能顯著改善遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠的耳腫脹并呈劑量依賴，其作用機(jī)制通過抑制與MAPK與PPAR信號(hào)通路相關(guān)的p38MAPK、ATF-2、MK2、HSP27 及 TNF-α 活性[4-5]。土槿乙酸還具有抗腫瘤[6]、抗白血病[7]、抗真菌[8]、抗血管生成等作用。PAB是很好的免疫抑制活性先導(dǎo)化合物。為尋找高效、低毒，具有良好水溶性的免疫抑制劑，對(duì)土槿乙酸進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造。

圖1 土槿乙酸結(jié)構(gòu)Fig 1 Pseudolaric acid B

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Varian Mercury Vx400核磁共振光譜儀；Agilent 6210 LC-TOF質(zhì)譜測定儀；XT顯微熔點(diǎn)儀（溫度未校正）；DHG-9000A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；ZK-30BS真空干燥箱；BüCHI R-124旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。薄層色譜和柱色譜所用硅膠（青島海洋化工公司）；土槿乙酸系實(shí)驗(yàn)室自提取提純得到，純度大于95%；無水二氯甲烷用五氧化二磷回流4 h后蒸出備用；無水四氫呋喃以二苯甲酮做檢測試劑，用金屬鈉回流制得，當(dāng)溶液變?yōu)樯钏{(lán)色后蒸出備用；無水甲醇用 CaO（250 g/L）回流 6 h，過夜，加至3A型分子篩中貯存?zhèn)溆谩３厥庹f明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均從北京百靈威試劑公司購得。

1.2 合成方法 土槿乙酸C18羧酸的還原：在25mL三頸瓶中依次加入土槿乙酸（PB，0.432g，1 mmol），10 mL無水二氯甲烷，移至冰浴，冷卻反應(yīng)液溫度至0℃。在此溫度下，將過量草酰氯（0.94 mL，10 mmol）用恒壓滴液漏斗緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，滴加完畢，移至室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h。減壓蒸餾除去過量草酰氯，得泡沫狀固體粗產(chǎn)物。將10 mL無水 四氫呋喃（THF）迅速加入反應(yīng)瓶中，移至冷阱冷卻反應(yīng)液溫度至-40℃，在N2保護(hù)下，分兩次緩慢加入LiAlH[OC（CH3）3]3（3.6 mL，4 mmol），滴加完畢，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。TLC檢測至反應(yīng)完全。將反應(yīng)移至冰浴，15 min后，加無水乙醇20mL淬滅還原劑。然后用10%HCl洗滌，20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)層，加入無水Na2SO4脫水，過濾，減壓蒸餾得到粗品，粗品經(jīng)柱色譜（二氯甲烷：乙酸乙酯）純化得白色固體粉末0.338 g，收率81%。

土槿乙酸C18酯衍生物的合成：在15 mL干燥的反應(yīng)瓶中依次加入土槿乙醇（PB-OH，0.062 g 0.15 mmol），10 mL干燥 DCM 和小分子酸類（0.15 mmol），冰浴下加入HOBt（0.18 mmol），EDCI（0.18 mmol），2滴三乙胺，15 min后移至室溫反應(yīng)，TLC點(diǎn)板檢測。反應(yīng)完畢，分別加入15 mL 10%HCI，飽和NaHCO3，蒸餾水，飽和NaCl洗滌，萃取，取二氯甲烷層，加入無水Na2SO4脫水，過濾，濾液回收，減壓蒸餾溶劑得到粗品，粗品以不同比例的二氯甲烷和乙酸乙酯為流動(dòng)相，經(jīng)柱色譜法純化得產(chǎn)品。以此路線共合成10個(gè)化合物，B1-B10?；衔顱1-B10合成路線及所引入基團(tuán)見圖2。

圖2 土槿乙酸衍生物B1-B10的合成路線Fig 2 The synthesis of pseudolaric acid B derivatives B1-B10 Conditions and reagents：（a）anhydrous DCM，oxalyl chloride,0℃-rt;（b）anhydrousTHF,LiAlH[OC(CH3)3]3,N2,-40℃;（c）anhydrousDCM,R-COOH,HOBt,EDCI,0℃-rt.

1.3 藥理實(shí)驗(yàn)部分

1.3.1 MTT法檢測目標(biāo)化合物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的毒性作用[9]

（1）在超凈臺(tái)中取昆明小鼠脾臟，并按上述方法制備單細(xì)胞懸浮液。

（2）將土槿乙酸衍生物和陽性藥霉酚酸酯分別溶于 DMSO，用培養(yǎng)液稀釋至 10 μmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L、0.01 μmol/L, 其中 DMSO 含量均低于0.1%，空白培養(yǎng)基同樣處理。

（3）于96孔板中以每孔 100 μL（約 1×105個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加入土槿乙酸衍生物和陽性藥霉酚酸酯，每種藥物設(shè)置4個(gè)濃度（10μmol/L、1μmol/L、0.1 μmol/L、0.01 μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，并以RPMI1640培養(yǎng)液為調(diào)零孔。向陰性對(duì)照組中加入與給藥組相同體積的溶劑。置于37℃，5%二氧化碳溫箱中。

（4）48 h后每孔加 20 μL 5mg/mL MTT 溶液（PBS配制）。37℃條件繼續(xù)孵育4 h，吸取上清液80 μL，每孔加入100 μL三聯(lián)液用于溶解甲簪顆粒，輕度振蕩充分溶解。

（5）在波長570 nm下，用酶標(biāo)儀測定光密度值（OD），以溶劑處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，用以下公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，并計(jì)算IC50：抑制率=（陰性對(duì)照組OD值－加藥組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值－空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.2 MTT法檢測目標(biāo)化合物對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用

（1）在超凈臺(tái)中取昆明小鼠脾臟，制備淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106-5×106/mL，加入ConA或LPS至終濃度為5 μg/mL。

（2）以每孔100 μL培養(yǎng)于96孔板中，同時(shí)加入土槿乙酸衍生物與陽性藥霉酚酸酯100 μL，每個(gè)藥物設(shè)置 4 個(gè)濃度（10 μmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L、0.01μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔，并以RPMI1640培養(yǎng)液為調(diào)零孔。向陰性對(duì)照組中加入與給藥組相同體積的溶劑，置于37℃，5%CO2溫箱中。

（3）48 h后每孔加 20 μL 5 mg/mL MTT 溶液（PBS配制）。37℃繼續(xù)孵育4 h，吸取上清液80 μL，每孔加入三聯(lián)液100 μL溶解甲簪顆粒，輕度振蕩溶解。

（4）在波長570 nm下，用酶標(biāo)儀測定光密度值(OD)，以溶劑處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，以RPMI1640培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，用以下公式計(jì)算抑制率：抑制率=（陰性對(duì)照組OD值－加藥組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值－空白對(duì)照組OD值）×100%。

2 結(jié)果

2.1本文共合成了10個(gè)目標(biāo)化合物，均為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR和HRESI-MS確證了這些化合物的結(jié)構(gòu)。這些化合物的理化數(shù)據(jù)如下。

B1：乳白色粉末，66 mg，86%yield，1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.59（dd，J=1.7，0.8 Hz，1H，H-5’），7.24-7.16（m,2H,H-8,H-4’),6.52(dd,J=3.5,1.7 Hz,1H,H-6’),6.46(dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.12(d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.57(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.75 (s,2H,H-18),3.72 (s,3H,-OCH3),3.26(m,1H,H-3),3.07(dd,J=13.9,6.0 Hz,1H,H-5a),2.89(dd,J=15.6,6.3 Hz,1H,H-6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.61 (ddd,J=15.1,3.9,1.7 Hz,1H,H-9b),2.13(s,3H,-OCOCH3),2.05(s,1H,H-6b),1.86(s,3H,CH3-17),1.81-1.66(m,5H,H-1,2,5),1.57(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.1,169.4,168.1,158.5,146.5,144.5,141.8,137.8,134.4,133.1,126.9,121.7,118.1,111.9,90.3,83.8,69.7,55.2,52.0,49.5,33.3,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：535.1918(M+Na)+, 理論值：535.1944[M+Na]+

B2：乳白色粉末，74 mg，89%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 7.36(d,J=3.7 Hz,1H,H-4’),7.31(d,J=3.8 Hz,1H,H-3’),7.24-7.17(m,1H,H-8),6.45(dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.14(d,J=11.0 Hz,1H,H-14),5.60 (d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.81(s,2H,H-18),3.72(s,3H,-OCH3),3.27(m,1H,H-3),3.07 (dd,J=14.1,6.1 Hz,1H,H-5a),2.89 (dd,J=15.5,6.3 Hz,1H,H-6a),2.75 (dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.61(dd,J=15.0,2.4 Hz,1H,H-9b),2.13(s,3H,-OCOCH3),2.05 (s,1H,H-6b),1.87 (s,3H,CH3-17),1.82-1.62(m,5H,H-1,2,5),1.58(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.1,173.0,169.4,168.1,156.8,144.7,141.8,138.5,134.5,132.1,128.0,121.5,119.0,111.5,90.3,83.8,71.1,55.2,52.0,49.5,33.4,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：580.1801(M+Na)+,理論值：580.1795[M+Na]+

B3：乳白色粉末，87 mg，91%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 7.20(s,2H,H-8,3’),6.44(dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.10 (d,J=10.9 Hz,1H,H-15),5.58(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.74(s,2H,H-18),3.72 (s,3H,-OCH3),3.26 (d,J=5.8 Hz,1H,H-3),3.07 (dd,J=14.2,6.3 Hz,1H,H-5a),2.89 (dd,J=15.5,6.2 Hz,1H,H-6a),2.75 (dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.61(dd,J=15.1,3.4 Hz,1H,H-9b),2.12(s,3H,-OCOCH3),2.04 (s,1H,H-6b),1.84 (s,3H,CH3-17),1.80-1.68(m,5H),1.57(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.1,169.4,168.1,156.7,145.9,141.8,138.2,134.5,132.6,128.6,127.4,122.0,121.6,103.8,90.3,83.8,70.3,55.2,52.0,49.6,33.4,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：669.1309(M+H)+,理論值：669.0257[M+H]+

B4：乳白色粉末，217 mg ，87%yield,1HNMR(400 MHz,CDCl3)：δ 7.20(m,1H,H-8),6.43 (dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.05(d,J=10.8 Hz,1H,H-15),5.54(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),5.30(s,1H,H-2’),4.59(s,2H,H-5’),4.49(dd,J=8.3,5.1 Hz,1H,H-3a’),4.03(dd,J=14.4,7.2 Hz,1H,H-4a’),3.93(dd,J=13.8,7.3 Hz,1H,H-4b’),3.72 (s,3H,-OCH3),3.26 (d,J=5.8 Hz,1H,H-3),3.07 (dd,J=14.2,6.3 Hz,1H,H-5a),2.89 (dd,J=15.5,6.0 Hz,1H,H-6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.61(dd,J=15.1,3.4 Hz,1H,H-9b),2.26(m,1H,H-3b’),2.12(s,3H,-OCOCH3),2.06-1.83(m,6H,H-6b,1,2,5),1.79(s,3H,CH3-17),1.57(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)δ 173.2,173.1,169.4,168.1,141.8,137.8,134.5,133.1,126.8,121.7,90.3,83.8,69.8,69.7,69.4,55.2,52.0,49.6,33.3,30.7,30.2,28.8,27.8,25.3,24.3,21.8,20.2,14.6.

HR-ESI-MSm/z：539.2263(M+H)+,理論值：539.2257[M+H]+

B5：乳白色粉末，67 mg，83%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 7.66(s,1H,H-5’),7.60(d,J=15.8Hz,1H,H-3’),7.44 (d,J=1.3 Hz,1H,H-7’),7.21(m,1H,H-8),6.59(d,J=1.9 Hz,1H,H-8’),6.45(dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.19(d,J=15.6 Hz,1H,H-2’),6.08(d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.55(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.64 (s,2H,H-18),3.72 (s,3H,-OCH3),3.25(m,1H,H-3),3.07(dd,J=14.3,5.6 Hz,1H,H-5a),2.89(dd,J=15.6,6.3 Hz,1H,H-6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.60 (ddd,J=15.0,4.0,1.7 Hz,1H,H-9b),2.12(s,3H,-COCH3),1.88(m,1H,H-6),1.84(s,3H,CH3-17),1.81-1.68(m,5H,H-1,2,5),1.57(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.2,169.4,168.1,166.7,144.6,144.5,141.8,137.6,135.1,134.4,133.7,126.3,122.6,121.8,117.6,107.4,90.3,83.9,69.3,55.2,52.0,49.6,33.3,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：561.2070(M+Na)+，理論值：561.2101[M+Na]+

B6：乳白色粉末，73 mg90%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 7.49(d,J=1.4 Hz,1H,H-6’),7.45(d,J=15.7 Hz,1H,H-3’),7.24-7.18(m,1H,H-8),6.62(d,J=3.4 Hz,1H,H-8’),6.49-6.46(dt,J=7.0,2.8 Hz,2H,H-14,H-7’),6.35(d,J=15.7 Hz,1H,H-2’),6.08(d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.55(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.64(s,2H,H-18),3.72(s,3H,-OCH3),3.25(m,1H,H-3),3.07(dd,J=14.3,5.6 Hz,1H,H-5a),2.89(dd,J=15.6,6.3 Hz,1H,H-6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.61 (ddd,J=15.0,4.0,1.7 Hz,1H,H-9b),2.12(s,3H,-COCH3),1.88(m,1H,H-6b),1.83(s,3H,CH3-17),1.80-1.68(m,5H,H-1,2,5),1.57(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.2,169.4,168.10,166.8,150.9,144.9,141.9,137.5,134.4,133.7,131.4,126.2,121.8,115.5,115.0,112.3,90.3,83.9,69.3,55.2,52.0,49.6,33.3,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：561.2057(M+Na)+，理論值：561.2101[M+Na]+

B7：淡黃色粉末，72 mg，88%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 7.72(d,J=16.0 Hz,1H,H-3’),7.58-7.49(m,2H,H-5’,9’),7.45-7.35(m,3H,H-6’,7’,8’),7.24-7.17(m,1H,H-8),6.53-6.40(m,2H,H-14,2’),6.10(d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.56(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.66 (s,2H,H-18),3.72 (s,3H,-OCH3),3.26(m,1H,H-3),3.07(dd,J=14.3,5.6 Hz,1H,H-5a),2.89 (dd,J=15.6,6.3 Hz,1H,6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,9a),2.61(ddd,J=15.1,3.9,1.7 Hz,1H,9b),2.12(s,3H,-OCOCH3),1.89(m,1H,6b),1.85(s,3H,CH3-17),1.82-1.59(m,5H)，1.58(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.1,169.4,168.1,166.7,145.2,141.8,137.6,134.4,134.3,133.7,130.4,128.9,128.1,126.4,121.8,117.8,90.3,83.9,69.4,55.2,52.0,49.6,33.3,30.7,29.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.8.

HR-ESI-MS m/z：571.2278(M+Na)+，理論值：571.2308[M+Na]+

B8：淡黃色粉末，67 mg，78%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 10.04(s,1H,CHO-7’),7.91(d,J=8.1 Hz,2H,H-6’,8’),7.74 (d,J=16.0 Hz,1H,H-3’),7.69 (d,J=8.1 Hz,2H,H-5’,9’),7.25-7.17(m,1H,H-8),6.59(d,J=16.0 Hz,1H,H-2’),6.47(dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.11 (d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.57(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.68(s,2H,H-18),3.72 (s,3H,-OCH3),3.26 (d,J=6.0 Hz,1H,H-3),3.07(dd,J=14.1,6.1 Hz,1H,H-5a),2.89(dd,J=15.5,6.2 Hz,1H,H-6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,H-9a),2.61(dd,J=15.0,2.5 Hz,1H,H-9b),2.13(s,3H,-OCOCH3),1.88 (s,1H,H-6b),1.86 (s,3H,CH3-17),1.82-1.67(m,5H,H-1,2,5),1.58(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 191.4,173.1,169.4,168.1,166.1,143.4,141.8,140.0,137.8,137.3,134.5,133.4,130.2,128.6,126.7,121.8,121.1,90.3,83.8,69.8,55.2,52.0,49.6,33.4,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：599.2277(M+Na)+,理論值：599.2257[M+Na]+

B9：淡黃色粉末，75 mg，85%yield，1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 8.39 (t,J=1.8 Hz,1H,H-5’),8.30-8.19(m,1H,H-7’),7.84(d,J=7.8 Hz,1H,H-9’),7.74 (d,J=16.0 Hz,1H,H-3’),7.60 (t,J=8.0 Hz,1H,H-8’),7.22-7.20(m,1H,H-8),6.60(d,J=16.0 Hz,1H,H-2’),6.47(dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.11(d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.58(d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.69(s,2H,H-18),3.72(s,3H,-OCH3),3.27 (d,J=5.9 Hz,1H,H-3),3.07 (dd,J=14.0,6.0 Hz,1H,H-5a),2.89(dd,J=15.5,6.3 Hz,1H,H-6a),2.75 (dd,J=15.0,8.7 Hz,2H,H-9a),2.61 ((dd,J=15.0,2.5 Hz,1H,H-9b),2.13(s,3H,-OCOCH3),2.05(s,1H,H-6b),1.86 (s,3H,CH3-17),1.82-1.62(m,5H,H-1,2,5),1.58(s,3H,CH3-12).

13C NMR (101 MHz,CDCl3)：δ 173.1,169.4,168.1,165.8,148.7,142.2,141.8,137.9,136.1,134.5,133.7,133.3,130.0,126.7,124.6,122.4,121.7,121.1,90.3,83.8,69.9,55.2,52.0,49.6,33.3,30.7,28.8,27.8,24.3,21.8,20.2,14.7.

HR-ESI-MS m/z：616.2170(M+Na)+,理論值：616.2159[M+Na]+

B10：淡黃色粉末，86 mg，89%yield,1H NMR(400 MHz,CDCl3)：δ 8.02 (d,J=15.9 Hz,1H,H-3’),7.61(dd,J=8.7,5.9 Hz,1H,H-6’),7.37(dd,J=8.1,2.2 Hz,1H,H-8’),7.21(m,1H,H-8),7.07(td,J=8.4,2.3 Hz,1H,H-9’),6.46 (dd,J=15.1,11.0 Hz,1H,H-14),6.36(d,J=15.9 Hz,1H,H-2’),6.10(d,J=11.0 Hz,1H,H-15),5.56 (d,J=15.1 Hz,1H,H-13),4.67(s,2H,H-18),3.72(s,3H,-OCH3),3.26(d,J=5.9 Hz,1H,H-3),3.07 (dd,J=14.2,6.3 Hz,1H,H-5a),2.89(dd,J=15.4,6.1 Hz,1H,H-6a),2.75(dd,J=15.0,8.8 Hz,1H,9a),2.60 (dd,J=15.1,3.5 Hz,1H,9b),2.12(s,3H,-OCOCH3),2.04(s,1H,H-6b),1.85(s,3H,CH3-17),1.81-1.68(m,5H,H-1,2,5),1.58(s,3H,CH3-12).

HR-ESI-MS m/z：667.1325(M+Na)+,理論值：667.1319[M+Na]+。

2.2本實(shí)驗(yàn)采用MTT(噻唑藍(lán))法測試了目標(biāo)化合物對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖抑制活性和正常細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。體外活性篩選實(shí)驗(yàn)以霉酚酸酯（MMF）為陽性對(duì)照藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 新型土槿乙酸醇酯衍生物的體外抑制作用和細(xì)胞毒性[aIC50(10-6mol·L-1)]Tab 1 In vitro inhibitory effects and cytotoxicities of novel PB and indoles derivatives[aIC50(10-6mol·L-1)]

3 討論

結(jié)果顯示土槿乙酸C-18醇酯系列衍生物多數(shù)具有顯著的免疫抑制活性，其中衍生物B2，B6，B7對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制活性強(qiáng)于土槿乙酸，衍生物B3與土槿乙酸的抑制活性類似，尤其是B6抑制活性接近陽性對(duì)照藥霉酚酸酯。衍生物B6，B7對(duì)B淋巴細(xì)胞抑制活性明顯強(qiáng)于土槿乙酸，衍生物B1，B2，B8，B9對(duì)B淋巴細(xì)胞抑制活性與土槿乙酸活性接近。大多數(shù)化合物對(duì)正常細(xì)胞作用很弱，遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照藥，呈現(xiàn)高效低毒特性。

呋喃系列衍生物：對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖抑制活性，當(dāng)引入呋喃環(huán)時(shí)其活性降低，當(dāng)5-位有吸電子基硝基的存在時(shí)其活性明顯提高，引入鹵素溴原子時(shí)其活性較土槿乙酸雖有提高，但比硝基取代時(shí)活性低，引入四氫呋喃酸時(shí)其活性則完全喪失。由此而推測當(dāng)引入有吸電子基取代呋喃環(huán)時(shí)，形成了邁克爾反應(yīng)受體,這種呋喃環(huán)的電子共軛體系導(dǎo)致了藥理活性增加。B6化合物活性接近于陽性對(duì)照藥，而B5則完全失去活性，二者結(jié)構(gòu)區(qū)別僅僅是-烯酸的取代位置不同，由此推測，引入呋喃丙烯酸有助于提高其藥理活性，且2位取代優(yōu)于3位。

芳香共軛體系系列衍生物：對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖抑制活性，其化合物活性B7＞B8＞B9，而B10無活性。表明肉桂酸的引入有助于提高活性，當(dāng)其芳環(huán)上有吸電子基取代時(shí)其活性降低，至于B10，F(xiàn)和Br原子的引入則導(dǎo)致完全喪失活性。據(jù)此而推測，吸電子基團(tuán)不利于活性的提高，可能是通過吸電子基的引入降低了芳香環(huán)的電子云密度，進(jìn)而影響與靶標(biāo)的結(jié)合。

乙酸C-18醇成酯類化合物，引入呋喃環(huán)，抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖活性明顯增加，引入具有共軛體系的呋喃環(huán)時(shí)活性更佳，并且毒性降低。對(duì)土槿乙酸構(gòu)效關(guān)系的研究將促進(jìn)新型免疫抑制劑的開發(fā)。