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    8-烯丙基山竹醇在口腔鱗癌化學(xué)預(yù)防中的作用

    2019-03-06 09:09:36董海濤韓超明張辛燕
    關(guān)鍵詞:烯丙基山竹陰性

    董海濤,曹 菁,韓超明,宿 穎,張辛燕,陳 新

    1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院口腔科,北京 1007302常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院,江蘇常州 2131643首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所,北京 100050

    山竹醇又名多聚異戊二烯基苯甲酮[1],是從印度藤黃的干果皮中提取出來的一種黃色晶體化合物[2]。山竹醇對(duì)口腔癌有明顯的化學(xué)預(yù)防作用,是一個(gè)很有前途的天然化學(xué)預(yù)防制劑[1,3]。有研究顯示,山竹醇結(jié)構(gòu)中C(8)位置上的過大支鏈可能會(huì)阻礙山竹醇與相應(yīng)活性位點(diǎn)的結(jié)合,導(dǎo)致山竹醇抗癌活性降低,膜滲透性變差[4- 5]。因此,本課題組與常州大學(xué)合作,對(duì)山竹醇的C(8)位置進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,用烯丙基代替過大的5-甲基- 2-(1-甲基乙烯基)- 4-己烯基支鏈,合成山竹醇新衍生物8-烯丙基山竹醇[6]。本研究通過對(duì)比8-烯丙基山竹醇與山竹醇對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞系CAL27生物學(xué)行為的影響及對(duì)對(duì)二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)誘導(dǎo)的地鼠口腔頰囊異常增生的抑制作用,初步評(píng)估了8-烯丙基山竹醇對(duì)口腔癌的化學(xué)預(yù)防作用。

    材料和方法

    細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

    主要試劑與設(shè)備:山竹醇(美國(guó)北卡農(nóng)工大學(xué)桑圣民教授提取并惠贈(zèng)),8-烯丙基山竹醇(常州大學(xué)制藥和生命科學(xué)院陳新教授合成并惠贈(zèng)),四甲基偶氮唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)(美國(guó)Sigma 公司),胎牛血清(澳大利亞LonZa公司),DMEM:高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素、0.25% 胰酶(美國(guó)Hyclone 公司),Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司),離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司),SPECTRAmax酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Devices公司),IX71型OLYMPUS倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

    細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng):將人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CAL27(北京口腔醫(yī)學(xué)研究所提供)置于含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素的 DMEM:高糖培養(yǎng)基(Hyclone,USA)中,37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27 細(xì)胞懸液調(diào)整濃度至3×104/ml后,接種到6塊96孔培養(yǎng)板,每孔200 μl,細(xì)胞貼壁后按0、5、10、20、40、60 μmol/L的濃度梯度向96 孔板中加入0.5 mmol/L山竹醇或8-烯丙基山竹醇混懸液,每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞的調(diào)零孔和不加藥物的陰性對(duì)照孔。在37 ℃、5% CO2的孵箱中分別孵育24、48、72 h,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入200 μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)OD 490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

    克隆形成實(shí)驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CAL27細(xì)胞用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液,將500個(gè)細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,細(xì)胞貼壁后,按10、20 μmol/L的濃度梯度加入0.5 mmol/L山竹醇或8-烯丙基山竹醇混懸液,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)樣本,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。連續(xù)培養(yǎng)3 d后,換液處理,每皿加培養(yǎng)基3 ml,繼續(xù)培養(yǎng)8 d后終止培養(yǎng),固定后姬姆薩染色,相機(jī)拍照,裸眼計(jì)數(shù)細(xì)胞集落,計(jì)算克隆形成率。克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

    劃痕實(shí)驗(yàn):先用標(biāo)記筆在6孔板背后用直尺均勻畫橫線,大約每隔0.5~1.0 cm 1道,橫穿過孔。在6孔板中接種CAL27細(xì)胞,掌握過夜即可鋪滿。第2天用槍頭(200 μl)垂直于背后的橫線劃痕。用無菌PBS液洗細(xì)胞3次,換成無血清的培養(yǎng)基。按10、20 μmol/L的濃度梯度加入0.5 mmol/L 山竹醇或8-烯丙基山竹醇混懸液,每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)樣本,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)0、12、24 h后分別拍照。計(jì)算相對(duì)遷移率。

    Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27 細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,于37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)孵育過夜,按10、20 μmol/L的濃度梯度加入0.5 mmol/L 山竹醇或8-烯丙基山竹醇混懸液,每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)樣本,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。孵育24 h后收集細(xì)胞,采用Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒進(jìn)行染色,方法參照說明書,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑:雄性敘利亞金黃地鼠,7~8 周齡,體質(zhì)量100~120 g,購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。DMBA、5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)及鼠抗鼠BrdU單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司),甘油、丙酮(北京化學(xué)試劑公司),10%中性福爾馬林緩沖固定液、免疫組織化學(xué)載玻片(北京益利公司),PBS緩沖液、胃酶、DAB顯色液(福州邁新公司)。0.5% DMBA溶液配制:0.5 g DMBA溶于25 ml丙酮溶液中,再加入75 ml石蠟油中,置于棕色瓶中避光保存,搖勻后使用。8-烯丙基山竹醇和山竹醇混懸液配制:8-烯丙基山竹醇和山竹醇加入少量DMSO溶解后,加甘油定容分別得到0.5和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇和山竹醇溶液,-20 ℃保存,搖勻后使用。

    動(dòng)物模型建立:34只敘利亞金黃地鼠分籠飼養(yǎng),常規(guī)飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。4 只不涂藥作為陰性對(duì)照,其余30 只于金黃地鼠左側(cè)頰囊涂0.5% DMBA,每周一、三、五共涂3 次,涂3 周。3 周末將DMBA金黃地鼠隨機(jī)分為5 組,每組6只,陽性對(duì)照組不涂藥,其余4 組分別于地鼠左側(cè)頰囊涂0.5、1.0 mmol/L 山竹醇或8-烯丙基山竹醇溶液,每周3 次,涂2 周。第5 周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束斷髓法處死全部動(dòng)物,處死前2 h腹腔注射50 mg/kg的BrdU。完整取左側(cè)口腔頰囊黏膜組織,固定在10%的福爾馬林溶液中,用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)期間,每周稱量1次體質(zhì)量,并做記錄。肉眼觀察地鼠頰囊黏膜變化情況。動(dòng)物維護(hù)遵循全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)和醫(yī)學(xué)會(huì)的指導(dǎo)原則,并經(jīng)北京口腔醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(KQYY- 201708- 004)。

    組織病理學(xué)觀察:將福爾馬林固定的頰囊組織卷成筒狀,分切為5~6 mm寬條狀,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色。切片于北京協(xié)和醫(yī)院病理科應(yīng)用日本HAMAMATSU公司NDP(NanoZoomer DigitalPathology)系統(tǒng)掃描全切片圖像,采用NDP.view 2瀏覽軟件標(biāo)記單純?cè)錾彤惓T錾秶?jì)算出相應(yīng)面積。記數(shù)每只動(dòng)物口腔黏膜上皮單純?cè)錾惓T錾拿娣e,計(jì)算每組動(dòng)物每種病變的面積平均數(shù)。組織學(xué)診斷由兩位高年資病理醫(yī)生盲讀進(jìn)行。

    BrdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖:組織切片采用免疫組織化學(xué)Envision二步法BrdU染色。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,以已知金黃地鼠陽性切片作為陽性對(duì)照。結(jié)果判定:細(xì)胞核染成棕黃色的為陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)方法:每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)以上不同視野,200 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)作為增殖指數(shù),以代表細(xì)胞增殖活躍程度。

    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析;用藥組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),兩兩比較的P值均經(jīng)過Bonferroni校正;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    8-烯丙基山竹醇對(duì)CAL27 細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于山竹醇:與陰性對(duì)照相比,山竹醇及8-烯丙基山竹醇均可抑制CAL27細(xì)胞的增殖,且呈一定濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。藥物作用72 h,8-烯丙基山竹醇的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為(13.13±2.55)μmol/L,明顯低于山竹醇的(32.20±3.24)μmol/L(t=8.008,P=0.001);兩種藥物同種濃度作用效果相比較,8-烯丙基山竹醇對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于山竹醇,以10(24 h:t=8.012,P=0.001;48 h:t=5.939,P=0.001;72 h:t=12.551,P=0.001)和20 μmol/L(24 h:t=8.887,P=0.001;48 h:t=9.324,P=0.002;72 h:t=5.361,P=0.002)濃度時(shí)差異最為顯著(表1),因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均選擇10、20 μmol/L兩種濃度進(jìn)行。

    表1 山竹醇和8-烯丙基山竹醇對(duì)CAL27細(xì)胞增殖抑制作用的比較(n=6,-±s)Table 1 Comparison of inhibitory effects on CAL27 cells proliferation between garcinol and 8-allyl garcinol(n=6,-±s)

    與0 μmol/L比較,aP<0.05,bP<0.01

    aP<0.05,bP<0.01 compared with 0 μmol/L

    8-烯丙基山竹醇對(duì)CAL27 細(xì)胞的克隆形成抑制強(qiáng)于山竹醇:肉眼觀察可見,與陰性對(duì)照組相比,山竹醇及8-烯丙基山竹醇用藥組CAL27 細(xì)胞菌落形成數(shù)減少,細(xì)胞集落也變小。其中,山竹醇和8-烯丙基山竹醇用藥組20 μmol/L濃度時(shí)的克隆形成率分別為(44.1±0.4)%和(23.6±0.6)%,明顯低于10 μmol/L濃度時(shí)(55.6±2.8)%(t=6.894,P=0.019)和(31.0±0.6)%(t=15.556,P=0.001);10(t=14.682,P=0.003)和20 μmol/L(t=51.514,P=0.001)濃度時(shí)8-烯丙基山竹醇對(duì)CAL27 細(xì)胞菌落形成的抑制作用明顯強(qiáng)于山竹醇。

    8-烯丙基山竹醇對(duì)CAL27 細(xì)胞遷移能力的抑制作用弱于山竹醇:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用藥12 h時(shí),10和20 μmol/L山竹醇組的細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(16.00±4.55)%(t=3.139,P=0.026)和(3.00±3.16)%(t=6.608,P=0.001),均明顯低于陰性對(duì)照組的(30.33±7.64)%;10和20 μmol/L 8-烯丙基山竹醇組的細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(16.25±3.86)%(t=3.245,P=0.023)和(6.00±2.65)%(t=5.214,P=0.006),也均明顯低于陰性對(duì)照組的(30.33±7.64)%。用藥24 h時(shí),10和20 μmol/L山竹醇組的細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(23.75±4.57)%(t=4.718,P=0.005)和(5.75±1.50)%(t=10.432,P=0.001),均明顯低于陰性對(duì)照組的(45.33±7.64)%;10和20 μmol/L 8-烯丙基山竹醇組的細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(23.50±2.38)%(t=5.529,P=0.003)和(11.67±2.31)%(t=7.308,P=0.002),也均明顯低于陰性對(duì)照組的(45.33±7.64)%。在10 μmol/L濃度下,山竹醇組和8-烯丙基山竹醇抑制作用相似(12 h:t=0.084,P=0.936;24 h:t=0.097,P=0.926);20 μmol/L濃度作用24 h時(shí),山竹醇組的相對(duì)遷移率顯著低于8-烯丙基山竹醇(t=4.151,P=0.009)。

    8-烯丙基山竹醇對(duì)CAL27 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用弱于山竹醇:凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10 μmol/L時(shí),山竹醇組的早期凋亡率為(5.00±0.10)%,明顯高于陰性對(duì)照組的(1.57±0.21)%(t=25.750,P=0.001);晚期凋亡率為(0.23±0.06)%,與陰性對(duì)照組的(0.03±0.06)%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.243,P=0.013);8-烯丙基山竹醇組的早期和晚期凋亡率分別為(3.03±0.50)%和(0.27±0.06)%,與陰性對(duì)照組的(1.57±0.21)%(t=4.932,P=0.051)和(0.03±0.06)%(t=4.950,P=0.090)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20 μmol/L時(shí),山竹醇組的早期和晚期凋亡率分別為(5.90±0.78)%(t=39.384,P=0.001)和(9.73±1.67)%(t=10.101,P=0.001),均明顯高于陰性對(duì)照組;8-烯丙基山竹醇組的早期和晚期凋亡率分別為(4.63±1.16)%(t=4.511,P=0.041)和(0.93±0.23)%(t=6.548,P=0.017),均明顯高于陰性對(duì)照組。同種濃度作用效果相比較,8-烯丙基山竹醇對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用明顯弱于山竹醇(10 μmol/L:t=5.982,P=0.004;20 μmol/L:t=8.578,P=0.001)(圖1)。

    動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    體質(zhì)量觀察:自實(shí)驗(yàn)起始至結(jié)束,各組地鼠體質(zhì)量均呈持續(xù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、0.5 mmol/L 山竹醇處理組、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組、1.0 mmol/L 山竹醇處理組和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組地鼠的體質(zhì)量分別為(171.0±11.9)、(165.7±13.6)、(167.0±8.7)、(161.5±21.7)、(166.7±17.2)和(158.3±7.4)g,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.503,P=0.771)。

    頰囊肉眼觀察:正常金黃地鼠頰囊黏膜菲薄、有彈性,黏膜下血管清晰可見。0.5% DMBA處理3周后,頰囊表現(xiàn)為黏膜充血、糜爛,大量黏稠膿液分泌;第 5 周末可見陽性對(duì)照組頰囊增厚,表面粗糙、充血,局部仍可見潰瘍。用藥組頰囊變薄,厚度接近正常,充血減輕。

    組織病理學(xué)觀察:光鏡下顯示正常地鼠頰囊黏膜上皮為角化的復(fù)層鱗狀上皮,約4~6層細(xì)胞;單純?cè)錾憩F(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增多,組織結(jié)構(gòu)清晰,上皮粒層明顯,棘層增生,沒有非典型細(xì)胞;異常增生表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)異常,如過角化、粒層明顯、棘層增厚、基底細(xì)胞復(fù)層、核著色深、胞核胞質(zhì)比例增大、核分裂相增多等(圖 2)。

    陽性對(duì)照組、0.5 mmol/L 山竹醇處理組、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組、1.0 mmol/L 山竹醇處理組和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組地鼠口腔黏膜上皮單純?cè)錾娣e分別為(1.27±0.23)、(0.86±0.30)、(0.73±0.25)、(0.74±0.11)和(0.64±0.12)mm2,其中,0.5 mmol/L 山竹醇處理組(t=2.546,P=0.031)、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=3.485,P=0.008)、1.0 mmol/L 山竹醇處理組(t=4.556,P=0.001)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=5.393,P=0.001)均明顯低于陽性對(duì)照組,各用藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.915,P=0.457)。陽性對(duì)照組、0.5 mmol/L 山竹醇處理組、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組、1.0 mmol/L 山竹醇處理組和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組地鼠口腔黏膜上皮異常增生面積分別為(1.26±0.36)、(0.97±0.15)、(0.82±0.23)、(0.71±0.15)和(0.56±0.11)mm2,其中,0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=2.130,P=0.046)、1.0 mmol/L 山竹醇處理組(t=3.434,P=0.010)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=4.518,P=0.004)均明顯低于陽性對(duì)照組,1.0 mmol/L 山竹醇處理組(t=2.793,P=0.023)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=4.997,P=0.001)均明顯低于0.5 mmol/L 山竹醇處理組。

    圖1山竹醇及8-烯丙基山竹醇各濃度組的CAL27細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

    Fig1Apoptosis dispersion map of CAL27 cells after treatment with different concentrations of garcinol or 8-allyl garcinol

    圖2正常地鼠頰囊黏膜上皮、單純?cè)錾掀ぜ爱惓T錾掀そY(jié)構(gòu)(HE)

    Fig2Different structure of normal mucosal epithelium,hyperplasia epithelium,and dysplasia epithelium of hamster cheek pouch(HE)

    BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:各組均可見棕黃色BrdU陽性細(xì)胞(圖3)。陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、0.5 mmol/L 山竹醇處理組、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組、1.0 mmol/L 山竹醇處理組和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組地鼠的BrdU增殖指數(shù)分別為5.40±0.97、17.53±3.75、13.05±0.66、10.70±1.11、9.54±0.75和9.82±1.32,其中,陰性對(duì)照組(t=7.563,P=0.001)、0.5 mmol/L 山竹醇處理組(t=2.862,P=0.029)、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=4.693,P=0.002)、1.0 mmol/L 山竹醇處理組(t=5.071,P=0.002)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=5.133,P=0.001)均明顯低于陽性對(duì)照組,0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=3.724,P=0.007)、1.0 mmol/L 山竹醇處理組(t=7.000,P=0.001)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組(t=4.413,P=0.003)均明顯低于0.5 mmol/L 山竹醇處理組。

    A、A’.陰性對(duì)照組;B、B’.陽性對(duì)照組;C、C’.0.5 mmol/L 山竹醇處理組;D、D’.0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組;E、E’.1.0 mmol/L山竹醇處理組;F、F’.1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇處理組

    A,A’.negative control;B,B’.positive control;C,C’.0.5 mmol/L garcinol treatment group;D,D’.0.5 mmol/L 8-allyl garcinol treatment group;E,E’.1.0 mmol/L garcinol treatment group;F,F’.1.0 mmol/L 8-allyl garcinol treatment group

    圖3BrdU免疫組織化學(xué)染色

    Fig3BrdU immunohistochemistry

    討 論

    流行病學(xué)及大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,人類食物中的很多天然成份都具有杰出的預(yù)防癌癥的作用[7]。山竹醇作為從印度藤黃干果皮中提取的一種活性酚類復(fù)合物,具有抗炎、抗癌等多種生物活性[8- 12]。本研究結(jié)果也表明,山竹醇能夠抑制人口腔鱗癌細(xì)胞CAL27的增殖、克隆形成及遷移,促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡。

    本課題組以往研究證實(shí),山竹醇可通過抑制5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LOX),對(duì)DMBA誘導(dǎo)的地鼠口腔頰囊急性炎癥和頰囊的口腔鱗狀細(xì)胞癌有化學(xué)預(yù)防作用[4]。而山竹醇結(jié)構(gòu)中C(8)位置上的過大支鏈可能會(huì)阻礙山竹醇與5-LOX 的活性位點(diǎn)相結(jié)合。計(jì)算機(jī)建模也表明,過大C(8)側(cè)鏈可能影響山竹醇的生物活性,因此本課題組設(shè)計(jì)用較小的基團(tuán)取代過大的C(8)側(cè)鏈,來提高山竹醇的膜滲透性及生物活性。本課題以往曾將C(8)位置的龐大側(cè)鏈用1個(gè)小得多的甲基基團(tuán)來取代,合成了8-甲基山竹醇[5]。然而研究發(fā)現(xiàn),8-甲基山竹醇的抗癌活性弱于山竹醇,提示甲基為山竹醇 C(8)位置的非活性基團(tuán),C(8)側(cè)鏈可能是山竹醇的重要活性部位,改變C(8)側(cè)鏈會(huì)影響山竹醇的抑制作用[5]。而理想的山竹醇新活性衍生物應(yīng)能夠提高其吸收和滲透性能,但并不影響其生物活性。應(yīng)以其活性基團(tuán)的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,設(shè)計(jì)新的衍生物,提高化合物的活性。因此,本課題組對(duì)山竹醇的C(8)位置進(jìn)行結(jié)構(gòu)再改造,用烯丙基代替過大的5-甲基- 2-(1-甲基乙烯基)- 4-己烯基支鏈,合成山竹醇的新衍生物8-烯丙基山竹醇[6]。

    本研究結(jié)果表明,8-烯丙基山竹醇對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞克隆形成的抑制作用明顯優(yōu)于山竹醇,推測(cè)其原因可能是由于8-烯丙基山竹醇 C(8)側(cè)鏈的減小,提高了其膜滲透性及生物利用度,從而更好地發(fā)揮作用,同時(shí)提示烯丙基可能有助于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Li等[3]通過建立小鼠頭頸部腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn),用山竹醇處理后小鼠腫瘤中的Ki- 67、CD31等增殖指標(biāo)下降,表明山竹醇可以在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果也顯示,藥物處理組的地鼠BrdU增殖指數(shù)均較陽性對(duì)照組顯著降低,8-烯丙基山竹醇抑制口腔上皮細(xì)胞增殖和異常增生的效果明顯優(yōu)于山竹醇,與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。此外本研究還發(fā)現(xiàn),8-烯丙基山竹醇對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞凋亡效果較山竹醇弱,提示山竹醇中的烯丙基不能完全替代C(8)側(cè)鏈的過大支鏈,改變C(8)側(cè)鏈可能影響凋亡信號(hào)通路的表達(dá)。

    綜上,本研究結(jié)果顯示,8-烯丙基山竹醇抑制口腔上皮細(xì)胞增殖和異常增生的效果明顯優(yōu)于山竹醇,但對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞凋亡效果較山竹醇弱,提示改變C(8)側(cè)鏈將影響山竹醇對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。后續(xù)研究將建立口腔鱗癌動(dòng)物模型,進(jìn)一步探討8-烯丙基山竹醇對(duì)口腔鱗癌的作用及具體機(jī)制,為進(jìn)一步研究山竹醇的結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

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