肉雞谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A3基因的克隆及蛋白的表達和純化

盧曉曉，楊世雄，李娜娜，張寧，李欣，寧官保，張鼎，趙宇軍，閆芳，高榮琨，田文霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801；2.溫縣農(nóng)林局，河南 溫縣 454850)

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-Transferase，GSTs)是肝臟解毒的第二期家族酶，主要參與多種致癌物、環(huán)境毒素和氧化應激產(chǎn)物的解毒，GSTA3是GSTs超家族中α家族的一員， GSTA3具有3種轉(zhuǎn)錄物，說明GSTA3基因功能的多態(tài)性可能通過改變蛋白的表達水平或蛋白功能來影響類固醇的生成。GSTA3是人體內(nèi)非常有效的雙鍵異構(gòu)酶，在類固醇生成的組織中選擇性地表達，并參與類固醇生物的合成過程[1～3]。在體外試驗中證明了GSTA3具有抗氧化功能[4]。關(guān)于解毒方面，有研究顯示成年小鼠體內(nèi)的GSTA3亞基在黃曲霉毒素B1(AFB1)代謝的過程中非?；钴S[5，6]。

本試驗擬采用原核表達技術(shù)對肉雞GSTA3基因進行克隆，并連接至pET-28a，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中后進行蛋白表達。用鎳柱親和層析法純化GSTA3融合蛋白，并進行SDS-PAGE、Western Blot以及活性的鑒定。以期得到GSTA3融合蛋白，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物、菌株和質(zhì)粒

10日齡健康艾維茵肉雞3只，購于山西省文水縣大象農(nóng)牧集團有限公司。E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)，pET-28a原核載體由實驗室保存。ZeroBack Fast Ligation Kit購于天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

prime script TM RT Reagent Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase購于大連寶生物工程公司； 2*PCR MIX購于中科瑞泰生物科技有限公司；SYBR Green Ⅰ、AMPicillin購于北京索萊寶科技有限公司；硫酸卡那霉素、IPTG、TEMED、預染中低分子量蛋白Marker、羊抗小鼠IgG-FITC、顯影粉、定影粉、咪唑購于北京索萊寶生物科技有限公司；XhoⅠ、EcoRⅠ購于美國NEB公司；T4 DNA Ligase購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；SDS、考馬斯亮藍R-250、甘氨酸購于北京博奧拓達科技有限公司；蛋白干粉、NC膜、超敏ECL化學發(fā)光即用型底物購于武漢博士德生物工程有限公司；Anti-6×His tag? antibody購于Abcam公司；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 GSTA3基因的克隆

取3只10日齡肉雛雞斷頸處死，取脛骨生長板，做好標記，立刻置于液氮中，次日放入-80 ℃冰箱保存。采用Trizol法提取肉雞脛骨軟骨生長板總RNA。采用prime script TM RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。

依據(jù)NCBI中核酸數(shù)據(jù)庫公布的雞GSTA3 mRNA序列，序列號NM_001001777.1，運用Oligo 6軟件設(shè)計引物，包括EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，目的片段大小690 bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR具體程序為94 ℃預變性3 min， 98 ℃變性10 s，66 ℃退火5 s，72 ℃延伸l min，共30個循環(huán)，72 ℃總延伸5 min，4 ℃保存。配制2.0%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測目的片段。

1.2.2 GSTA3表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將擴增產(chǎn)物與pZeroBack/blunk克隆質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，獲得重組質(zhì)粒pZeroBack/Blunk-GSTA3測序鑒定。

將測序正確的質(zhì)粒pZeroBack/Blunk-GSTA3和表達質(zhì)粒pET-28a用EcoRⅠ、XhoⅠ進行雙酶切，雙酶切片段經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下割膠回收目的產(chǎn)物及pET-28a，用T4 DNA Ligase將雙酶切純化后的GSTA3基因與線性pET-28a質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coliBL21(DE3)，涂到含KAN的LB板上，篩選單克隆菌落，將提取質(zhì)粒測序鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-GSTA3，用于誘導表達。

1.2.3 GSTA3重組蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化

將含pET-28a-GSTA3重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)接種至含KAN的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。取菌液，以1∶100的比例轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)基中，待其長到OD600=0.5～0.7，設(shè)置IPTG濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mM，37 ℃，220 r·min-1震蕩誘導12 h，取樣2 mL；設(shè)置溫度為25、30、37 ℃，IPTG終濃度為1.0 mM，在220 r·min-1震蕩12 h，取樣2 mL；設(shè)置IPTG終濃度為1.0 mM，溫度為30 ℃，220 r·min-1震蕩6，12，21 h時各取樣2 mL；超聲處理上述樣品，離心收集上清， SDS-PAGE蛋白電泳檢測表達量。

1.2.4 GSTA3重組蛋白的純化

按優(yōu)化后條件進行大量誘導表達，取誘導的菌液，超聲處理樣品(冰水中)，4 ℃離心吸取上清，4 ℃保存以待純化。純化步驟具體操作按照Ni SepharoseTM6 Fast Flow說明書進行。采用10、20、30、40、50 mmol·L-1梯度濃度咪唑洗脫雜蛋白，采用500 mmol·L-1將目的蛋白洗脫下來，再經(jīng)低溫透析得到純蛋白。

1.2.5 GSTA3重組蛋白純化產(chǎn)物的免疫印跡驗證

SDS-PAGE電泳后切取含目的蛋白GSTA3的凝膠，然后進行轉(zhuǎn)膜，采用麗春紅染色檢驗是否轉(zhuǎn)膜成功。將轉(zhuǎn)膜后的印跡膜放入5%脫脂奶粉中，37 ℃，80 r·min-1震蕩2 h，后4 ℃封閉過夜。棄掉封閉液，加入TBST震蕩清洗印跡膜，重復2次。將印跡膜轉(zhuǎn)移至1∶1 000比例稀釋好的Anti-6×His-Tag標簽抗體(稀釋液：TBST)中，37 ℃震蕩反應4 h。回收Anti-6×His-Tag標簽抗體，4 ℃保存。向孵育盒中加入TBST，震蕩清洗印跡膜，如此重復3次。將印跡膜轉(zhuǎn)移至1∶5 000比例稀釋好的羊抗小鼠IgG-FITC抗體(稀釋液：TBST)中，37 ℃震蕩反應1 h。棄掉二抗，向孵育盒中加入TBST震蕩清洗印跡膜，重復3次。配置發(fā)光工作液，取適當大小的保鮮膜，取出印跡膜，置于保鮮膜中央，加入工作液完全覆蓋印跡膜，蓋上保鮮膜置于暗盒,蓋上暗盒曝光,之后進行顯影定影，觀察結(jié)果。

1.2.6 GSTA3重組蛋白純化產(chǎn)物活性檢測

使用谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒檢測蛋白活性。

2 結(jié)果

2.1 GSTA3基因的擴增結(jié)果

在600～1 000 bp之間出現(xiàn)特異性單一條帶，與預期的690 bp分子大小相一致(圖1)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 RT-PCR product detected by agarose gel electrophoresis注：M: 50 bp plus DNA Ladder; 1,2: RT-PCR產(chǎn)物。Note：M: 50 bp plus DNA Ladder; 1,2: Products of RT-PCR.

2.2 pZeroBack/Blunk-GSTA3克隆質(zhì)粒的序列測定

菌液PCR為陽性的菌液提取質(zhì)粒后測序，經(jīng)北京華大科技有限公司測序結(jié)果顯示，序列同源性99%，氨基酸未發(fā)生突變，表明克隆成功。

2.3 表達質(zhì)粒pET-28a和pZeroBack/Blunk-GSTA3雙酶切結(jié)果

表達質(zhì)粒pET-28a和重組克隆質(zhì)粒pZeroBack/Blunk-GSTA3經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示有3條特異性條帶，其中一條位于600～1 000 bp之間，與預期690 bp分子大小相一致，其余2條分別為未被切開環(huán)狀質(zhì)粒和被切開線性質(zhì)粒(圖2)；表達質(zhì)粒pET-28a的雙酶切結(jié)果(圖3)。

圖2 pZeroBack/Blunk-GSTA3酶切鑒定Fig.2 ldentification of pZeroBack/Blunk-GSTA3 digestion 注：M: 50 bp plus DNA Ladder; 1: pZeroBack/Blunk-GSTA3質(zhì)粒酶切。Note：M: 50 bp plus DNA Ladder;1: Digestion of pZeroBack/Blunk-GSTA3 plasmid.

圖3 pET-28a酶切鑒定Fig.3 ldentification of pET-28a digestion注：M: 50 bp plus DNA Ladder; 1,2,3,4: pET-28a質(zhì)粒酶切。Note：M: 50 bp plus DNA Ladder; 1,2,3,4: Digestion of pET-28a plasmid

2.4 陽性重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3 E. coli BL21(DE3)的篩選結(jié)果

表達質(zhì)粒pET-28a和pZeroBack/Blunk-GSTA3經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切純化后的產(chǎn)物過夜連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落菌液進行PCR鑒定。選取PCR陽性的菌液提取質(zhì)粒測序。測序結(jié)果表明序列正確，說明重組質(zhì)粒pET-28a-GSTA3E.coliBL21(DE3)構(gòu)建成功。

2.5 GSTA3融合蛋白的誘導表達

2.5.1 GSTA3融合蛋白的誘導表達的結(jié)果

將帶有空質(zhì)粒pET-28aE.coliBL21(DE3)和重組質(zhì)粒pET-28a-GSTA3E.coliBL21(DE3)同時在37 ℃，220 r·min-1，0.8 mM IPTG誘導下培養(yǎng)12 h，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示含重組質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)的未誘導組和誘導組在相對分子量29.6 kDa處均出現(xiàn)一條特異蛋白帶，與預期的分子量大小相等，同時在上樣量體積相同的情況下，重組誘導組較重組未誘導組表達量多(圖4)。

圖4 GSTA3融合蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.4 The picture of GSTA3 fusion protein detected by SDS-PAGE gel electrophoresis 注：M: 蛋白Marker; 1、2: pET-28a未誘導組和誘導組; 3、4: pET-28a-GSTA3未誘導組和誘導組。Note：M: protein Marker; 1, 2: pET-28a group without IPTG and with IPTG; 3, 4: pET-28a-GSTA3 without IPTG and with IPTG.

2.5.2 GSTA3融合蛋白表達的可溶性判斷

取2 mL誘導菌液，經(jīng)超聲擊碎處理離心，獲得的含可溶性蛋白的裂解上清和含不溶性蛋白的沉淀進行SDS-PAGE電泳，分析GSTA3融合蛋白在裂解上清和沉淀中的分布情況，結(jié)果顯示GSTA3融合蛋白在裂解上清和沉淀中均有分布，在相同上樣體積的情況下，GSTA3融合蛋白在上清中的表達也較多(圖5)。

圖5 GSTA3融合蛋白在E. coli BL21中的定位分析的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.5 Analysed the position of GSTA3 protein in BL21 detected by SDS-PAGE gel electrophoresis注：M: 蛋白Marker; 1: 菌液裂解上清; 2: 菌液裂解沉淀。Note：M: protein Marker; 1: Microbial supernatant; 2: Microbial precipitation.

2.5.3 不同濃度的IPTG對GSTA3融合蛋白表達的影響

在不同濃度的IPTG誘導情況下，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示隨著IPTG濃度的增加，含重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)宿主菌表達效果越好，IPTG終濃度為1.0 mM時表達最多(圖6)。

圖6 不同濃度IPTG誘導的GSTA3融合蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.6 The picture of GSTA3 fusion proteins induced by different concentration IPTG注：M: 蛋白Marker; 1～5: 0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1.0 mM IPTG誘導組。Note：M: protein Marker; 1～5: The groups with 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM IPTG.

2.5.4 不同溫度的誘導對GSTA3融合蛋白表達的影響

在不同溫度的誘導下，含重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)的蛋白表達的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在25 ℃時，GSTA3融合蛋白在上清中幾乎不表達，在30 ℃和37 ℃時，GSTA3融合蛋白在上清中表達量較高(圖7)。

圖7 不同溫度誘導的GSTA3融合蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.7 The GSTA3 fusion proteins induced by different temperature注：M: 蛋白Marker; 1: 25 ℃誘導組; 2: 30 ℃誘導組; 3: 37 ℃誘導組。Note：M: protein Marker; 1: the group at 25 ℃; 2: The group at 30 ℃; 3: The group at 37 ℃.

2.5.5 不同時間的誘導對GSTA3融合蛋白表達的影響

含重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)不同時間的蛋白誘導表達的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在誘導后6 h，GSTA3融合蛋白在上清中幾乎不表達，在21 h時，GSTA3融合蛋白在上清中表達量相對較高(圖8)。

圖8 不同時間段誘導的GSTA3融合蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.8 The picture of GSTA3 fusion proteins induced by different time注：M: 蛋白Marker; 1、2: 未誘導和誘導6 h組; 3、4: 未誘導和誘導12 h組; 5、6: 未誘導和誘導21 h組。Note：M: protein Marker; 1, 2: expressing 6 h group without IPTG and with IPTG; 3, 4: expressing 12 h group without IPTG and with IPTG; 5, 6: expressing 21 h group without IPTG and with IPTG.

2.5.6 免疫印跡鑒定GSTA3融合蛋白

含表達質(zhì)粒pET-28a的E.coliBL21(DE3)和含重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)誘導后取裂解上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，與1∶1000的His-Tag標簽抗體進行Western Blot分析，結(jié)果顯示含重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)誘導組和未誘導組均出現(xiàn)單一特異性條帶(圖9)。

圖9 GSTA3融合蛋白Western Blot鑒定結(jié)果Fig.9 The identification result of GSTA3 fusion protein by Western Blot注：1、2: pET-28a未誘導組和誘導組; 3～5: pET-28a-GSTA3未誘導組、誘導組上清部分和沉淀部分。Note：1, 2: pET-28a group without IPTG and with IPTG; 3～5: pET-28a-GSTA3 group without IPTG, Supernatant and precipitation of pET-28a-GSTA3group with IPTG.

2.6 GSTA3融合蛋白的純化

將GSTA3融合蛋白的裂解上清通過親和層析法進行純化，分別收集洗雜液，洗脫液，每管取20 μL進行SDS-PAGE電泳，最后結(jié)果顯示咪唑終濃度為30 mM的洗雜液洗脫效果最好，咪唑終濃度為500 mM的Soluble Elution Buffer洗脫目的蛋白效果較好。

2.7 免疫印跡鑒定GSTA3融合蛋白純化產(chǎn)物

GSTA3融合蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，與1∶1 000稀釋的Anti-6×His-Tag標簽抗體進行Western Blot分析，結(jié)果顯示單一特異性蛋白帶。

2.8 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測定結(jié)果

根據(jù)試劑盒公式計算，重組表達的蛋白GSTA3具有生物活性。

3 討論

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase；GSTs)是一類具有多種生物功能的酶。GSTs是機體解毒過程中的一個關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)二期細胞解毒。GSTs催化一系列外來化合物如醫(yī)藥、結(jié)合重金屬、殺蟲劑、除草劑、持久性有機污染物(POPs)和聚芳碳氫化合物(多環(huán)芳烴)。除了外源性底物，GSTs可催化結(jié)合多樣化的內(nèi)源化合物包括脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物和氧化應激的下游產(chǎn)物即4-羥基壬烯酸(4HNE)和丙烯醛，DNA降解[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)PC12細胞在亞致死濃度的LPS處理后GSTA3基因呈上調(diào)表達，其表達量是未處理PC12細胞表達量的60倍，同時GSTA3也可以提高其它GSTs活性[4]。GSTs抑制劑和GSTA3小干擾RNA可有效衰減機體的適應性保護反應；轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是由LPS轉(zhuǎn)錄激活；此外，外周注射亞致死濃度的LPS也增加了小鼠大腦GSTs活性；綜上表明，LPS在亞致死濃度通過激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2信號通路誘導GSTA3上調(diào)，從而刺激細胞適應性反應并提高PC12細胞的耐受性[4]。GSTA3還具有類固醇異構(gòu)酶的活性，參與類固醇激素的合成例如雌激素，雄激素等。類固醇激素在骨的生長發(fā)育和重建方面起著非常重要的作用，過多的糖皮質(zhì)激素可能會引發(fā)骨質(zhì)疏松，而雄激素和雌激素對骨的生長具有保護的作用[8]。

本試驗采用體外原核表達系統(tǒng)來表達肉雞GSTA3。大腸桿菌是目前運用最為廣泛、研究最深入、技術(shù)最成熟的表達系統(tǒng)，因為大腸桿菌生長速度快，表達效率高，遺傳背景清晰，成本低，周期較短，可兼容多種抗體[9～12]。pET系列是當前運用最多的能夠高效表達融合性表達的質(zhì)粒。其質(zhì)粒上含有His-tag標簽，它的分子量較小，一般對目的蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及溶解性的影響較小，且純化過程簡便易行，能極大地縮短試驗的時間。

影響外源蛋白表達效率的因素很多，例如表達質(zhì)粒、宿主、培養(yǎng)基的pH、加入誘導劑的時機、合適的溫度、時間的選擇以及適當?shù)恼T導劑濃度等。本試驗根據(jù)王智慧的研究[13]將工程菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期OD600為0.5～0.7，然后添加誘導劑，降低了試驗的盲目性，縮短了條件優(yōu)化的時間。誘導大腸桿菌外源蛋白可溶性表達的因素有很多，除了宿主菌、表達質(zhì)粒的選擇外，在試驗過程中還需不斷地改變誘導的溫度、時間以及誘導劑濃度等[14～16]。本試驗通過超聲破碎菌液后發(fā)現(xiàn)，GSTA3融合蛋白在上清中有表達，但是沉淀中也有，說明GSTA3融合蛋白有可溶性的存在，但同時還有部分包涵體。因此本試驗試圖通過優(yōu)化培養(yǎng)條件以增加目的蛋白的上清表達量，從試驗結(jié)果來看，當IPTG的終濃度是1.0 mmol·L-1時，目的蛋白GSTA3上清表達量最多；從誘導溫度上來看，30 ℃和37 ℃目的蛋白上清表達量相當。本試驗選擇30 ℃進行誘導表達，因為降低溫度可以降低菌體內(nèi)酶系的活性，使得表達速率減慢[17]。從誘導時間結(jié)果上來看，21 h時可溶性GSTA3融合蛋白表達量較12 h多。有文獻報道，當大腸桿菌再加入誘導劑后，菌體自身的大部分精力都集中在外源蛋白的表達上，這會導致大腸桿菌的衰亡期提前，如果長時間誘導，可能會出現(xiàn)溶菌的現(xiàn)象[18]。因此本試驗選取的最佳誘導時間為12 h。綜上所述，獲得可溶性GSTA3融合蛋白的最佳條件為大腸桿菌生長至對數(shù)生長期即OD600=0.5～0.7，IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，30 ℃培養(yǎng)12 h。

從試驗結(jié)果可以看出，未加IPTG的含重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3的E.coliBL21(DE3)組中也有少量GSTA3的表達。有研究表明，LB培養(yǎng)基成分中的酵母粉可促使大腸桿菌的滲漏表達[19，20]。本試驗采用的LB培養(yǎng)基中的一種成分是OXIOD酵母粉，推測本試驗采用的產(chǎn)品里含有乳糖，這可能是大腸桿菌直接滲漏性表達的結(jié)果。

由于pET-28a表達質(zhì)粒上自身帶有6×His-tag標簽，所以經(jīng)超聲破碎后的上清(可溶性蛋白)通過鎳柱親和層析法進行分離純化[21]。最后的結(jié)果可以看出終濃度為30 mM咪唑的洗雜液洗雜蛋白效果較好，終濃度為500 mM咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白的效果很好，所以在以后的蛋白分離純化過程中選取終濃度為30 mM的咪唑洗雜蛋白，終濃度為500 mM咪唑洗的洗脫液洗脫目的蛋白以便取得純度較高的目的蛋白，另外通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒檢測確定了其具有生物學活性，這些試驗條件的確定為后續(xù)進行的動物試驗提供保障。

4 結(jié)論

本試驗成功構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pZeroBack/Blunk-GSTA3和重組表達質(zhì)粒pET-28a-GSTA3，當IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1、30 ℃下誘導12 h時獲得高效表達的可溶性GSTA3融合蛋白，并得以純化，其大小為29.6 kDa，為后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。