滇黃精對急性肺損傷模型大鼠的炎癥因子及體內(nèi)氧自由基的影響

黃鳳玉

（廣西貴港市人民醫(yī)院，貴港 537100）

急性肺損傷性肺炎（ALI）指各種內(nèi)外應(yīng)激源導(dǎo)致的彌漫性肺泡實(shí)質(zhì)損傷和急性進(jìn)行性呼吸脅迫癥，常表現(xiàn)頑固性低氧血綜合征[1－3]。它代表了肺損傷發(fā)展延續(xù)的整個過程，是全身炎癥綜合征（SIRS）體內(nèi)失控的持續(xù)性自我放大和破壞過程，常伴隨多種炎性因子和氧自由基的釋放，會引起肺部微血管通透性增高、炎性細(xì)胞浸潤，富含多種蛋白質(zhì)的滲出液肺泡內(nèi)蓄積時[4－5]，肺部正常生理狀態(tài)難以持續(xù)，多發(fā)生肺水腫和透明膜，長期遷延還會導(dǎo)致間質(zhì)纖維化[6]，發(fā)生肺實(shí)變，因此對急性損傷性肺炎的炎癥因子、炎性細(xì)胞和氧自由基相關(guān)指標(biāo)的檢測[7－9]可以很好地反應(yīng)機(jī)體的肺生理狀態(tài)[10－11]。本研究選用氣管內(nèi)滴灌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）的急性肺損傷性大鼠模型，從炎癥、氧化損傷和肺生理狀態(tài)角度來觀察滇黃精對急性肺損傷性肺炎大鼠的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗材料 50只健康的雄性SD大鼠，體質(zhì)量185～215 g（維通利華有限公司，北京）；滇黃精水提液（綠生藥業(yè)有限公司，云南）；LPS（Sigma，美國）；吉姆薩染液（雷根生物，北京）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）；辣根過氧化物酶標(biāo)二抗（Abcam，美國）髓過氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（建成生物工程研究所，南京）。

1.2 方法 隨機(jī)分組50只SD雄性大鼠，每組10只，分別標(biāo)注：正常對照組（NCG），模型組（NMG），滇黃精低劑量組（LLG）、中劑量組（MLG）、高劑量組（HLG）。ALI模型建立：10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠50°仰臥保定并剝離氣管，1 mL注射器緩緩滴入配好的LPS（5 mg/kg），并立即旋轉(zhuǎn)，使LPS均勻分布[9，12]。對正常對照組大鼠應(yīng)氣管內(nèi)滴注等體積的生理鹽水，股動脈取血進(jìn)行血?dú)夥治觯琍aO2≤85%，PaCO2≥40%為造模成功。確定造模成功后4 h開始腹腔注射配好的滇黃精水提液，24 h后開始檢測相關(guān)指標(biāo)[12－13]。

1.3 觀察指標(biāo) 血清中各炎癥因子和氧化自由基相關(guān)指標(biāo)檢測：取大鼠左心室1 mL血液與標(biāo)準(zhǔn)品混合，加入轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）－α、白介素－6（IL－6）、白介素－10（IL－10）和白介素－1β（IL－1β）單抗包被的酶標(biāo)板，室溫放置2 h后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗4次，加入抗抗體，室溫孵育2h，再用PBS洗4次，加入酶標(biāo)抗體后30min，PBS洗4次，加入A、B顯色液后加終止液，酶標(biāo)儀下檢測相應(yīng)比色值并計算各炎癥因子的含量。按說明書采用硫代巴比妥鈉酸法和亞硝酸鹽法檢測血清MDA、MPO含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH－Px）活性[12－14]。肺泡灌流液中炎性細(xì)胞計數(shù)：收集肺泡灌流液中炎性細(xì)胞時，用25%烏拉坦處死大鼠，分理出氣管和肺后切開氣管并插入塑料管，15 mL生理鹽水反復(fù)沖洗，紗布過濾回收灌洗液，吉姆薩染色后計數(shù)各炎性細(xì)胞數(shù)量。肺生理指標(biāo)檢測：股動脈取血，離心分離血清后血?dú)馍治鰞x檢測PaO2值。采血后用剪刀剪開大鼠胸腔，取出全部肺并用濾紙吸去表面殘留液體，稱質(zhì)量計算肺系數(shù)（LI）：[肺質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×10]；取新鮮左肺，稱質(zhì)量后60℃烘箱連續(xù)烘干48 h后稱質(zhì)量，計算W/D[肺濕質(zhì)量（mg）/干質(zhì)量（mg）×100%]、含水量[（W－D）/W×100%]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS21．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滇黃精對急性肺損傷模型大鼠LI、W/D、肺含水量以及動脈氧分壓的影響 與正常組大鼠相比，模型組大鼠的LI、W/D、（W－D）/W明顯升高，PaO2明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），說明造模成功。與ALI組相比，實(shí)驗組大鼠的LI、W/D、（WD）/W明顯降低，PaO2明顯升高，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），而且高劑量組與中劑量組相比有明顯差異（P＜0．01），這種趨勢有劑量依賴性，結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠肺泡灌流液中炎性細(xì)胞的數(shù)量 數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠的肺泡灌流液中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0．01），而滇黃精使用的各實(shí)驗組炎性細(xì)胞數(shù)量均下降（P＜0．01），而且高劑量組與中劑量組相比有明顯差異（P＜0．05），這種趨勢有劑量依賴性，見表2。

表2 大鼠肺泡灌流液中炎性細(xì)胞數(shù)量Tab.2 Number of inflammatory cellsin rat alveolar perfusate（106/L

注：與正常組相比，*P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．01；與中劑量組相比，△P＜0．05。

組別 動物數(shù) 單核細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 巨噬細(xì)胞正常對照組 10 2．0±0．5 3．3±0．2 2．7±0．4 3．2±0．6模型組 10 13．1±1．2* 41．9±2．9* 18．7±2．1*29．6±1．3*低劑量組 10 12．6±0．2# 40．8±2．3# 18．3±2．5# 28．7±1．4#中劑量組 10 6．3±0．7# 16．4±2．6# 6．7±1．9# 12．5±1．4#高劑量組 10 3．6±0．3#△ 4．2±0．4#△ 3．4±1．2#△ 4．3±1．7#△

2.3 各組大鼠血清中炎癥因子水平 數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠血清中TGF－α、IL－6、IL－1β比對照組高，IL－10水平低（P＜0．05），而實(shí)驗組大鼠的血清中TGF－α、IL－6、IL－1β水平比模型組低，IL－10水平高（P＜0．05），高劑量組與中劑量組相比有明顯差異（P＜0．05），這種趨勢有劑量依賴性。見表3。

2.4 各組大鼠血清中SOD、MDA、MPO以及GSHPx水平 數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠血清中MDA、MPO比對照組高，SOD、GSH－Px比對照組低（P＜0．05）；而實(shí)驗組大鼠的血清中MDA、MPO水平比模型組低，SOD、GSH－Px水平高（P＜0．05），高劑量組與中劑量組相比有明顯差異（P＜0．05），這種趨勢有劑量依賴性。見表4。

表3 各組大鼠血清中炎癥因子水平Tab.3 Inflammatory factorsin serum of ratsin each group（pg/mL

表3 各組大鼠血清中炎癥因子水平Tab.3 Inflammatory factorsin serum of ratsin each group（pg/mL

注：與正常組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與中劑量組相比，△P＜0．01。

組別 動物數(shù) TGF－α IL－6 IL－10 IL－1β正常對照組 10 25．80±1．68 18．88±1．74 114．80±4．63 25．42±1．68模型組 10 84．35±2．13* 103．54±4．47* 74．25±2．15*342．72±4．81*低劑量組 10 75．92±2．91# 89．23±4．21# 87．61±3．11#275．53±5．01#中劑量組 10 57．66±2．83# 60．62±3．85# 90．17±2．42#163．42±5．25#高劑量組 10 43．52±2．36#△ 89．23±4．21#△99．19±3．22#△ 73．74±4．92#△

表4 各組大鼠血清中SOD、MDA、MPO以及GSH-Px水平Tab.4 SOD,MDA,MPO and GSH-px levelsin serum of ratsin each grouppg/mL

表4 各組大鼠血清中SOD、MDA、MPO以及GSH-Px水平Tab.4 SOD,MDA,MPO and GSH-px levelsin serum of ratsin each grouppg/mL

注：與正常組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與中劑量組相比，△P＜0．01。

GSH－Px（U/mgport）正常對照組 10 0．97±0．43 0．62±0．08 85．06±1．73 53．24±2．08模型組 10 2．66±0．23*2．87±0．11*52．96±1．44*43．01±1．99*低劑量組 10 1．82±0．26# 2．06±0．34#70．52±1．92#48．99±2．13#中劑量組 10 1．32±0．34# 1．22±0．23#76．24±2．16#50．82±2．06#高劑量組 10 1．11±0．65#△0．81±0．26#△83．11±2．42#△52．16±1．34#△組別 動物數(shù) MDA（ng/mgport）MPO（U/mgport）SOD（U/mgport）

3 討論

急性損傷性肺炎是一種致病因素引起全身炎性反應(yīng)綜合征集中于肺部表現(xiàn)的疾病[1，3]，多表現(xiàn)肺部或全身炎癥反應(yīng)的過度失控，參與其中的炎性細(xì)胞主要有中性粒細(xì)胞（也叫多核白細(xì)胞）、肺單核巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。應(yīng)激原刺激后機(jī)體常產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，如TNF－α、IL－1β、IL－6，而抗炎因子IL－10多表現(xiàn)為低表達(dá)[4－5]。這些炎癥因子在肺局部的活化，啟動了“細(xì)胞和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”系統(tǒng)，進(jìn)而啟動“瀑布樣”炎癥連鎖反應(yīng)，增強(qiáng)肺組織細(xì)胞通透性，使大量高蛋白液體進(jìn)入肺部，改變肺部生理穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)急性肺水腫，多表現(xiàn)為LI、W/D、（W－D）/D和PaO2的改變。急性肺損傷發(fā)生時，多引起機(jī)體氧自由基的損傷，增強(qiáng)肺組織氧化應(yīng)激水平，通過直接、間接作用導(dǎo)致肺組織損傷。MDA是自然狀態(tài)下體內(nèi)氧自由基過度氧化胞膜脂肪酸引起，它與體內(nèi)氧自由基損傷水平呈正相關(guān)[7]。而機(jī)體過度氧化會降低SOD和GSH－Px的活性[15]，兩者均為抗過氧化物質(zhì)，活性降低時，過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，體內(nèi)氧化－抗氧化平衡向氧化方向偏移，使體內(nèi)的氧化損傷不斷惡化。LPS是一種革蘭陰性菌的胞外成分，主要活性物質(zhì)是脂多糖，近年來研究人員多采用LPS的注射建立感染后ALI模型，誘發(fā)多種炎性因子和氧自由基的釋放。急性損傷性肺炎常用的造模方法有4種——霧化吸入法、氣管滴入法、腹腔注射法和尾靜脈注射法[9]。研究表明，經(jīng)支氣管低注導(dǎo)致的肺損傷模型病理指標(biāo)最明顯，最符合本研究對模型動物的實(shí)驗要求，而且直接支氣管注射的方法會減少對機(jī)體其他部位的毒副作用，還能有效降低死亡率[8－11]，因此本研究采用氣管滴注LPS的方法制作ALI模型。

黃精主要活性成分有多糖、氨基酸、黃酮、蒽醌類化合物等[12]，黃精多糖可以抗病毒、降血糖血脂增強(qiáng)機(jī)體免疫力。黃精總皂苷可以抗氧化、改善機(jī)體血糖水平，有效調(diào)節(jié)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，降低機(jī)體損傷時氧化水平，而滇黃精水提液可以很好地保持黃精各種活性成分的生理生化特性，不使其因為加工喪失或部分喪失活性，達(dá)到更加客觀地評價滇黃精功效的作用。因此本研究選取不同濃度的滇黃精水提液，觀察其在24 h內(nèi)對ALI模型小鼠的炎性狀態(tài)、氧化水平和肺生理的改善效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滇黃精注射的各實(shí)驗組中，促炎因子IL－1β、IL－6、TGF－α明顯高于模型組大鼠，作為抗炎因子的IL－10水平低于模型組（P＜0．05），這說明滇黃精可以通過促進(jìn)炎癥因子、炎性反應(yīng)進(jìn)程來充分發(fā)揮炎癥的保護(hù)作用，從而降低機(jī)體應(yīng)激水平，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，而且高劑量組的這種趨勢明顯優(yōu)于中劑量組（P＜0．05），說明24 h內(nèi)滇黃精對急性肺損傷大鼠模型的這種保護(hù)作用有劑量依賴傾向。肺生理指標(biāo)和各分組內(nèi)炎性細(xì)胞的數(shù)量差別也佐證了這點(diǎn)。造模成功大鼠注射滇黃精后肺泡灌流液中MDA和MPO水平下降（P＜0．05），說明滇黃精的注入降低了大鼠體內(nèi)的氧化損傷水平，抗過氧化物SOD和GSH－Px活性增強(qiáng)也說明實(shí)驗鼠體內(nèi)的過氧化反應(yīng)降低（P＜0．05），進(jìn)一步闡明了滇黃精對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷性大鼠模型的氧自由基影響。

綜上所述，滇黃精可以有效改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷性大鼠模型體內(nèi)的炎癥反應(yīng)水平，避免炎性細(xì)胞在肺泡局灶的過度堆積，降低炎癥反應(yīng)對機(jī)體的氧自由基損傷，降低機(jī)體發(fā)生肺水腫的可能性，從而遏制了疾病的進(jìn)一步發(fā)展。