一株假絲酵母菌SF260生產(chǎn)槐糖脂培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化

王愛云，張艷敏，王 偉，張永剛，董學(xué)前*

（1.魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺264025；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東 濟南250013）

槐糖脂是由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外糖脂類生物表面活性劑，具有增溶、乳化、潤濕、發(fā)泡、分散、降低表面張力等化學(xué)表面活性劑的通用性能；與目前廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代工業(yè)領(lǐng)域中的以石油為原料化學(xué)合成的表面活性劑相比，具有低毒或無毒、可降解、耐溫、耐高鹽、使用pH范圍廣及對環(huán)境友好等特性[1-5]?；碧侵嘁曰旌衔锏男问酱嬖冢碧侵肿佑删哂杏H水性的二聚糖（兩個葡萄糖分子以β-1,2糖苷鍵結(jié)合）和具有疏水性的ω-（或ω-1）羥基脂肪酸組成，槐糖脂結(jié)構(gòu)的不同主要表現(xiàn)在脂肪酸碳鏈長度不同、飽和程度不同、乙?；潭炔煌约笆欠翊嬖趦?nèi)酯鍵作用[6-8]。根據(jù)槐糖脂結(jié)構(gòu)中是否存在內(nèi)酯鍵，可分為內(nèi)酯型和酸型，內(nèi)酯型槐糖脂具有更好的降低液體表面張力的能力和抗菌活性，而酸型槐糖脂具有更好的水溶性和發(fā)泡能力[9-10]。近年來，不斷加劇的環(huán)境壓力以及人們環(huán)保意識的提高，對環(huán)保型生物表面活性劑的需求不斷提升，因此環(huán)境友好型生物表面活性劑槐糖脂在日化、石油開采、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)境保護(hù)、廢油回收等眾多領(lǐng)域受到了廣泛重視[11]。另外槐糖脂除具有作為表面活性劑的特性外，還具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等生理活性[12]，在食品防腐和醫(yī)藥等領(lǐng)域也具有一定的應(yīng)用潛力。

槐糖脂作為有效替代化學(xué)表面活性劑的生物表面活性劑[13]，發(fā)展?jié)摿薮螅叱杀?、低產(chǎn)量和低生產(chǎn)強度影響了槐糖脂規(guī)模化生產(chǎn)及推廣。盡管槐糖脂在多個工業(yè)領(lǐng)域受到重視，但還缺少規(guī)?；a(chǎn)企業(yè)。降低生產(chǎn)成本、提高槐糖脂產(chǎn)量、提高生產(chǎn)強度成為槐糖脂產(chǎn)業(yè)化研究的重點[14-15]，而其中獲得優(yōu)良的槐糖脂生產(chǎn)菌株和提高此菌株生產(chǎn)槐糖脂的能力更是熱點?；碧侵a(chǎn)菌主要有蜂生假絲酵母（Candida apicola）、Candida bogoriensis、Candida bombicola、Candida batistate等，其中Candida bombicola由于生產(chǎn)性能穩(wěn)定，產(chǎn)量較高，目前是主要的槐糖脂生產(chǎn)菌[16]。研究表明，假絲酵母菌以親水性和親脂性混合底物作為碳源發(fā)酵時，可以得到較高產(chǎn)量的槐糖脂[17]。本研究利用篩選到的假絲酵母菌（Candida bombicola）SF260以水溶性和非水溶性混合底物作為碳源生產(chǎn)槐糖脂，利用單因素及正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，并在此基礎(chǔ)上探討5 L發(fā)酵罐中槐糖脂發(fā)酵工藝，以提高槐糖脂產(chǎn)量，為進(jìn)一步放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料與方法

1.1.1 供試菌株

假絲酵母菌（Candida bombicola）SF260：山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

植物油、葡萄糖（均為食用級）：山東西王生化科技有限公司；酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：安琪酵母股份有份公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂（均為分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 6.0。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，菜籽油80 g/L，酵母粉1 g/L，KH2PO41 g/L，Na2HPO·412H2O 1 g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，初始pH 7.0。

上述培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1900型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；YXQ-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；ZQWY-200N臥式全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；BLBIO-5SJ 5 L全自動發(fā)酵罐：上海百倫生物科技有限公司；SBA-40D生物傳感器：山東省科學(xué)院生物研究所；氮吹儀ND100-1：杭州瑞誠儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子液制備：于500 mL三角瓶內(nèi)裝100 mL種子培養(yǎng)基，接種一環(huán)新鮮的斜面種子，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液制備：于500 mL三角瓶內(nèi)裝80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按5%（V/V）接種量接入液體種子，250r/min、28℃培養(yǎng)120h。

1.3.2 單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方

考察80 g/L親水性碳源（葡萄糖、糖蜜、果糖、蔗糖）、80 g/L親脂性碳源（轉(zhuǎn)基因大豆油、非轉(zhuǎn)基因大豆油、玉米油、菜籽油、棉籽油、花生油）、2 g/L氮源（酵母粉、玉米漿、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨）、無機鹽（Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO·47H2O）對假絲酵母菌SF260發(fā)酵生產(chǎn)槐糖脂的影響。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖、轉(zhuǎn)基因大豆油、酵母粉、Na2HPO·412H2O、KH2PO4共5個因素設(shè)計正交試驗L1（645），得出產(chǎn)槐糖脂最優(yōu)培養(yǎng)基配方，正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.4 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的優(yōu)化

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，將種子液按5%（V/V）接種量接入裝有2.5L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中；初始通氣3L/min；攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min；發(fā)酵過程中pH降至3.5時，用2 mol/L NaOH控制pH 3.5；培養(yǎng)溫度28 ℃；分別采用兩種補料工藝發(fā)酵，比較其對發(fā)酵的影響，探討不同調(diào)控pH和轉(zhuǎn)速對槐糖脂發(fā)酵的影響。兩種補料工藝分別為：

（1）間歇補料工藝：發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至10 g/L以下后，每隔12 h，補糖至20 g/L，豆油質(zhì)量濃度降至10 g/L以下后，每隔12 h，補油至20 g/L，pH降至3.5后用2 mol/L NaOH控制pH 3.5。

（2）連續(xù)補料工藝：葡萄糖、豆油質(zhì)量濃度降至10 g/L以下后，用連續(xù)流加的方式控制發(fā)酵液中葡萄糖、大豆油質(zhì)量濃度為10～15 g/L，pH降至3.5后用2 mol/L NaOH控制pH3.5；調(diào)控pH分別為4.0、3.5、3.0；轉(zhuǎn)速分別為200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min。

1.3.5 檢測方法[17-19]

總槐糖脂產(chǎn)量測定：蒽酮法；菌體量測定：取2 mL發(fā)酵液，加入等體積的洗脫液（正丁醇∶乙醇∶氯仿=10∶10∶1，V/V）混勻，5 000 r/min條件下離心10 min，然后蒸餾水洗滌2遍，干燥至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量；葡萄糖濃度測定：采用生物傳感器SBA測定；大豆油濃度測定：取10 mL發(fā)酵液，加入等體積的正己烷提取兩次，通過分液漏斗分離含有植物油的上層，通過氮吹儀將上層干燥至恒質(zhì)量，并稱質(zhì)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS和Origin 8.6 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 親水性碳源篩選

圖1 不同親水性碳源對發(fā)酵的影響Fig. 1 Effect of different hydrophilic carbon sources on fermentation

由圖1可知，葡萄糖有利于槐糖脂合成和菌體生長，槐糖脂產(chǎn)量達(dá)（68.79±2.12）g/L，菌體量達(dá)（22.41±1.15）g/L，果糖、蔗糖及糖蜜不利于菌體生長且槐糖脂的產(chǎn)量較低。因此，選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的親水性碳源。

2.1.2 親脂性碳源篩選

圖2 不同親脂性碳源對發(fā)酵的影響Fig. 2 Effect of different lipophilic carbon sources on fermentation

由圖2可知，以大豆油為親脂性碳源時，槐糖脂產(chǎn)量最高，其中，轉(zhuǎn)基因大豆油槐糖脂產(chǎn)量為（76.96±1.45）g/L，非轉(zhuǎn)基因大豆油槐糖脂產(chǎn)量為（73.32±1.72）g/L，轉(zhuǎn)基因大豆油與非轉(zhuǎn)基因大豆油有所差別，試驗中非轉(zhuǎn)基因大豆油略低，這可能與豆油來源有關(guān)系，其次是菜籽油槐糖脂產(chǎn)量為（71.56±1.58）g/L，高于以玉米油槐糖脂產(chǎn)量（64.35±1.35）g/L、棉籽油槐糖脂產(chǎn)量（66.16g±1.47）g/L、花生油槐糖脂產(chǎn)量（68.53±1.76）g/L，且6種親脂性碳源菌體量無顯著差異（P＞0.05），說明親脂性碳源對菌體生長影響較小，對產(chǎn)物合成有一定影響，植物油中不同脂肪酸組成可能是引起槐糖脂產(chǎn)量差異的原因[20]。因此，選擇轉(zhuǎn)基因大豆油作為發(fā)酵培養(yǎng)基的親脂性碳源。

2.1.3 不同氮源對發(fā)酵的影響

圖3 不同氮源對發(fā)酵的影響Fig. 3 Effect of different nitrogen sources on fermentation

由圖3可知，有機氮源（酵母粉、玉米漿、蛋白胨）比無機氮源（氯化銨、硫酸銨）更有利于菌體生長和產(chǎn)物合成，有機氮源槐糖脂平均產(chǎn)量為（59.36±1.12）g/L，平均菌體量為（25.37±1.05）g/L，高于無機氮源槐糖脂平均產(chǎn)量（38.67±1.43）g/L，平均菌體量（17.08±1.24）g/L，有機氮源中以酵母粉效果最好，槐糖脂產(chǎn)量達(dá)（67.75±1.12）g/L，菌體量達(dá)（27.34±0.87）g/L。因此，選擇酵母粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.1.4 無機鹽對發(fā)酵的影響

圖4 無機鹽（Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O）對發(fā)酵的影響Fig. 4 Effect of inorganic salts (Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O) on fermentation

由圖4可知，隨著Na2HPO·412H2O質(zhì)量濃度在0～6 g/L范圍內(nèi)增加，槐糖脂產(chǎn)量、菌體量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)Na2HPO4·12H2O質(zhì)量濃度為4 g/L時，最有利于菌體生長和產(chǎn)物合成，槐糖脂產(chǎn)量達(dá)（72.23±1.52）g/L，菌體量達(dá)（28.04±0.52）g/L；當(dāng)Na2HPO·412H2O質(zhì)量濃度＞4 g/L之后，菌體量和產(chǎn)物量降低；隨著KH2PO4質(zhì)量濃度在0～6 g/L范圍內(nèi)增加，菌體量逐漸增加，KH2PO4質(zhì)量濃度增加到2 g/L時，槐糖脂產(chǎn)量最高為（70.89±1.62）g/L，再繼續(xù)增加KH2PO4質(zhì)量濃度，槐糖脂產(chǎn)量基本保持不變；隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度0～4 g/L范圍內(nèi)逐漸增加，菌體量和槐糖脂產(chǎn)量基本保持不變，MgSO4·7H2O對菌體量和槐糖脂產(chǎn)量影響較小。因此，選擇4 g/L Na2HPO·412H2O、2 g/L KH2PO4添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗

基于單因素試驗，選取葡萄糖（A）、轉(zhuǎn)基因大豆油（B）、酵母粉（C）、Na2HPO4·12H2O（D）及KH2PO（4E）添加量5個影響因子，采用5因素4水平，以槐糖脂產(chǎn)量為評價指標(biāo)，進(jìn)行L1（645）正交試驗，正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

由表2極差可知，對槐糖脂產(chǎn)量的影響順序由大到小為：B（轉(zhuǎn)基因大豆油）＞A（葡萄糖）＞C（酵母粉）＞D（KH2PO4）＞E（Na2HPO·412H2O），其最優(yōu)組合為A2B2C3D3E1，即葡萄糖60 g/L，轉(zhuǎn)基因大豆油80 g/L，酵母粉3 g/L，Na2HPO·412H2O 3 g/L，KH2PO41 g/L。用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行3次平行驗證試驗，結(jié)果槐糖脂的平均產(chǎn)量為88.79 g/L，較優(yōu)化前提高了27.22%。

2.2 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1 不同補料工藝對發(fā)酵的影響

圖5 間歇補料工藝發(fā)酵曲線Fig. 5 Fermentation curve of batch feeding process

圖6 連續(xù)補料工藝發(fā)酵曲線Fig. 6 Fermentation curve of continuous feeding process

由圖5和圖6可知，0～36 h為菌體生長期，大量菌體生成，有少量槐糖脂合成，此階段糖消耗主要是用于菌體生長，此階段油脂消耗速度較慢，36 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)物開始大量合成，合成速率加快，油脂消耗速度也增加，油脂消耗主要用于產(chǎn)物合成，對菌體生長影響較小。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度和大豆油質(zhì)量濃度分別降至10 g/L，分別采用間歇和連續(xù)兩種不同的補料工藝，補料發(fā)酵過程中，相對穩(wěn)定的碳源濃度比突變的碳源濃度更適合菌體生長和產(chǎn)物合成。因而，采用連續(xù)補料方式，將葡萄糖、轉(zhuǎn)基因大豆油質(zhì)量濃度維持在10～15 g/L，適宜的葡萄糖、轉(zhuǎn)基因大豆油質(zhì)量濃度使得產(chǎn)物合成以相對恒定的速率穩(wěn)定增長，最終槐糖脂產(chǎn)量達(dá)321.41 g/L，比間歇補料分批發(fā)酵提高了11.9%。

2.2.2 不同pH調(diào)控對發(fā)酵的影響

圖7 不同調(diào)控pH對槐糖脂產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of different pH adjustment on sophorolipids production

由圖7可知，發(fā)酵過程中pH對槐糖脂合成速率影響較大，調(diào)控pH值為4.0時，槐糖脂合成速率最低，且槐糖脂產(chǎn)量最低，調(diào)控pH過高或過低都不利于槐糖脂合成。因此，發(fā)酵pH降至3.5后，用2 mol/L NaOH調(diào)控pH為3.5，槐糖脂產(chǎn)量達(dá)到323.42 g/L。

2.2.3 不同轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響

圖8 不同轉(zhuǎn)速對槐糖脂產(chǎn)量的影響Fig. 8 Effect of different rotation speed on sophorolipids production

由圖8可知，攪拌轉(zhuǎn)速從200 r/min提高到500 r/min，產(chǎn)量出現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象。當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時，槐糖脂產(chǎn)量最低，原因是低攪拌，溶氧不足，產(chǎn)物產(chǎn)量較低。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時，槐糖脂產(chǎn)量最高，204 h時達(dá)到333.56 g/L，且縮短了發(fā)酵時間，原因可能是，由于在產(chǎn)物合成階段，至少需要一個槐糖脂合成的酶-細(xì)胞色素p450單加氧酶的催化，該過程需要分子氧[18]，高溶氧滿足了槐糖脂合成酶對氧氣的需求，有利于產(chǎn)物合成。但繼續(xù)提高攪拌轉(zhuǎn)速，產(chǎn)物并沒有提高，原因可能是高轉(zhuǎn)速形成一定的剪切力對細(xì)胞造成一定的傷害，不能維持正常的生理代謝[21]。因此，最佳攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min。

2.2.4 優(yōu)化后連續(xù)補料分批發(fā)酵工藝試驗

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基與連續(xù)補料工藝進(jìn)行發(fā)酵試驗，結(jié)果見圖9。由圖9可知，發(fā)酵前期0～36 h，菌體濃度迅速增加，為菌體生長期，此時糖耗迅速，油耗緩慢，pH下降迅速，24 h pH降至3.5以下，開始調(diào)控pH 3.5，此階段溶氧降低迅速，這是由于菌體生長是個耗氧的過程，同時葡萄糖的消耗主要用于菌體生長，此階段有少量的槐糖脂生成；36 h后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，溶氧下降緩慢，直至基本保持不變，油耗迅速，槐糖脂進(jìn)入大量合成階段，60 h葡萄糖質(zhì)量濃度＜10 g/L時，開始連續(xù)補加50%葡萄糖，84 h轉(zhuǎn)基因大豆油質(zhì)量濃度＜10 g/L時，開始連續(xù)補加轉(zhuǎn)基因大豆油，葡萄糖、轉(zhuǎn)基因大豆油質(zhì)量濃度維持在10～15 g/L，發(fā)酵204 h，產(chǎn)量達(dá)331.26 g/L，高于JIA X Q等[22]320 h槐糖脂產(chǎn)量384 g/L、發(fā)酵強度1.20 g（/L·h）。

圖9 連續(xù)補料分批發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig. 9 Curve of continuous fed batch fermentation

3 結(jié)論

試驗利用篩選得到的假絲酵母菌SF260為生產(chǎn)菌，通過考察親水性碳源、親脂性碳源、氮源、無機鹽等因素對假絲酵母菌SF260菌株生長和槐糖脂產(chǎn)量的影響，對其發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60 g/L，轉(zhuǎn)基因大豆油80 g/L，酵母粉3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，KH2PO41 g/L，此培養(yǎng)基配方優(yōu)化條件下槐糖脂產(chǎn)量達(dá)88.79 g/L，較優(yōu)化前提高了27.22%。進(jìn)一步在5 L發(fā)酵罐內(nèi)對菌株SF260進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，當(dāng)葡萄糖、轉(zhuǎn)基因大豆油質(zhì)量濃度分別降低至10 g/L后，采用連續(xù)流加補糖方式控制葡萄糖、轉(zhuǎn)基因大豆油質(zhì)量濃度在10～15 g/L，pH降至3.5后，用2 mol/L NaOH控制pH 3.5，轉(zhuǎn)速400 r/min，發(fā)酵時間204 h，槐糖脂產(chǎn)量達(dá)331.26 g/L，發(fā)酵強度1.62 g（/L·h），為進(jìn)一步放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。