外源Ca2+提高百合耐熱性的生理機制初探

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(1.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點實驗室，北京 100193)

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉，具有重要的觀賞、食藥用價值。百合性喜冷涼、濕潤氣候，耐熱性較差，高溫造成百合生長停滯、植株矮小、少花盲花、莖稈軟、病蟲害嚴(yán)重等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響切花的產(chǎn)量和質(zhì)量，并造成種球退化。我國大部分地區(qū)夏季炎熱，嚴(yán)重影響百合商品化周年生產(chǎn)[1]。所以，提高百合耐熱性是解決這一問題的關(guān)鍵。

作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素，Ca2+是細(xì)胞壁的組成成分，是細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑，也是細(xì)胞內(nèi)多種酶的活化劑，同時作為第二信使，Ca2+與其受體蛋白如鈣調(diào)蛋白(CaM)、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(CBL)、鈣離子結(jié)合蛋白激酶(CDPK)等結(jié)合，參與了植物對內(nèi)環(huán)境(發(fā)育)和外環(huán)境的感知和傳導(dǎo)，涉及植物對病原菌、光、高低溫、機械損傷、干旱、鹽和滲透脅迫等的響應(yīng)[2]。施用外源Ca2+能提高植物的耐熱性。10 mmol/L Ca2+處理能夠有效緩解高溫強光對西葫蘆光合機構(gòu)的傷害[3]。10 mmol/L CaCl2處理能提高濱梅幼苗對高溫的耐受性，Ca2+信號系統(tǒng)參與了脅迫過程中滲透物質(zhì)和Ca2+-ATPase活性等的調(diào)節(jié)[4]。

利用Ca2+、Ca2+載體A23187，鈣離子螯合劑EGTA，鈣離子通道阻抑劑LaCl3、異搏定(Verapamil)，鈣調(diào)蛋白抑制劑氯丙嗪(Chlorpromazine, CPZ)、三氟拉嗪(Trifluoperazine, TFP)、N-(6-氨基己烷基)-5-氯-1-萘-黃胺(W7)等增強或阻礙Ca2+-CaM信號傳導(dǎo)是目前研究植物Ca2+-CaM信號功能的重要手段[5]。以東方百合雜種系(Liliumoriental hybrids)品種西伯利亞(Siberia)為試驗材料，研究CaCl2、EGTA和TFP對高溫脅迫下百合表型、相關(guān)生理指標(biāo)及基因表達(dá)的影響，探討Ca2+在百合耐熱性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機制，以期為生產(chǎn)上應(yīng)用Ca2+提高百合耐熱性奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為東方百合雜種系西伯利亞，每盆1株。栽培基質(zhì)配比為V(草炭)∶V(細(xì)河砂)=2∶1。人工氣候室培養(yǎng)溫度為22 ℃/16 ℃(晝/夜)，光照時間為14 h/d。CaCl2和EGTA購于中國國藥集團(tuán)，TFP購于Sigma公司，熒光定量試劑盒SYBR?Premix ExTaq購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱害指數(shù)的測定 待百合地上部分長至約30 cm時，選取健壯、生長一致的植株，分別用5、10、15 mmol/L CaCl2，5、10、15 mmol/L EGTA和100、200、300 μmol/L TFP進(jìn)行灌根處理，以去離子水處理為對照，每5 d處理1次，共處理3次。每個處理6株苗，重復(fù)3次。第3次藥劑處理后立即將植株置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，40 ℃脅迫處理72 h，光照時間為14 h/d。熱激處理后，取植株中部葉片(株間相近葉位)，利用Photoshop CS5軟件參照于守超等[6]的方法測定葉面積，統(tǒng)計傷害面積率，計算熱害指數(shù)。熱害分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

傷害面積率=葉片明顯失綠部分面積/葉片總面積×100%

熱害指數(shù)= ∑(各級熱害葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級別數(shù)值)×100。

表1 熱害分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 相關(guān)生理指標(biāo)的測定 人工氣候室培養(yǎng)條件下，分別用15 mmol/L CaCl2、10 mmol/L EGTA和200 μmol/L TFP溶液灌根，以去離子水處理為對照，每5 d處理1次，共處理3次。每個處理15株苗，重復(fù)3次。第3次藥劑處理后立即將植株置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，40 ℃脅迫處理72 h，光照時間為14 h/d，分別在熱激處理0、12、24、48、72 h取植株中部葉片(株間相近葉位)，測定相關(guān)生理指標(biāo)。膜透性測定采用電導(dǎo)儀法，葉綠素含量測定采用浸提法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑顯色法。以上指標(biāo)的測定均參照李合生[7]的方法。

1.2.3 相關(guān)熱響應(yīng)基因的表達(dá)分析 人工氣候室培養(yǎng)條件下，分別用15 mmol/L CaCl2、10 mmol/L EGTA和200 μmol/L TFP溶液灌根，以去離子水處理為對照，每5 d處理1次，共處理3次。第3次藥劑處理后立即將植株置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，40 ℃熱激1 h和3 h，取植株中部葉片(株間相近葉位)，用液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative RT-PCR，qPCR)方法測定樣本中鈣調(diào)蛋白基因LoCaM3和熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LoHsfA3a的表達(dá)量，以百合18SrRNA作內(nèi)參。試驗參照SYBR?Premix ExTaq試劑盒說明書進(jìn)行，儀器為ABI StepOnePlusTM。LoCaM3的擴增引物為qF1(5′-CATGTCATGACTAACCTAGGCGAG-3′)和qR1(5′-CCATTAGAAATCAGCCAGCACC-3′)，LoHsfA3a的擴增引物為qF2(5′-CTTGGTTTAAGTACGCCAGTGGAAG-3′)和qR2(5′-GTAAAATATTGTAAAAGAACATGAAGCCTATGG-3′)，18SrRNA的擴增引物為18SqF(5′-AGTTGGTGGAGCGATTTGTCT-3′)和18SqR(5′-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3′)。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法[8]分析基因的相對表達(dá)量，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007和SPSS 18處理分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+處理對高溫脅迫下百合葉片熱害指數(shù)的影響

熱激處理對葉片造成了不同程度的傷害，CaCl2、EGTA和TFP處理對百合葉片熱害指數(shù)的影響見圖1。結(jié)果表明，與對照相比，CaCl2處理顯著降低了葉片的熱害指數(shù)(P<0.05)，隨著CaCl2濃度的增加，葉片的熱害指數(shù)逐漸降低，15 mmol/L CaCl2處理的葉片熱害指數(shù)比對照降低了58.53%。EGTA和TFP處理則顯著提高了葉片的熱害指數(shù)(P<0.05)，熱害指數(shù)隨著處理濃度的增加而升高。與對照相比，10 mmol/L EGTA處理的熱害指數(shù)增加了56.11%，但與15 mmol/L EGTA處理差異不顯著。200 μmol/L TFP 處理的熱害指數(shù)比對照增加了69.94%，但與300 μmol/L TFP處理差異不顯著。根據(jù)表型結(jié)果，選擇15 mmol/L CaCl2、10 mmol/L EGTA 和200 μmol/L TFP處理用于后續(xù)的生理試驗。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同

2.2 Ca2+處理對高溫脅迫下百合葉片抗性相關(guān)生理指標(biāo)的影響

2.2.1 細(xì)胞膜透性 高溫破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的透性增加，電解質(zhì)外滲。因此，細(xì)胞膜電解質(zhì)滲透率能反映出高溫對植物傷害的程度。由圖2A可以看出，隨著熱激時間的延長，百合葉片的相對電導(dǎo)率逐漸增大。Ca2+處理的相對電導(dǎo)率始終低于對照，表明Ca2+處理能夠緩解高溫下細(xì)胞膜透性的增大。EGTA和TFP處理的相對電導(dǎo)率始終高于對照，表明EGTA和TFP處理加劇了高溫下細(xì)胞膜透性的增大。

2.2.2 葉綠素含量 高溫脅迫過程中，百合葉片的葉綠素含量逐漸降低(圖2B)，表明高溫抑制了葉綠素的合成，促進(jìn)了葉綠素的降解。與對照相比，Ca2+處理的葉綠素含量下降趨勢較緩，熱激72 h后，降幅為對照的69.88%，葉綠素含量是對照的1.56倍；而EGTA和TFP處理則加劇了葉綠素含量的下降，熱激72 h后，降幅分別為對照的1.22倍和1.31倍，葉綠素含量分別是對照的58.15%和42.55%。

2.2.3 脯氨酸和可溶性蛋白含量 植物細(xì)胞可以通過滲透調(diào)節(jié)的方式抵御高溫脅迫，脯氨酸是最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，可以防止植物水分散失和提高原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性。圖2C表明，熱脅迫前期(0～24 h)，EGTA和TFP處理的脯氨酸含量升高，但絕對含量和增幅均顯著低于對照(P<0.05)。隨后，EGTA處理的脯氨酸含量變化不大，而TFP處理的脯氨酸含量降低后又迅速升高，72 h的含量接近對照水平。高溫脅迫過程中Ca2+處理和對照的脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在48 h達(dá)到峰值，Ca2+處理的脯氨酸含量分別比對照、EGTA和TFP處理增加了27.24%、117.37%和165.80%。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，也對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。高溫脅迫過程中，各處理的可溶性蛋白含量先升高后降低(圖2D)，前期升高可能是由于高溫誘導(dǎo)合成了熱激蛋白(HSP)，后期降低可能是持續(xù)高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻和降解加劇。熱脅迫期間，Ca2+處理的可溶性蛋白含量始終高于對照，EGTA和TFP處理的可溶性蛋白含量始終低于對照。各處理的可溶性蛋白含量差異在48 h達(dá)到最大，Ca2+處理是對照的1.37倍，EGTA和TFP處理分別為對照的73.81%和52.86%。

2.2.4 MDA含量和SOD活性 高溫脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞積累過多活性氧，引起或加劇膜脂過氧化作用，MDA是產(chǎn)物之一，其含量的高低可以反映膜的損傷程度。高溫脅迫期間，百合葉片MDA含量的變化趨勢如圖2E所示，各處理的MDA含量持續(xù)增加。熱激12 h，各處理的MDA含量無顯著差異(P>0.05)。熱激24、48、72 h，EGTA處理的MDA含量分別是對照的1.64、1.34、1.21倍，TFP處理的MDA含量分別是對照的1.88、1.61、1.34倍，Ca2+處理的MDA含量分別是對照的67.85%、62.21%和77.83%。

雖然高溫下產(chǎn)生的自由基會傷害細(xì)胞，然而植物體也有防御系統(tǒng)，SOD 是植物抗氧化防御系統(tǒng)中的保護(hù)酶之一，能清除高溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過多活性氧，以減輕活性氧對細(xì)胞的傷害。Ca2+、EGTA和TFP處理對高溫脅迫下百合葉片SOD活性的影響見圖2F。高溫脅迫期間，各處理的SOD活性呈先升高后降低的趨勢。與對照相比，Ca2+處理顯著提高了SOD活性(P<0.05)，差異隨脅迫時間的延長逐漸變大，至72 h，SOD活性為對照的2.15倍。EGTA和TFP處理的SOD活性在熱脅迫初期(0～12 h)小幅增強后持續(xù)降低，至72 h，SOD活性分別為對照的36.14%和26.25%，表明EGTA和TFP處理顯著抑制了SOD活性(P<0.05)。

圖2 高溫脅迫下不同藥劑處理對百合葉片抗性相關(guān)生理指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of different chemicals on correlative physiological indexes of lily leaves under heat stress

2.3 Ca2+處理對高溫脅迫下百合LoCaM3和LoHsfA3a表達(dá)的影響

CaM3與HsfA3a參與了百合的熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9-10]。40 ℃熱脅迫條件下，檢測了CaCl2、EGTA、TFP處理1 h后葉片LoCaM3的表達(dá)量和處理3 h后葉片LoHsfA3a的表達(dá)量(圖3)。結(jié)果表明，與對照相比，CaCl2處理顯著促進(jìn)了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)(P<0.05)，而EGTA或TFP處理則顯著抑制了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)(P<0.05)，表明外源Ca2+可以通過Ca2+/CaM-HSF信號途徑參與百合的熱激反應(yīng)。

圖3 高溫脅迫下不同藥劑處理的百合葉片LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)量Fig.3 Expression of LoCaM3 and LoHsfA3a of leaves treatment with different chemicals under heat stress

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)百合的耐熱研究主要集中在以下2個方面：第一，百合對高溫脅迫的形態(tài)和生理響應(yīng)。東方百合Sorbonne、岷江百合等在高溫環(huán)境下葉片逐漸萎蔫、變黃，隨著溫度的升高和處理時間的延長，植株的耐熱指數(shù)不斷下降[11-12]。本研究中，西伯利亞百合在高溫脅迫下的表型變化與上述研究基本一致，40 ℃熱激72 h后，葉片基本都萎蔫下垂，因此，根據(jù)葉片的失綠程度進(jìn)行熱害分級，能夠客觀反映植株的受害程度。與對照相比，5～15 mmol/L CaCl2處理顯著降低了熱害指數(shù)，5～15 mmol/L EGTA和100～300 μmol/L TFP處理則顯著提高了熱害指數(shù)。高溫處理的百合葉片脯氨酸、MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著升高，這3個指標(biāo)可作為耐熱性鑒定的生理指標(biāo)[13]。高溫脅迫下，百合的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、SOD等抗氧化酶的活性和谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)等抗氧化劑的含量處于較高水平，可以有效清除高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧，提高百合的耐熱性[14]。本試驗中，熱脅迫導(dǎo)致相對電導(dǎo)率和MDA含量升高，脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性先升高后降低，葉綠素含量下降，這與楊煒茹等[12]對岷江百合的研究結(jié)果基本一致。第二，提高百合耐熱性的途徑和方法。利用物理或化學(xué)的方法可以提高百合的耐熱性。熱激鍛煉百合種球可以提高植株SOD活性、可溶性糖含量和根系活力[15]，可以引起植株體內(nèi)SOD與光合色素的協(xié)同作用并提高系統(tǒng)的熱耗散[16]，能抑制由高溫脅迫引起的相對電導(dǎo)率的升高[17]，從而提高百合的耐熱性。外源水楊酸可以通過提高抗氧化系統(tǒng)酶的活性來增強百合的耐熱性[18]。外施Ca2+可以提高小麥[19]、半夏[20]、藤本月季[21]、高山杜鵑[22]等植物的耐熱性，之前的研究表明，外源Ca2+處理可以顯著提高麝香百合品種白天堂組培苗的耐熱性[9]，但未深入研究其生理機制。本研究結(jié)果表明，與單純高溫處理相比，15 mmol/L CaCl2處理能夠降低電解質(zhì)滲透率和MDA含量，提高葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性，即通過降低細(xì)胞膜透性和膜脂過氧化作用，提高光合色素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，增強植株的耐熱性；10 mmol/L EGTA和200 μmol/L TFP處理則加劇了電解質(zhì)的外滲和MDA的積累，降低了葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量以及SOD活性，從而降低植株的耐熱性。在對茄子[23]、濱梅[4]、棉花[24]等的研究中也得到了類似的結(jié)果，表明作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素，Ca2+也可能通過Ca2+-CaM信號途徑介導(dǎo)百合對高溫脅迫的響應(yīng)。篩選耐熱種質(zhì)是培育耐熱品種的基礎(chǔ)[25-26]，雜交育種是提高百合耐熱性的主要途徑[27-28]。近年來，百合耐熱轉(zhuǎn)基因育種也取得了初步進(jìn)展。尚愛芹等[29]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將擬南芥干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白AtDREB2A基因轉(zhuǎn)化百合，高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的POD、SOD活性等及脯氨酸含量高于野生型植株，耐熱性明顯強于野生型植株。從百合中鑒定了一些耐熱功能基因，如LlHsfA1[30]、LlHsfA2a[31]、LlHsfA2b[32]、LlHsfA3a[10]、LlHsfA3b[10]、LlHSP70[33]、LimHSP16.45[34]等。前期對麝香百合的研究中發(fā)現(xiàn)，LlCaM3為響應(yīng)Ca2+和熱脅迫的重要信號分子，Ca2+/LlCaM3可能在A類HSF的上游發(fā)揮作用[9]；LlHsfA3a的表達(dá)受熱脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中一些HSP基因的表達(dá)量顯著增加[10]。在本研究中，檢測了CaCl2、EGTA、TFP處理對高溫脅迫下東方百合LoCaM3和LoHsfA3a表達(dá)的影響，結(jié)果表明，CaCl2處理顯著促進(jìn)了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)，而EGTA或TFP處理則顯著抑制了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)，說明外源Ca2+可能通過Ca2+/CaM-HSF信號途徑誘導(dǎo)HSP的合成，利用HSP的分子伴侶作用[35]，提高百合的耐熱性。

15 mmol/L CaCl2處理能夠緩解由高溫脅迫造成的膜透性的加大和MDA的積累，提高葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性，促進(jìn)熱響應(yīng)基因LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)，表明Ca2+作為植物生長所必需的大量元素和偶聯(lián)胞外信號與胞內(nèi)生理反應(yīng)的第二信使，能通過提高細(xì)胞的光合能力、滲透調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力和蛋白質(zhì)活性來維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而增強百合對高溫脅迫的抗性。利用Ca2+提高栽培作物的抗逆性具有成本低、對環(huán)境影響小的突出優(yōu)勢，本研究初步探討了Ca2+對百合耐熱性的影響及其生理機制，為生產(chǎn)上應(yīng)用Ca2+提高百合耐熱性奠定了理論與技術(shù)基礎(chǔ)。