高效液相色譜法測定漁業(yè)用水中喹乙醇代謝物殘留量

史艷偉，孟麗華，江桂英，簡康，時彥民

(1.濟寧市漁業(yè)監(jiān)測站； 2.濟寧市任城區(qū)水產(chǎn)局:山東 濟寧272000)

喹乙醇屬于喹噁啉類化合物，是一種化學合成的抗菌促生長劑[1]。喹乙醇曾一度在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中作為一種較好的生長促進劑添加于飼料中使用，可促進動物生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率[2]。喹乙醇本身不穩(wěn)定，在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有10余種，其中3-甲基喹噁啉-2羧酸(MQCA)是主要代謝物，理化性質(zhì)相對穩(wěn)定，是監(jiān)控喹乙醇常用的目標殘留物[3]，也是國際食品法典委員會認定的標示殘留物。3-甲基喹噁啉-2羧酸(MQCA)能抑制脫氧核糖核酸的合成，可導致染色體畸變，屬致癌物[4]，不僅對水生動物的健康造成威脅[5]，進入人體后也會造成人體慢性中毒、產(chǎn)生耐藥性及三致等危害[6]。因此，很多國家禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用喹乙醇，如歐盟在EC2788/98決議中已將喹乙醇列為禁用藥[7]?！吨袊F藥典》也明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖[8]。但是，由于經(jīng)濟利益的驅(qū)使和科學知識的缺乏，養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用喹乙醇作為飼料添加劑的現(xiàn)象仍然存在。有研究表明[9-10]，不能被動物機體吸收的喹乙醇及其代謝物常以糞尿、飼料等形式排入生態(tài)環(huán)境，對土壤和水體造成污染，對生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在危害。因此，檢測喹乙醇及其代謝物在水產(chǎn)品及養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留已非常必要。

目前，涉及MQCA殘留檢測的研究集中在水產(chǎn)品[11-15]，動物組織[16-19]和奶類[20]等食品相關(guān)領(lǐng)域，對于MQCA在環(huán)境中的殘留檢測報道較少，僅見張沖[21]研究了喹乙醇及其代謝物在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律及分析方法，漁業(yè)用水中MQCA的殘留檢測方法未見相關(guān)報道。本研究建立了適用于漁業(yè)用水中測定MQCA的高效液相色譜法，為喹乙醇代謝物殘留檢測提供了靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法，為保護漁業(yè)環(huán)境、保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了有力的技術(shù)支撐。

1 實驗方法

1.1 儀器及試劑

主要包括：Agilent 1200型液相色譜儀(美國Agilent公司)；分析天平(德國賽得利斯，感量0.000 1 g)；旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器有限公司)；玻璃離心管(天玻儀器廠，10 mL)；氮吹儀(美國Agilent公司)；固相萃取裝置(美國Agilent公司)；PAX固相萃取柱60 mg，3 mL(Agela)；甲醇、乙酸乙酯、甲酸(色譜純，科密歐化學試劑有限公司)；鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；1.0%甲酸水溶液；0.05 mol/L乙酸鈉甲醇溶液；2%甲酸乙酸乙酯溶液；3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)標準品(德國Dr. Ehrenstorfer，純度大于98.0%)。

實驗用水符合GB/T 6682—2008中一級水的規(guī)定。所用試劑除另有指定外，均為分析純。

1.2 樣品預處理

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化PAX固相萃取柱，然后準確量取60 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后的漁業(yè)用水(采自山東省濟寧市水產(chǎn)良種繁育場)，轉(zhuǎn)移至PAX固相萃取柱中，控制過柱流速小于1 mL/min，用6 mL乙酸鈉-甲醇溶液淋洗固相萃取柱，抽干，最后用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫。洗脫液在40 ℃條件下用氮氣吹干，吹干后的殘留物用1.00 mL流動相溶液溶解，超聲1 min，渦旋混合1 min，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3 標準系列測定

1.3.1 標準儲備液配置

100 μg/mL標準儲備溶液：準確稱取MQCA標準品0.010 0 g，用甲醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃冰箱中避光保存，有效期為3個月。

1.3.2 標準使用液配置

10 μg/mL標準使用溶液：準確移取100 μg/mL的標準儲備液10.0 mL，定容至100 mL，0～4 ℃避光保存，有效期為1周。

1.3.3 標準曲線繪制

準確量取MQCA標準使用液，用流動相溶液(甲醇-1.0%甲酸水溶液,體積比為4∶6)分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.25、0.50和1.00 μg/mL的標準工作液。各取50 μL進樣，以MQCA標準溶液濃度作為橫坐標，對應峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18柱，250.0 mm×4.6 mm(i.d.)，5.0 μm(或性能相當者)。流動相為甲醇-1.0%甲酸水溶液(4∶6，V/V)，等度洗脫。流速為1.0 mL/min，檢測波長320 nm，柱溫30 ℃，進樣量50 μL。

1.5 結(jié)果計算

試樣中MQCA殘留量按公式(1)計算，計算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

(1)

式(1)中：X為樣品中MQCA殘留量(mg/L)；C為樣品溶液中MQCA的測量濃度(μg/mL)；V為樣品溶液最終定容體積(mL)；V0為樣品溶液量取體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

本實驗選擇PAX-SPE(60 mg/3 mL)柱作為固相萃取柱。本研究比較了HLB(60 mg/3 mL)，PAX-SPE(60 mg/3 mL)以及C18(100 mg/1 mL)3種不同的固相萃取柱對凈化效果的影響(n=6)，結(jié)果表明，MQCA在3種固相萃取柱中回收率的大小為：PAX-SPE>HLB>C18(圖1)。因此，本實驗選擇利用回收率最高的PAX-SPE(60 mg/3 mL)柱。固相萃取是一種利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜分離原理的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來進行，根據(jù)不同目標化合物的性質(zhì)選擇不同的固相萃取柱，其填料的類型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低。PAX-SPE是以陽離子交換混合機理水可浸潤型聚合物為基質(zhì)的萃取小柱，更有利于MQCA的吸附，因此試驗過程損失少，回收率高。

圖1 不同類型固相萃取柱對MQCA回收率的影響(n=6)MD(%)表示開均差。下同。Fig.1Eeffect of SPE column type on MQCArecovery rate(n=6)MD(%)shows mean deviation.The same below.

2.2 上樣體積對回收率的影響

以過濾后的漁業(yè)養(yǎng)殖用水為基底，加入MQCA標準溶液，分別考察10、20、30、40、50、60、70和80 mL上樣體積(n=6)對回收率的影響。如圖2所示，回收率隨上樣體積增加而增大，至60 mL時達最大值，之后有下降趨勢，這可能是由于上樣量少時，損失的目標物相對于上樣量較大，而上樣體積過大時，固相萃取柱不能及時吸附目標物，導致目標物損失，影響回收率。因此最終上樣體積選擇60 mL。

2.3 洗脫液用量對回收率的影響

用含2%甲酸的乙酸乙酯溶液作為洗脫液，分別考察3、6、9、12及15 mL洗脫液用量(n=6)對回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著洗脫液用量的增大，樣品加標回收率逐漸升高，至9 mL時達峰值，后隨著洗脫液用量的繼續(xù)增大，樣品加標回收率逐漸趨于平穩(wěn)并略有下降，可能原因是隨著洗脫液用量的增大，被洗脫下來的目標物逐漸增多，因此回收率逐漸增大。當洗脫液用量達到9 mL后，增大洗脫液用量對增加目標物的洗脫量不明顯。另由于洗脫液用量增大，在氮吹步驟會增大目標物的損失，導致回收率會略有下降趨勢。因此試驗選擇洗脫液用量為10 mL。

圖2 上樣體積對MQCA回收率的影響(n=6)Fig.2Effect of sample volume on MQCA recovery rate(n=6)

圖3 洗脫溶劑用量對MQCA回收率的影響(n=6)Fig.3Effect of elution solvent dosage on MQCA recovery rate(n=6)

2.4 流動相對分離效果的影響

經(jīng)查閱文獻[6,22-23]，發(fā)現(xiàn)HPLC測定MQCA含量時常用的流動相為1%甲酸水溶液-甲醇(6∶4，V/V)，通常以甲醇、水和乙酸-乙酸鈉緩沖液組成梯度洗脫或以0.1%甲酸水-乙腈進行梯度洗脫。經(jīng)試驗比較，流動相在紫外波長為320 nm的條件下，以上所提及流動相都能分離目標物。但本研究以1%甲酸水溶液-甲醇(60∶40，V/V)作為流動相時峰形和靈敏度最好，所以采用1%甲酸水溶液-甲醇(60∶40，V/V)作為流動相。

2.5色譜柱對分離效果的影響

不同的色譜柱對分離效果的影響見圖4，使用ZORBAX SB-CN(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)、XDB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)、ZORBAX SB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)分別進行色譜分離試驗，ZORBAX SB-C18柱和ZORBAX SB-CN柱均出峰較早，但不能將目標物和雜質(zhì)峰完全分離，并且響應值較低。XDB-C18柱出峰較晚，但能夠?qū)⒛繕朔迮c雜質(zhì)峰完全分離，且峰型很好，因此選擇XDB-C18柱作為液相色譜分離柱。

圖4 不同色譜柱對分離效果的影響(A)ZORBAX SB-CN柱；(B)XDB-C18柱；(C)ZORBAX SB-C18柱。Fig.4Effect of different chromatographic column on separation effect(A)ZORBAX SB-CN column；(B)XDB-C18 column；(C)ZORBAX SB-C18 column.

2.6 標準曲線及檢出限

配制標準溶液，其中MQCA質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.25、0.50和1.00 μg/mL，按照本試驗的儀器條件上機測試，以MQCA的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到MQCA標準曲線方程為y=64.526x-0.010，相關(guān)系數(shù)r=0.999 91。式中，x代表MQCA質(zhì)量濃度，y代表MQCA峰面積。分別在空白樣品中添加MQCA標準溶液，按信噪比大于3計算，確定該方法的檢出限為0.01 mg/L;按信噪比大于10計算,定量限為 0.02 mg/L(表1)。

表1 MQCA藥物線性范圍和檢出限Tab. 1 The linear range and detection limit of MQCA

2.7 精密度與準確度

標準品、添加樣品及空白樣品色譜圖見圖5，實驗條件下，基線穩(wěn)定，樣品能與雜質(zhì)有效分離，響應值高，可滿足實驗要求。向空白樣品中添加標準溶液，制成2倍、5倍和10倍檢出限的3組不同含量的標準添加樣品，每個含量樣品平行測定6次，計算方法回收率和精密度。結(jié)果表明，MQCA添加量為0.02～0.10 mg/L時，平均回收率79.0%～99.3%，相對標準偏差均小于10%(表2)。

表2 漁業(yè)用水中MQCA藥物加標回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of MQCA infishery water n=6

圖5 MQCA液相色譜圖A: MQCA標準溶液液相色譜圖(0.5 mg·L-1MQCA)；B：水樣加標液相色譜圖(0.02 mg·L-1MQCA)；C：水樣空白液相色譜圖。Fig.5 Liquid chromatography of MQCAA：Liquid chromatography of MQCA standard solution (0.5 mg·L-1 MQCA)；B：Liquid chromatography of water sample with MQCA(0.02 mg·L-1 MQCA)；C: Liquid chromatography of control sample.

2.8 實際樣品檢測

分析了8份采自濟寧市采煤塌陷區(qū)重點養(yǎng)殖區(qū)不同水域的漁業(yè)用水(表3)。結(jié)果表明，8個站位中，MQCA組分的濃度均低于檢出限。

表3 8個采樣站點漁業(yè)用水中MQCA的檢測結(jié)果Tab.3 Detection result of MQCA in fishery water from 8 stations mg·L-1

注：站點1為西故塌陷區(qū)1；站點2為西故塌陷區(qū)2；站點3為陵城鎮(zhèn)塌陷區(qū)1；站點4為陵城鎮(zhèn)塌陷區(qū)2；站點5為太白湖區(qū)塌陷區(qū)1；站點6為太白湖區(qū)塌陷區(qū)2；站點7為興隆莊塌陷區(qū)1；站點8為興隆莊塌陷區(qū)2。

3 結(jié)論

本研究建立了一種簡單、快速檢測漁業(yè)用水中喹乙醇代謝物殘留量的分析方法。該方法MQCA的檢出限為0.01 mg/L，定量限為0.02 mg/L，平均加標回收率為79.0%～99.3%，相對標準偏差(RSD)在7.38%～9.12%之間。經(jīng)對實際漁業(yè)用水樣品檢測,證明該方法具有靈敏、準確、簡便、快速等優(yōu)點，凈化效果好，精確度高，且重復性好，為漁業(yè)用水中喹乙醇代謝物殘留的檢測提供參考。