多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)肉雞抗沙門氏菌感染能力的影響

劉江英，朱建津，*，蔣 蓉，劉子微

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.無錫三智生物科技有限公司，江蘇 無錫 214115)

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌，其傳播的主要媒介為家禽及其肉蛋類，并隨著食物鏈進(jìn)入人體，給人類及畜禽養(yǎng)殖帶來巨大損失[1-2]。目前，主要應(yīng)用藥物來控制和預(yù)防家禽沙門氏菌感染，隨著抗生素的濫用，沙門氏菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)[3]，尋找新的預(yù)防沙門氏菌感染、增強(qiáng)動(dòng)物防御能力的物質(zhì)迫在眉睫。已有研究表明，多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠提高動(dòng)物腸道健康水平，飼料經(jīng)益生菌發(fā)酵后，含有的益生菌和代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFA)被證實(shí)能夠有效阻止革蘭氏陰性菌在腸道定植[4-5]。本試驗(yàn)預(yù)先給肉雞飼喂發(fā)酵飼料，隨后進(jìn)行沙門氏菌感染試驗(yàn)，旨在研究多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)肉雞抗沙門氏菌感染能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；7900HT Fast RT-PCR儀(美國ABI公司)；石蠟組織切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.1.2 試劑

乳酸菌菌液(由植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌組成，菌落總數(shù)≥5×108CFU·mL-1)、芽孢桿菌和酵母菌混合菌粉(由地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌組成，芽孢桿菌菌落總數(shù)≥5×108CFU·g-1，釀酒酵母菌菌落總數(shù)≥5×107CFU·g-1)，無錫三智生物科技有限公司；酸性蛋白酶(酶活≥50 000 U·g-1)，杭州保安康生物技術(shù)有限公司；腸炎沙門氏菌24119，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)及D-乳酸(D-LA)Elisa試劑盒，廈門慧嘉生物科技有限公司；RT-PCR相關(guān)試劑，美國Thermo Scientific公司；SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；基因引物，上海睿迪生物科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡中速黃羽肉雞(35.78±4.03)g 50只，購自麗水市綠園種雞場(chǎng)，經(jīng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所檢驗(yàn)合格。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料的制備

使用密封袋進(jìn)行小包飼料的簡易發(fā)酵。將發(fā)酵底物玉米、麩皮、豆粕經(jīng)粉碎，過40目篩，按4∶3∶3比例混合，取1 kg混合物加1 g芽孢桿菌和酵母菌混合菌粉、30 mL乳酸菌菌液、0.4 g酸性蛋白酶及經(jīng)暴曬后的自來水1 000 mL，混合均勻裝袋，擠壓排氣后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵9 d后取樣備用。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn)

將50只1日齡中速黃羽肉雞隨機(jī)分為5個(gè)處理組，對(duì)照組、模型對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)日糧+10%未發(fā)酵飼料)，抗生素對(duì)照組在基礎(chǔ)飼糧中添加20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素，5%發(fā)酵組、10%發(fā)酵組分別用5%、10%發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)飼糧中的未發(fā)酵飼料。肉雞13日齡時(shí)，對(duì)照組連續(xù)2 d口腔灌服400 μL無菌水，其他組連續(xù)2 d口腔灌服400 μL沙門氏菌液(1×109CFU·mL-1)。肉雞15日齡時(shí)進(jìn)行屠宰取樣。試驗(yàn)肉雞以處理為單位進(jìn)行圈養(yǎng)，采用群飼，自由采食和飲水，不接種疫苗?；A(chǔ)日糧配方見表1。

1.3 樣本采集

飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)，頸靜脈取血，4 ℃放置30 min后離心，移取上層血清，分裝后保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。取結(jié)腸黏膜組織勻漿后，離心取上清液，分裝后保存于-80 ℃冰箱中。取2 cm左右肉雞結(jié)腸組織，用0.1 mol·L-1、pH 7.3的磷酸緩沖液洗凈內(nèi)容物后，放入4%甲醛固定液，4 ℃保存。刮取結(jié)腸黏膜組織0.1 g迅速浸入已放有Trizol的滅酶EP管中，勻漿后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 結(jié)腸形態(tài)

制作結(jié)腸組織切片，蘇木素伊紅(HE)染色后封片，用光學(xué)顯微鏡由低倍到高倍觀察。

1.4.2 血清炎癥因子、LPS、D-LA的測(cè)定

按照試劑盒說明書測(cè)定血清炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、血清LPS及D-LA水平。

1.4.3 結(jié)腸黏膜組織總RNA的提取

采用Trizol法提取結(jié)腸黏膜組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4.4 TLR4信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子

采用RT-PCR法測(cè)定TLR4信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB的基因表達(dá)。反應(yīng)體系為10 μL: SYBR Green Master Mix 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，DEPC水3.7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。引物序列見表2。以β-actin為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)沙門氏菌感染肉雞血清促炎性細(xì)胞因子水平的影響

如圖1所示，沙門氏菌感染顯著(P<0.05)提高了肉雞血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，飼糧中添加20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素或發(fā)酵飼料，與模型對(duì)照組相比，血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加10%發(fā)酵飼料，肉雞血清中IL-1β水平顯著(P<0.05)低于添加5%發(fā)酵飼料組和抗生素組，IL-6、TNF-α水平與這2個(gè)處理差異(P>0.05)不顯著。飼糧中添加多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能有效降低血清中促炎因子水平，添加10%發(fā)酵飼料的改善效果與添加20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素的效果接近。

表1基礎(chǔ)飼量組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table1Composition and nutrition level of basal diet(air-dry basis)

原料 Ingredients含量 Content/%營養(yǎng)水平 Nutrient levels含量Content2)玉米 Corn60.2代謝能Metabolism energy/(MJ·kg-1)12.13 魚粉 Fish meal2.0粗蛋白質(zhì) Crude protein/%20.00 干酒糟及其可溶物 DDGS2.0賴氨酸 Lys/%1.25豆粕 Soybean meal30.0蛋氨酸+胱氨酸 Met+Cys/%0.87豆油 Soybean1.5蘇氨酸 Thr/%0.83磷酸氫鈣 CaHPO41.5色氨酸 Trp/%0.26碳酸鈣 CaCO31.5鈣 Ca/%1.02食鹽 Salt0.3有效磷Virtual phosphorus/%0.45預(yù)混料 Premix1)1.0合計(jì) Total100.0

1)預(yù)混料為每kg飼量提供Fe 66.5 mg(FeSO4·H2O)，Zn 88 mg(Zn SO4·7 H2O)，Mn 110 mg(MnSO4· H2O)，I 0.7 mg(CaI2)，Se 0.288 mg(Na2SeO3)，Cu: 8.8 mg(CuSO4·5H2O)，VA11 500 IU，VB13.38 mg，VB29 mg，VD33 500 IU，VE30 mg，VK35 mg，泛酸鈣 13 mg，VB68.96 mg，氯化膽堿 800 mg，VB120.025 mg，煙酸 45 mg，生物素 0.08 mg，葉酸 1.20 mg。2)以上均為計(jì)算值。

1)The premix provided the following for per kg of diets: Fe 66.5 mg(FeSO4·H2O)，Zn 88 mg(Zn SO4·7 H2O)，Mn 110 mg(MnSO4· H2O)，I 0.7 mg(CaI2)，Se 0.288 mg(Na2SeO3)，Cu: 8.8 mg(CuSO4·5H2O)，VA11 500 IU，VB13.38 mg，VB29 mg，VD33 500 IU，VE30 mg，VK35 mg，Calcium pantothenate 13 mg，VB68.96 mg，choline chloride 800 mg，VB120.025 mg，niacin 45 mg，biotin 0.08 mg，folic acid 1.20 mg. 2)These are all calculated values.

表2基因序列(16s rRNA)

Table2Sequences of primers (16s rRNA)

基因Gene正向引物 Forward primer(5’-3’)反向引物 Reverse primer(5’-3’)β-ActinGAGAAATTGTGCGTGACATCACCTGAACCTCTCATTGCCATLR4CTGACCTACCCATCGGACACGCCTGAGAGAGGTCAGGTTGMyD88TGATGCCTTCATCTGCTACTGTCCCTCCGACACCTTCTTTCTATRAF6GACTTGGATAGTGGCTGCTGTCCCTGCGTCTCCTCTGTGANF-κBCCAGGTTGCCATCGTGTTCCCGTGCGTTTGCGCTTCTC

2.2 TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的基因表達(dá)

如圖2所示，模型對(duì)照組的TLR4、MyB88、TRAF6、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)?？股亟MMyD88、NF-κB mRNA表達(dá)顯著(P<0.05)低于模型對(duì)照組；5%發(fā)酵組和10%發(fā)酵組TLR4、MyB88mRNA表達(dá)量顯著(P<0.05)低于模型對(duì)照組和抗生素對(duì)照組。飼糧中添加多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠下調(diào)TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA表達(dá)，且效果總體上優(yōu)于硫酸粘桿菌素。

2.3 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)沙門氏菌感染肉雞結(jié)腸形態(tài)的影響

如圖3所示，肉雞感染沙門氏菌后，結(jié)腸腸道絨毛排列稀疏，腫脹明顯，空泡數(shù)量較對(duì)照組明顯增多?？股睾投嗑N聯(lián)合發(fā)酵飼料可緩解沙門氏菌對(duì)結(jié)腸腸道形態(tài)的損傷。

2.4 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)沙門氏菌感染肉雞腸道屏障功能的影響

如圖4所示，肉雞感染沙門氏菌后，血清中LPS、D-LA水平顯著(P<0.05)上升，表明沙門氏菌的入侵導(dǎo)致肉雞腸道屏障功能受損。飼料中添加硫酸粘桿菌素、10%發(fā)酵飼料后，與模型對(duì)照組相比，LPS、D-LA水平顯著(P<0.05)降低。與模型對(duì)照組相比，添加5%發(fā)酵飼料可顯著(P<0.05)降低血清中LPS水平。

A，對(duì)照組；B，模型對(duì)照組；C抗生素對(duì)照組；D，5%發(fā)酵組；E，10%發(fā)酵組。柱上無相同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)，下同。A， control group；B， model control group；C， antibiotic control group；D， 5% fermented group；E， 10% fermented group. Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 飼料對(duì)肉雞血清促炎性細(xì)胞因子水平的影響Fig.1 Influence of multi-strain co-fermented feed on the serum pro-inflammatory cytokines level of broilers

圖2 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)TLR4路徑信號(hào)分子mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Influence of multi-strain co-fermented feed on mRNA expression of key signal molece of TLR4 pathway of broilers

A， 對(duì)照組；B，模型對(duì)照組；C抗生素對(duì)照組；D，5%發(fā)酵組；E，10%發(fā)酵組。A， control group；B， model control group；C， antibiotic control group；D， 5% fermented group；E， 10% fermented group.圖3 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)結(jié)腸形態(tài)的影響(200×)Fig.3 Influence multi-strain co-fermented feed on the colon morphology of broilers (200×)

圖4 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對(duì)肉雞腸道屏障功能的影響Fig.4 Influence of multi-strain co-fermented feed on serum LPS level of gut barrier functions of broilers

3 討論

腸道是動(dòng)物體抵御致病菌入侵的重要防線[7]，沙門氏菌能夠通過炎癥反應(yīng)與腸道菌群競爭，克服定植抵抗從而在腸道中大量繁殖并引發(fā)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，直至破壞腸道屏障，引起全身疾病[8]。

本研究結(jié)果顯示，肉雞遭受沙門氏菌感染后，IL-6、TNF-α等促炎因子水平顯著上升，表明沙門氏菌的入侵引起了肉雞的炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)的發(fā)生依賴于模式識(shí)別受體對(duì)病原保守分子的識(shí)別，TLR4可通過識(shí)別細(xì)性菌細(xì)胞壁中的LPS來介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[9]。本研究結(jié)果表明，沙門氏菌的入侵導(dǎo)致TLR4路徑的關(guān)鍵信號(hào)分子mRNA表達(dá)量均顯著上升，提示TLR4在沙門氏菌誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

在本試驗(yàn)中，飼喂多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料組肉雞腸道TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于模型對(duì)照組，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著下降，提示多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠通過抑制沙門氏菌誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路的激活，下調(diào)炎癥因子的釋放，以減輕沙門氏菌感染帶來的損傷，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果相類似[10]。

腸道炎癥會(huì)破壞腸道屏障功能。血清LPS、D-LA是衡量腸黏膜功能是否完整的敏感性指標(biāo)。當(dāng)腸黏膜屏障功能正常時(shí)，LPS、D-LA均難以跨越腸黏膜屏障進(jìn)入血液，一旦腸黏膜屏障功能遭到破壞，其在外周血中的含量將明顯升高。本研究結(jié)果顯示，沙門氏菌的入侵導(dǎo)致血清LPS、D-LA的含量顯著上升，表明沙門氏菌的入侵導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，腸黏膜屏障功能遭受破壞，而多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠顯著降低血清LPS、D-LA含量，但效果略低于硫酸粘桿菌素，表明多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠減輕沙門氏菌入侵導(dǎo)致的腸道屏障功能受損的情況，該結(jié)果與結(jié)腸形態(tài)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，但究竟是益生菌起的作用還是代謝產(chǎn)物，亦或是兩者協(xié)同作用，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠通過抑制由沙門氏菌感染導(dǎo)致的TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信號(hào)的激活，從而降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，減緩沙門氏菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，此外其還能減輕沙門氏菌感染導(dǎo)致的腸道屏障受損。