苯磺隆對(duì)甘藍(lán)型油菜的殺雄效果及對(duì)其靶標(biāo)ALS活性的影響

付三雄,周曉嬰,戚存扣

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部 棉花油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

目前我國(guó)油菜育種的主攻目標(biāo)為選育優(yōu)質(zhì)雜交種,即把優(yōu)質(zhì)育種和雜種優(yōu)勢(shì)育種結(jié)合起來。實(shí)踐表明,油菜具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。目前,利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)的主要途徑有細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)、細(xì)胞核雄性不育(NMS)、自交不親和(SI)及化學(xué)雜交劑(CHA, chemical hybridizing agent)等[1]。利用化學(xué)雜交劑生產(chǎn)雜交種具有許多優(yōu)點(diǎn),例如：(1)親本選擇范圍廣?；瘜W(xué)殺雄雜種油菜是通過CHA誘導(dǎo)的生理性雄性不育系,不存在像細(xì)胞核質(zhì)互作雄性不育體系中所要求的恢保關(guān)系,因此親本選擇自由,可任意組配雜交組合,有利于優(yōu)中選優(yōu),篩選出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)組合；(2)選育周期短。利用CHA可允許直接使用那些已改良產(chǎn)量、抗病性和品性的育種品種作雜交親本,不需要較長(zhǎng)的時(shí)間來進(jìn)行三系的研制、轉(zhuǎn)育、測(cè)試和培育,可在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出足夠數(shù)量的F1代種子；(3)避免了不育系微粉問題；(4)可利用F2代的優(yōu)勢(shì)?；瘜W(xué)殺雄雜交種不存在育性恢復(fù)問題,雜交的后代又無(wú)育性分離,有實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)多代利用的可能性；(5)可有效代替人工去雄,大大減輕育種工作量[2]。因此,化學(xué)雜交劑育種將成為油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的一條重要途徑。

研究和實(shí)踐表明,苯磺隆是可用于油菜育種的高效無(wú)毒的化學(xué)殺雄藥物[3-4]。磺酰脲類超高效除草劑的作用靶標(biāo)是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)[5]。由于在人或動(dòng)物體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)ALS,因此這種除草劑對(duì)人和動(dòng)物十分安全。乙酰乳酸合成酶(ALS, EC4.1.3.18或acetohydroxy acid synthase, AHAS),是植物和微生物體內(nèi)合成支鏈氨基酸(branched-chain amino acid, BCAA,亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)途徑的首要限速酶[6-7],是由核基因編碼、定位于高等植物葉綠體中的一種蛋白。由于它是多種除草劑和生長(zhǎng)抑制物質(zhì)的作用靶標(biāo),只存在于植物和微生物中,因此ALS抑制型農(nóng)藥對(duì)人畜比較安全。近幾十年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)油菜化學(xué)雜交劑育種進(jìn)行了廣泛的研究。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、西南大學(xué)、四川大學(xué)、陜西省雜交油菜研究中心等單位利用化學(xué)雜交劑制種技術(shù)已經(jīng)育成推廣了“湘雜油”、“渝黃”、“秦優(yōu)”、“寧雜”等系列的20多個(gè)油菜雜交種,產(chǎn)生了明顯的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益[8～11]。油菜化學(xué)殺雄劑研究尤其是其使用雖然取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但其相關(guān)基礎(chǔ)研究仍然很薄弱,目前的研究主要集中在殺雄劑的研制及培育品種方面,而在應(yīng)用基礎(chǔ)方面的研究較少；油菜化學(xué)殺雄劑施用后對(duì)其靶標(biāo)酶ALS活性的影響僅有零星研究[12],還需要進(jìn)一步研究。本研究選用兩個(gè)化學(xué)殺雄國(guó)審品種的母本,綜合前人的研究結(jié)果,使用0.2 μg/mL苯磺隆殺雄劑在油菜小孢子發(fā)育單核期進(jìn)行葉面噴施,分析了苯磺隆對(duì)油菜花器形態(tài)、農(nóng)藝性狀、油菜相對(duì)結(jié)實(shí)率的影響以及對(duì)ALS活性的影響,以期為在早期快速鑒定噴藥效果及深入研究甘藍(lán)型油菜化學(xué)殺雄的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘藍(lán)型油菜品種(系)寧油18號(hào)(化學(xué)殺雄國(guó)審品種寧雜1818的母本)和096030(化學(xué)殺雄國(guó)審品種寧雜1838的母本)來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,經(jīng)多代自交純合。供試藥物苯磺隆為江蘇省激素研究所股份有限公司生產(chǎn)的10%苯磺隆可濕性粉劑。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn) 試驗(yàn)于2016～2017年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地進(jìn)行。在2016年10月8日播種,試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),4行區(qū),行長(zhǎng)3.3 m,行距0.4 m,每行定苗20棵。田間管理同一般大田。

1.2.2 苯磺隆處理 葉面噴施苯磺隆濃度為0.2 μg/mL(有效成分的濃度)。噴藥時(shí)期試驗(yàn)以70%油菜植株主花序最大花蕾長(zhǎng)度為標(biāo)志,噴施處理于油菜最大花蕾長(zhǎng)度為1～2 mm時(shí)進(jìn)行,用小型手動(dòng)噴霧器均勻噴施藥物于葉面,用塑料布把兩邊相鄰的小區(qū)遮蓋。葉面噴施第一次處理于2017年2月26日中午進(jìn)行,單株用藥量為8～10 mL；第二次處理相隔10 d(2017年3月9日)進(jìn)行,單株用藥量為8～10 mL。對(duì)照采用相同用量的水噴施。

1.2.3 觀察和統(tǒng)計(jì)方法 在油菜初花期,噴施苯磺隆處理的3個(gè)重復(fù)從第2行的第2株開始連續(xù)選取10株掛牌,整株套袋自交用于后續(xù)考種；對(duì)照采用相同方法每重復(fù)選取10株掛牌，用于后續(xù)考種。在油菜盛花期,于上午10:00在每重復(fù)選取的10株主花序最上部摘取3朵當(dāng)天開放的花朵,統(tǒng)計(jì)雌蕊長(zhǎng)度、雄蕊長(zhǎng)度、花瓣長(zhǎng)、寬。在收獲前考察每重復(fù)選取的10株的株高、一次分枝數(shù)、主花序長(zhǎng)、角果數(shù)、每角粒數(shù)、角果長(zhǎng)度，計(jì)算相對(duì)結(jié)實(shí)率(處理的單株總粒數(shù)/對(duì)照的單株總粒數(shù))。

1.2.4 ALS活性的測(cè)定 于第一次苯磺隆處理后3 d，取油菜2 mm左右的花蕾于液氮中速凍,保存于-80 ℃的冰箱中，用于ALS活性的測(cè)定。參照Singh等[13]的方法測(cè)定ALS活性。以丙酮酸鈉為底物,在波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物乙酰乳酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮(acetoin)的量,計(jì)算ALS活性。以單位時(shí)間(h)內(nèi)單位質(zhì)量蛋白(mg)生成產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮的含量定義為酶活力,單位為μmol/(mg·h)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯磺隆處理誘導(dǎo)油菜雄性不育的效果

與對(duì)照相比,經(jīng)0.2 μg/mL苯磺隆處理后，油菜花瓣變小,雌蕊長(zhǎng)度與對(duì)照無(wú)明顯差異,雄蕊長(zhǎng)度顯著短于對(duì)照的,且花藥干癟(圖1、表1)。

葉面噴施0.2 μg/mL的苯磺隆對(duì)寧油18號(hào)和096030油菜主要農(nóng)藝性狀的影響見表2。從表2可以看出：0.2 μg/mL苯磺隆處理對(duì)油菜株高、角果長(zhǎng)度、每角粒數(shù)有顯著的抑制作用,但對(duì)一次分枝數(shù)無(wú)顯著影響，對(duì)主花序長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。用0.2 μg/mL的苯磺隆進(jìn)行葉面噴施處理后寧油18號(hào)和096030的相對(duì)結(jié)實(shí)率分別僅有3.97%和4.03%。綜上所述,葉面噴施0.2 μg/mL苯磺隆可誘導(dǎo)油菜雄性不育，處理2次可誘導(dǎo)100%的全不育株率,使整個(gè)花期不育,相對(duì)結(jié)實(shí)率僅約4%。因此,葉面噴施0.2 μg/mL苯磺隆2次可以滿足油菜大田制種純度的需要。

注:“**”表示與對(duì)照在0.01水平上差異顯著。下同。

2.2 苯磺隆處理下油菜ALS活性的變化

從表3可以看出,經(jīng)0.2 μg/mL苯磺隆處理后,2種油菜中的ALS活性均較對(duì)照顯著降低，其中寧油18號(hào)和096030經(jīng)處理后的ALS相對(duì)酶活分別為40.63%和37.23%。

3 討論與結(jié)論

合適的苯磺隆濃度是影響油菜化學(xué)殺雄效果的重要因素,濃度小,殺雄不徹底;濃度過大,易出現(xiàn)藥害,影響結(jié)實(shí)率,導(dǎo)致制種產(chǎn)量低。雖然濃度與劑量也可以高低搭配使用,但與劑量相比,濃度是更重要的因素,如果濃度較低,劑量較大,不能達(dá)到理想的殺雄效果;反之,在一定劑量下,高濃度比低濃度殺雄效果好,導(dǎo)致藥害的可能性也加大。前人研究發(fā)現(xiàn)磺酰脲類用于殺雄的最低濃度為0.02 μg/mL,最高濃度為20 μg/mL。張寶娟等[3]的研究結(jié)果表明,苯磺隆葉面噴施處理濃度范圍為0.075～0.1 μg/mL,單株用藥量為15～20 mL時(shí),殺雄徹底,藥害較輕。黃馳等[4]的研究結(jié)果表明：在成都地區(qū)油菜重要骨干自交系主花序最大花蕾長(zhǎng)度達(dá)1.50～2.00 mm時(shí)用苯磺隆進(jìn)行第一次葉面噴施,隔10 d左右再進(jìn)行第二次噴施,每次單株受藥量8～10 mL,0.30 μg/mL苯磺隆可誘導(dǎo)群體90%以上的不育株率;每次單株受藥量15～20 mL,0.05～0.10 μg/mL苯磺隆可誘導(dǎo)群體100%的不育株率,且無(wú)藥害,能保持整個(gè)花期不育。綜合前人的研究結(jié)果,我們通過葉面噴施0.2 μg/mL苯磺隆,單株用藥量8～10 mL,間隔10 d左右再進(jìn)行第2次處理,單株用藥量8～10 mL,葉面噴施2次可誘導(dǎo)100%的全不育株率,使整個(gè)花期不育,相對(duì)結(jié)實(shí)率僅約4%,表明0.2 μg/mL苯磺隆處理2次可以滿足油菜大田制種純度的需要。

表2 葉面噴施苯磺隆對(duì)油菜主要農(nóng)藝性狀的影響

表3 葉面噴施苯磺隆對(duì)油菜中ALS活性的影響

阻礙油菜化學(xué)殺雄劑推廣應(yīng)用的一個(gè)難點(diǎn)是化學(xué)殺雄劑使用后的效果評(píng)價(jià)。以往研究?jī)H僅側(cè)重于從花瓣的大小及直徑、柱頭長(zhǎng)短、結(jié)實(shí)率、植株育性及植株高度等性狀評(píng)價(jià)化學(xué)殺雄劑的效果,但是要獲取這些評(píng)價(jià)指標(biāo)基本在藥效發(fā)揮的中后期及結(jié)實(shí)期,對(duì)于化學(xué)殺雄劑噴藥量及噴藥效果的預(yù)測(cè)無(wú)能為力,若發(fā)生藥害或噴藥量不足,想再實(shí)施補(bǔ)救措施則為時(shí)已晚。因此如何在早期快速鑒定噴藥效果成了當(dāng)前亟待解決的問題。近年來有不少通過測(cè)定ALS的活性來研究植株對(duì)除草劑抗性的快速鑒定方法[14-15]；李亞東等[16]的研究結(jié)果表明,新疆不同小麥品種之間ALS活性差異極為顯著。劉偉等[17]研究得出不同作物間甚至同種作物不同品種間對(duì)ALS抑制劑類除草劑的耐藥性均存在差異,不同品種小麥對(duì)啶磺草胺的耐受性同樣存在極顯著差異。最近的研究從分子水平上驗(yàn)證了ALS基因的表達(dá)量變化及突變可以影響植物對(duì)除草劑的抗性[18～20],說明這也可能是一個(gè)有效的方法。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)：ALS基因存在組織表達(dá)特異性,在葉片中表達(dá)量最大,在4輪花器官(萼片、花瓣、心皮和雄蕊)均有表達(dá),說明ALS參與植株發(fā)育,參與花器官的發(fā)育；在花瓣和雄蕊中表達(dá)最弱,表明雄蕊不易受影響。本研究嘗試在噴藥早期活體測(cè)定ALS的活性,通過比較對(duì)照與處理之間的差異來快速鑒定和預(yù)測(cè)殺雄劑苯磺隆的噴藥量是否達(dá)到合理范圍,結(jié)果表明在苯磺隆處理下2種油菜中的ALS活性均比對(duì)照顯著降低,ALS相對(duì)酶活分別為40.63%和37.23%,說明ALS活性的變化有可能作為快速鑒定和預(yù)測(cè)殺雄劑的噴藥量是否達(dá)到合理范圍的指標(biāo)。但是前人的離體試驗(yàn)研究表明：不同玉米品種對(duì)單嘧磺隆的敏感性有差異,單嘧磺隆對(duì)不同玉米品種ALS活性的影響存在差異,但對(duì)同一自交系玉米的ALS活性的影響差異不大；低濃度的單嘧磺隆可刺激活體ALS的活性,高濃度的則具有抑制作用[21]。因此要建立不同品種的ALS活性與不同藥劑噴藥劑量之間的函數(shù)關(guān)系需要植物品種特性、植株大小、ALS活性、藥劑吸收量等多年份的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，這樣才能預(yù)測(cè)得到更為精準(zhǔn)的殺雄劑合理施用劑量。