茶輪斑病體外抑制試驗及大田防治效果

董照鋒

(商洛市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西 商洛 726000)

茶輪斑病(PestalotiopsistheaeSawada)于上世紀七十年代初在日本靜岡縣發(fā)生并確認以來, 目前在世界各產(chǎn)茶區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，我國的浙江、安徽、福建、云南、臺灣、貴州、海南等省發(fā)生均較普遍,是茶樹的重要病害之一[1]。近年來，國內(nèi)茶葉種植面積不斷擴大，規(guī)模化程度不斷提高，冬季氣溫回暖現(xiàn)象多有發(fā)生，致使茶輪斑病發(fā)生范圍擴大、發(fā)生程度加重，嚴重地影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。2017年7月在陜西山陽、商南、鎮(zhèn)安3個縣茶園調(diào)查發(fā)現(xiàn)茶葉輪紋病平均病株率90%、病葉率25%～30%，為害較為嚴重[2]。國內(nèi)關(guān)于茶輪斑病防治的研究有些報道，1982年日本堀川知廣試驗篩選了甲基托布津、百菌清、敵菌丹等防治藥劑[3]。李圣章試驗表明50%多菌靈WP、12.5%腈菌唑EC、70%甲基托布津WP、15%三唑酮WP、75%百菌清WP、50%撲海因WP、50%腐霉利WP對茶葉輪斑病有良好的控制表現(xiàn)[4]。陳宗懋試驗表明用0.001%苯氟磺胺和噻菌靈可100%阻止病原菌生長發(fā)育[5]。郭世保研究表明25%阿米西達懸SC150 g·hm-2、10%世高WG125 g·hm-2、25%丙環(huán)唑EC 112.5 g·hm-2和75%百菌清(WP) 125 g·hm-2防效分別為86.96%、81.16%、74.79%和72.38%[6]。 崔宏春試驗表明100 g·L-1油茶皂素防效可達到74.58%[7]。冉隆珣研究結(jié)果表明400倍武夷菌素防效為40.77%[8]。研究文獻發(fā)現(xiàn)，試驗篩選的多數(shù)農(nóng)藥當前已經(jīng)退出市場或生產(chǎn)上很少使用，個別生物農(nóng)藥防效較低，實際用于生產(chǎn)的意義不大，有的只是商品名稱，有些市場上很少銷售。為了有效地控制茶輪斑病的危害，篩選出高效、安全、環(huán)保的農(nóng)藥品種，特選取武夷菌素、多抗霉素、枯草芽孢桿菌、春雷霉素、戊唑醇等5種藥劑對茶輪斑病病原菌的抑菌效果，開展室內(nèi)抑菌試驗，并在此基礎(chǔ)上開展了大田防治試驗。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

2%武夷菌素水劑：山東濰坊萬勝生物農(nóng)藥有限公司。

3%多抗霉素水劑：績溪農(nóng)華生物科技有限公司。

6%春雷霉素可濕性粉劑：山東利邦農(nóng)化有限公司。

枯草芽孢桿菌100億芽孢·g-1可濕性粉劑：德強生物股份有限公司。

戊唑醇430 g·L-1浮劑：西安鼎盛生物化工有限公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

茶葉PDA培養(yǎng)基：自來水1 000 mL、葡萄糖20 g、茶葉粉(80目)15 g、 瓊脂粉15 g、馬鈴薯200 g。

清水瓊脂培養(yǎng)基：清水1 000 mL,瓊脂粉15 g。

1.3 供試菌種

供試的病原菌茶葉輪斑病，為2016年10月23日從商南縣富水鎮(zhèn)茶坊村山地老茶園采得，經(jīng)實驗室分離鑒定后獲得純種，接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基置于4 ℃保存，每隔3～4個月對菌種進行一次活化。

1.4 試驗方法

1.4.1 對茶輪斑病菌絲及分生孢子的抑制試驗

采用菌絲生長速率法[9，10]和孢子萌發(fā)法[11，12]分別測定5種供試藥劑對菌絲和分生孢子萌發(fā)的抑制活性。試驗分6個處理, 每個處理4個重復,每個處理濃度按照使用說明推薦用量確定。A:2%武夷菌素AS 500倍；B:3%多抗霉素AS 500倍；C:6%春雷霉素WP 600倍；D:枯草芽孢桿菌100億芽孢·g-1WP 600倍；E:戊唑醇430 g·L-1懸浮劑SC 3000倍；CK:無菌水。

含藥培養(yǎng)基制備：將供試藥劑用滅菌水稀釋至試驗設(shè)計倍數(shù)的1/10編號備用，取5 mL稀釋好的藥液注入100 mL滅菌的燒杯中，加入經(jīng)高壓蒸氣滅菌并冷卻到50 ℃左右的茶葉PDA培養(yǎng)基45 mL,充分混合均勻后取10 mL注入滅菌的9 cm培養(yǎng)皿中制成試驗濃度的茶葉PDA平板,以等量無菌水培養(yǎng)基作空白對照。

菌絲接種：將病原菌接于茶葉粉PDA培養(yǎng)基，25 ℃、濕度90%培養(yǎng)5 d活化菌種，在菌落周邊生長旺盛、一致處用打孔器制作直徑6 mm菌餅，每皿茶葉粉PDA平板培養(yǎng)基植入1塊菌餅至中心位置，將各處理置入25 ℃、濕度90%條件下培養(yǎng)，分別于48 h、72 h、96 h、120 h用十字交叉法測量各皿菌落直徑，計算菌絲生長擬制率。

菌絲生長抑制率/%=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)÷ (對照菌落直徑-菌餅直徑) ]×100。

孢子懸浮液制備及接種：1 000 mL自來水加入市售毛尖茶100 g，煮沸30 min，用雙層紗布過濾后，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min，制成茶汁備用。選取培養(yǎng)12 ～ 13 d已產(chǎn)孢的平板1～2皿，在無菌條件下加入10 mL茶汁，用接種鏟輕刮菌落表面，在已滅菌的口徑7 cm漏斗上加1層擦鏡紙，將孢子懸浮液過濾在已滅菌的50 mL錐形瓶內(nèi)，并加滅菌的棉塞。取1～2滴孢子懸浮液在顯微鏡下觀察孢子量，以加入適量滅菌水或茶汁的方法，調(diào)節(jié)孢子濃度至每個視野80～100個孢子為宜。

分生孢子接種：采用水瓊脂培養(yǎng)法，取2 mL稀釋好的藥液注入50 mL滅菌燒杯，加入經(jīng)高壓蒸氣滅菌并冷卻到50 ℃左右的清水瓊脂培養(yǎng)基18 mL混合均勻，取10 mL含藥培養(yǎng)基注入9 cm培養(yǎng)皿中，制成含藥平板培養(yǎng)基。以等量無菌水代替農(nóng)藥制成清水瓊脂培養(yǎng)基為空白對照。在每個培養(yǎng)皿背面用記號筆畫3個小圈標記孢子懸浮液滴入點位置以便觀察，在每個圓圈滴1滴孢子懸浮液，即為3次重復。將各處理置于25 ℃、濕度90%條件下培養(yǎng)，在對照組孢子萌發(fā)80%～90%時，將對應處理組全部取出放入4 ℃冰箱冷藏，終止孢子繼續(xù)萌發(fā)。遂后逐一取出鏡檢統(tǒng)計各處理孢子萌發(fā)情況。

孢子萌發(fā)率/%=(孢子萌發(fā)數(shù)量÷觀察孢子數(shù)量)×100

孢子萌發(fā)抑制率/%=[(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)÷對照孢子萌發(fā)率]×100

1.4.2 殺菌劑濃度梯度試驗

根據(jù)1.4.1篩選出抑菌效果較好的藥劑進行濃度梯度試驗，測定殺菌劑的生物活性，試驗方法參照1.4.1。

1.4.3 殺菌劑聯(lián)合作用試驗

根據(jù)1.4.1和1.4.2篩選出抑菌效果較好的藥劑和濃度進行藥劑組合，測定殺菌劑的生物活性，試驗方法同上。

1.4.4 茶輪斑病大田防治試驗

試驗在商南縣富水鎮(zhèn)茶坊村8年生豐產(chǎn)茶園開展。根據(jù)茶輪斑病病原菌抑菌試驗結(jié)果，試驗共設(shè)6個處理、4次重復，隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積48 m2。A: 6%春雷霉素WP 1 000倍；B: 100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌WP 1 000；C: 430 g·L-1戊唑醇SC 5 000倍；D: 430 g·L-1戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍；E: 6%春雷霉素WP 1 000倍、100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌WP 1 000倍交替使用；F：清水對照。噴藥器械采用背負式手動噴霧器，共進行2次噴藥防治，第一次防治時間為2018年8月16日，第二次防治時間為8月26日。噴施藥液量為4 kg·hm-2，噴施重點為中、上部新生枝葉。調(diào)查方法：每個小區(qū)于中間兩畦茶樹按5點取樣法，每點10個當年新生茶枝，并用編織繩框定標記(每個小區(qū)至少要有1點新生枝條上有個別已發(fā)病的葉片)，調(diào)查每個新生枝條上所有葉片，記載各枝總?cè)~數(shù)、病葉數(shù)、嚴重度，分別統(tǒng)計計算各小區(qū)調(diào)查總?cè)~數(shù)、病葉數(shù)、病葉率、平均嚴重度及病情指數(shù)。于第一次防前、防治后10 d、第二次防治后10 d、20 d調(diào)查各小區(qū)白色編織繩框定標記的各點病情。

茶輪斑病嚴重度分級標準：

0級：無病斑；

1級：病斑占葉面積≤1/4；

4級：病斑占葉面積>3/4。

病情指數(shù)=[∑(病級葉片數(shù)×該病級數(shù))/(調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病級值)]×100

病指減退率/%=[(施藥前病指-施藥后病指)/施藥前病指]×100

校正防效/%=[(處理區(qū)病指減退率-對照區(qū)病指減退率)/(100-對照區(qū)病指減退率)]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 5種藥劑對菌絲生長抑制作用

表1、圖1表明，3000倍戊唑醇430 g·L-1SC抑制效果最好，48 ～120 h抑制率均為100%。600倍枯草芽孢桿菌100億芽孢·g-1WP、600倍6%春雷霉素WP、500倍2%武夷菌素AS和500倍3%多抗霉素AS 120 h抑制率分別為88.63%、44.61%、43.88%和14.29%，枯草芽孢桿菌抑制效果呈逐漸上升趨勢。通過方差分析和多重比較(LSD)，120 h時戊唑醇、枯草芽孢桿菌與對照抑制率差異達極顯著水平，兩者之間差異極顯著；枯草芽孢桿菌與其它3種藥劑抑制率差異極顯著。

2.2 5種藥劑對孢子萌發(fā)抑制作用

表2表明，接種后6 h觀察CK孢子萌發(fā)率達92.93%，6%春雷霉素WP 600倍抑制效果最好，抑制率為100%，與其它5個處理差異達極顯著水平。3%多抗霉素AS 500倍、戊唑醇430 g·L-1SC 3000倍、枯草芽孢桿菌100億芽孢·g-1WP 600倍、2%武夷菌素AS 500倍抑制率分別為46.17%、11.31%、3.58%、1.38%，對孢子萌發(fā)的抑制作用較差。

表1 5種殺菌劑對菌絲的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of 5 fungicides on hyphae

注：以上為4次重復平均值，同列不同大小字母分別表示0.01、0.05水平差異顯著。

Note: The above is the average value of 4 repetitions. The different sizes of letters in the same column indicate significant differences in the levels of 0.01 and 0.05 respectively.

圖1 5種殺菌劑對茶輪斑病菌絲120 h抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of 5 fungicides on 120 h of tea leaf spot disease

2.3 殺菌劑濃度梯度試驗結(jié)果

2.3.1 不同濃度春雷霉素對菌絲和分生孢子的抑制效果

試驗結(jié)果表明，6%春雷霉素WP 400倍、600倍、800倍、1000倍、1200倍對菌絲抑制作用不明顯，抑制率分別為58.32%、55.26%、51.58%、39.79%和32.84%。表3表明，接種后6 h觀察，CK孢子萌發(fā)率達88.1%，6%春雷霉素WP 5個濃度抑制率均為100%。

表2 5種殺菌劑對分生孢子的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of 5 fungicides on conidia

注：以上為3次重復平均值，同列不同大小字母表示0.01、0.05水平差異顯著。

Note: The above is the average of 3 repetitions, the different sizes of letters in the same column indicate significant differences in the levels of 0.01 and 0.05 respectively.

表3 不同濃度春雷霉素對分生孢子萌發(fā)抑制作用Table 3 Inhibitory effect of different concentrations of kasugamycin on conidial germination

注：以上為3次重復平均值。

Note: The above is the average of 3 repetitions.

表4 不同濃度戊唑醇對菌絲抑制作用Table 4 Inhibitory effect of different concentrations of tebuconazole on mycelium

注：以上為4次重復平均值。

Note: The above is the average of 4 repetitions.

2.3.2 不同濃度戊唑醇對菌絲和分生孢子的抑制效果

表4表明，戊唑醇430 g·L-1SC 3 000倍、3 500倍、4 000倍、4 500倍、5 000倍在120 h時對菌絲抑制率均為100%，抑制效果顯著、作用持久。試驗表明，相同濃度梯度對分生孢子抑制效果較差，抑制率分別為、16.62%、16.53%、14.97%、14.79%和14.28%。

2.3.3 不同濃度枯草芽孢桿菌對菌絲和分生孢子抑制效果

表5表明，不同濃度枯草芽孢桿菌對菌絲的抑制作用明顯，120 h時500倍、1 000倍、1 500倍、2 000倍、2 500倍、3 000倍對菌絲的抑制率分別為90.23%、87.79%、85.34%、83.71%、79.64%、76.38%，隨著時間的變化，不同濃度的抑制效果均呈遞增趨勢，在120 h時達到最大抑制率。如上濃度枯草芽孢桿菌對分生孢子抑制試驗表明，抑制率分別為15.51%、10.15%、10.05%、9.85%、9.48%和2.48%。通過方差分析和多重比較(LSD)，6個濃度抑制率與對照差異極顯著，500倍與1 000倍差異不顯著而與1 500及以上倍數(shù)差異顯著; 1 000倍與1 500倍、2 000倍差異不顯著而與2 500倍、3 000倍差異顯著；2 000倍與2 500倍差異不顯著與3 000倍差異顯著。

2.4 殺菌劑混配對菌絲和分生孢子的擬制作用

根據(jù)5種藥劑處理對菌絲和孢子的抑制試驗結(jié)果，選擇5 000倍戊唑醇430 g·L-1SC+1 000倍6%春雷霉素WP混配、1 000倍枯草芽孢桿菌100億芽孢·g-1WP + 1 000倍6%春雷霉素WP混配對菌絲和孢子抑制作用進行試驗。表6表明，2種混配對菌絲都有較好的抑制作用，戊唑醇+春雷霉素混配抑制率達到100%，從48 h到120 h抑制率沒有降低，與戊唑醇抑制作用相當?？莶菅挎邨U菌+春雷霉素混配在48 h和120 h對菌絲抑制率分別為74.67%和60.77%，抑制率隨著時間的推移而逐漸降低，實際上減弱了枯草芽孢桿菌對菌絲的抑制作用。通過方差分析和多重比較(LSD)，在120 h時2個混配處理與對照抑制率差異極顯著，兩者之間抑制效果差異極顯著。

表5 不同濃度枯草芽孢桿菌對菌絲抑制作用Table 5 Inhibitory effect of bacillus subtilis with different concentrations on mycelia

注：以上數(shù)據(jù)均為4次重復平均值，同列不同小字母表示0.05水平差異顯著。

Note: The above data are 4 repeated averages, and the same small number of letters indicates 0.05 significant difference.

表6 不同殺菌劑混配對病菌菌絲的抑制作用Table 6 Quasi inhibitory effects of different fungicides on fungal hyphae

注：以上數(shù)據(jù)均為4次重復平均值，同列不同大小寫字母表示0.01、0.05水平差異顯著。

Note: The above data are the average of 4 repetitions.The different sizes of letters in the same column indicate significant differences in the levels of 0.01 and 0.05 respectively.

表7表明，接種后6 h觀察5 000倍戊唑醇430 g·L-1SC+1 000倍6%春雷霉素WP混配、1 000倍枯草芽孢桿菌100億芽孢·g-1WP+1 000倍6%春雷霉素WP混配對分生孢子抑制作用顯著，當對照萌發(fā)率為80.09%時2個處理都未萌發(fā)，抑制率均為100%。

2.5 大田防治試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，5個藥劑處理對茶輪斑病都有較好的防治效果(表8)。戊唑醇與戊唑醇+春雷霉素兩個處理對病害控制見效快、效果明顯，在第1次防治后10 d防效分別為71.78%和71.47%，第2次防治后10 d防效分別為78.64%和77.48%，兩次防效無顯著差異，第2次防治后20 d戊唑醇防效下降趨勢明顯，戊唑醇+春雷霉素的藥效持久性比戊唑醇好。春雷霉素與枯草芽孢桿菌交替使用在第2次施藥后10 d防效為73.76%，20 d防效為76.17%，防效最好并呈上升趨勢，說明該處理藥效持久。春雷霉素與枯草芽孢桿菌交替使用和戊唑醇與春雷霉素混配使用的防效無顯著差異。

表7 不同殺菌劑混配對分生孢子萌發(fā)抑制作用Table 7 Mixed inhibition of different fungicides on conidial germination

注：以上數(shù)據(jù)均為3次重復平均值，同列不同大小寫字母表示0.01、0.05水平差異顯著。

Note: All the above data are repeated three times, the different sizes of letters in the same column indicate significant differences in the levels of 0.01 and 0.05 respectively.

表8 茶輪斑病大田防治試驗效果Table 8 Experiment on control of Pestalotiopsis theae Sawada in field

注：以上數(shù)據(jù)為4次重復均值，不同字母表示0.05水平差異顯著。

Note: the above data are 4 repeated averages, and the same small number of letters indicates 0.05 significant difference.

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

(1)生產(chǎn)中可采用430 g·L-1戊唑醇SC 5 000倍+6%春雷霉素WP 1 000倍或者6%春雷霉素WP 1 000倍與100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌WP 1 000倍交替使用兩個配方進行防治。同時要綜合考慮防治成本與產(chǎn)品安全，特別是有機、綠色茶園建議在8月下旬用6%春雷霉素1 000倍與100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌WP 1 000倍間隔10～15 d交替噴霧1次，可有效降低病害的越冬基數(shù)，防治茶輪斑病。

(2)在試驗中發(fā)現(xiàn)多抗霉素對茶輪斑病分生孢子有致畸作用，畸形率達到43.33%，主要表現(xiàn)為芽管顯著偏短，部分芽管嚴重畸形，局部膨大似葫蘆狀(圖2)，關(guān)于其機理還需進一步研究。

圖2 分生孢子致畸現(xiàn)象Fig.2 Teratogenicity of conidia

3.2 結(jié)論

通過對茶輪斑病病原菌體外抑制試驗表明，戊唑醇和枯草芽孢桿菌對茶輪斑病菌絲都有較好的抑制作用，接種120 h戊唑醇3 000～5 000倍抑制率均高達100%，枯草芽孢桿菌500倍和2 000倍抑制率分別為90.25%和83.71%，春雷霉素對分生孢子抑制效果最好,400～1 200倍抑制率均為100%。戊唑醇與春雷霉素混配對菌絲和孢子抑制效果明顯且作用持久?？莶菅挎邨U菌與春雷霉素混配降低了枯草芽孢桿菌對菌絲抑制效果，對分生孢子抑制率也僅相當于春雷霉素的抑制效果。大田防治試驗結(jié)果表明，春雷霉素、枯草芽孢桿菌、戊唑醇對茶輪斑病都有較好的防治效果，戊唑醇具有速效性，春雷霉素、枯草芽孢桿菌具有緩釋型。戊唑醇、戊唑醇+春雷霉素、春雷霉素與枯草芽孢桿菌交替使用3個處理在第2次防治后10 d對茶輪斑病防效分別為78.64%、77.48%和73.76%，第2次防治后20 d戊唑醇防效下降趨勢明顯，戊唑醇+春雷霉素的藥效持久性比戊唑醇好，春雷霉素與枯草芽孢桿菌交替使用防效最好并呈上升趨勢。