熒光量子點(diǎn)功能材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

俞鍇

寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院設(shè)備科 （浙江寧波 315000）

量子點(diǎn)（quantum dot，QD）又稱(chēng)為半導(dǎo)體納米微晶體（semiconductor nanocrystal）材料，由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成，粒徑為1～100 nm，是小于或接近激子玻爾半徑的半導(dǎo)體納米顆粒[1]。熒光量子點(diǎn)功能材料是一種新興的無(wú)機(jī)發(fā)光納米材料，因其獨(dú)特的光學(xué)性能、電學(xué)和光電性質(zhì)，克服了細(xì)胞在可見(jiàn)光區(qū)的自發(fā)熒光對(duì)標(biāo)記分子所發(fā)信號(hào)的掩蓋現(xiàn)象，較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)所研究分子的長(zhǎng)時(shí)間熒光標(biāo)記觀察。因此，熒光量子點(diǎn)功能材料作為一種生物示蹤的標(biāo)志物，受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注與研究，并已成為近期新的國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

1 熒光量子點(diǎn)功能材料的基本特點(diǎn)及合成修飾方法

1.1 熒光量子點(diǎn)功能材料的基本特點(diǎn)

探索和發(fā)展高靈敏度的非同位素檢測(cè)方法一直是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域十分關(guān)注的課題，其中使用有機(jī)熒光染料來(lái)標(biāo)記細(xì)胞是廣泛應(yīng)用的方法之一。傳統(tǒng)的熒光染料有著不可逾越的缺陷：較寬的發(fā)射光譜和較窄的激發(fā)光譜，在多種成分同時(shí)成像時(shí)容易造成熒光光譜的重疊，導(dǎo)致了熒光探針數(shù)量較少；熒光染料性質(zhì)不穩(wěn)定，容易分解和漂白，其產(chǎn)物易對(duì)細(xì)胞造成破壞[2]。熒光量子點(diǎn)功能材料相比于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光分子，具有分子激發(fā)光譜特性好、發(fā)射光譜對(duì)稱(chēng)、吸收光譜寬而連續(xù)、熒光效率高、壽命長(zhǎng)、光學(xué)化學(xué)穩(wěn)定性、不易被生物活性物質(zhì)降解等優(yōu)點(diǎn)[3]。量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)可以通過(guò)改變熒光量子點(diǎn)的半徑以及化學(xué)成分而得到，因此其熒光覆蓋了從近紫外光到近紅外光的光譜范圍。量子點(diǎn)標(biāo)記作為一種高靈敏度的非同位素檢測(cè)方法，被認(rèn)為是有機(jī)熒光標(biāo)記染料的合適替代物。

1.2 熒光量子點(diǎn)功能材料的合成及修飾方法

熒光量子點(diǎn)功能材料的合成方法有溶膠法、溶膠凝膠法、微乳液法、電化學(xué)沉積法、氣相沉積法等[4]，其制備研究早期，普遍使用產(chǎn)量低、粒徑分布特性差的氣相沉積法或者是水溶液中的共沉淀法。經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展，熒光量子點(diǎn)功能材料的合成從有機(jī)金屬法過(guò)渡到水相合成法，再到目前較為常用的溶膠法。如今，量子點(diǎn)的合成技術(shù)在粒徑分布、熒光量子的產(chǎn)率及一次合成的數(shù)量上都有了明顯的突破。

熒光量子點(diǎn)材料的發(fā)光性質(zhì)不僅同其合成技術(shù)有關(guān)，而且還與其表面所修飾的分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)密切相關(guān)。在熒光量子點(diǎn)材料修飾具有特異性識(shí)別目標(biāo)物的生物分子或者其他化合物時(shí)，就可以利用熒光量子點(diǎn)的熒光增強(qiáng)、熒光淬滅、氧化還原的性質(zhì)與待檢測(cè)的底物聯(lián)系起來(lái)或者發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而將其用于目標(biāo)物的分析。如將熒光量子點(diǎn)材料用不同的金屬離子來(lái)修飾，以構(gòu)建新型的傳感材料。

一般情況下，合成的熒光量子點(diǎn)因表面覆蓋一層疏水的配體而難以直接應(yīng)用于以水溶液為微環(huán)境的生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，需要對(duì)其進(jìn)行一定的修飾才能使其具有水溶性。目前，已經(jīng)存在多種修飾熒光量子點(diǎn)的方法，如包覆法、化學(xué)交換法、疏水相互結(jié)合法等。

2 熒光量子點(diǎn)功能材料在生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用

熒光量子點(diǎn)材料在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境檢測(cè)、食品衛(wèi)生和公共安全等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。由于其應(yīng)用領(lǐng)域較為寬泛，因此本研究主要討論熒光量子點(diǎn)功能材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

按照基于熒光量子點(diǎn)功能材料的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用的生物學(xué)層次不同和熒光量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中作用的底物不同，可將其應(yīng)用領(lǐng)域分為3個(gè)不同層次。

2.1 熒光量子點(diǎn)功能材料在生物大分子和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)記中的應(yīng)用

熒光量子點(diǎn)材料激發(fā)光譜波長(zhǎng)寬、耐光漂白性強(qiáng)、便于實(shí)現(xiàn)多組標(biāo)的物同時(shí)檢測(cè)，是生物大分子和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)定和檢測(cè)的理想標(biāo)志物。具有高靈敏特性的熒光量子點(diǎn)功能材料在進(jìn)行界面修飾和特異性連接后，可以用來(lái)觀察微量的生物分子間的相互作用，在細(xì)胞定位、信號(hào)傳導(dǎo)、分子運(yùn)動(dòng)遷移等研究中發(fā)揮重要的作用。

Hu等[5]利用熒光量子點(diǎn)材料的高度特異性，將其應(yīng)用于免疫分析過(guò)程中，討論了以微流控蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，連接二抗（羊抗鼠IgG）和水相合成的CdTe/CdS熒光量子點(diǎn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的高靈敏多組分同時(shí)檢測(cè)的新方法。這種新方法把檢測(cè)靈敏度提高到250 fmol/L，與有機(jī)染料檢測(cè)方法相比提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)。這一研究對(duì)早期檢測(cè)血清中腫瘤標(biāo)志物等早期診斷具有重要的意義。Chan和Nie[6]將熒光量子點(diǎn)功能材料與傳鐵蛋白交聯(lián)，并通過(guò)受體介導(dǎo)的方式將量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移到海拉細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這些量子點(diǎn)可以識(shí)別細(xì)胞內(nèi)特定的抗體或者抗原。這不僅證明了經(jīng)熒光量子點(diǎn)功能材料標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白仍具生物活性，同時(shí)也證明了熒光量子點(diǎn)功能材料以其粒徑優(yōu)勢(shì)可以自如地通過(guò)吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞。這項(xiàng)研究為熒光量子點(diǎn)功能材料可以作用于活細(xì)胞內(nèi)單分子的檢測(cè)及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供了理論支持。Agrawal等[7]利用經(jīng)彩色編碼的熒光量子點(diǎn)功能材料檢測(cè)單個(gè)原生生物分子和病毒，同時(shí)使用綠色和紅色的納米顆粒結(jié)合同一個(gè)靶位，在檢測(cè)的分子數(shù)目大于10時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)原生生物分子以及蛋白原生病毒的精確檢測(cè)，這為流式細(xì)胞儀中細(xì)胞的分類(lèi)、超靈敏分子檢測(cè)、活細(xì)胞中單分子示蹤和活細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像乃至恐怖襲擊中生化試劑的檢測(cè)提供基礎(chǔ)。

2.2 熒光量子點(diǎn)功能材料在生物細(xì)胞、生物組織標(biāo)記中的應(yīng)用

由于量子點(diǎn)的發(fā)光壽命較長(zhǎng)且具有較好的熒光穩(wěn)定性，因此熒光量子點(diǎn)功能材料在活細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的長(zhǎng)時(shí)間示蹤上表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，包括細(xì)胞的內(nèi)吞作用、細(xì)胞器的標(biāo)記、細(xì)胞骨架的標(biāo)記等方面。該材料被研究人員作為研究細(xì)胞成像的最有前途的新興熒光標(biāo)志物之一。

由于生物膜的天然屏障作用，熒光量子點(diǎn)需經(jīng)物理方法或者是化學(xué)修飾方能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，常見(jiàn)的連接方法包括化學(xué)方法和物理方法。其中，化學(xué)修飾方法包括生物素、穿膜肽和肽鏈上的氨基酸殘基等；物理方法包括微注射技術(shù)和細(xì)胞電穿孔技術(shù)等。

已有研究將熒光量子點(diǎn)功能材料用于活體腫瘤標(biāo)記，揭示癌細(xì)胞的產(chǎn)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程，為癌癥的早期診斷和病理研究提供了便利的條件。Wu等[8]在存活的固定乳腺癌細(xì)胞表面，用連接到免疫球蛋白G和鏈霉親和素的熒光量子來(lái)點(diǎn)染色細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白和胞質(zhì)內(nèi)的微管纖維，并檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的核抗原。通過(guò)在免疫球蛋白G和鏈霉親和素上連接不同的熒光量子點(diǎn)，就可以用同一個(gè)波長(zhǎng)的光來(lái)示蹤不同的細(xì)胞位點(diǎn)，進(jìn)而得出了熒光量子點(diǎn)功能材料可以有效進(jìn)行細(xì)胞成像的結(jié)論。因此，在多位點(diǎn)檢測(cè)上熒光量子點(diǎn)功能材料比傳統(tǒng)的染料優(yōu)勢(shì)明顯，這對(duì)于癌細(xì)胞的病理生理研究具有重大的意義和價(jià)值。

2.3 熒光量子點(diǎn)功能材料在生物體標(biāo)記中的應(yīng)用

在對(duì)內(nèi)部生物組織進(jìn)行標(biāo)記方面，熒光量子點(diǎn)功能材料也已有廣泛的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的熒光染料成像方法相比，熒光量子點(diǎn)功能材料在生物體活體成像上的用時(shí)更短，并且在穩(wěn)定性、靈敏度上也更勝一籌。相同的實(shí)驗(yàn)條件下，傳統(tǒng)的有機(jī)染料90%的熒光在1 min內(nèi)就會(huì)漂白，而熒光量子點(diǎn)材料的發(fā)光時(shí)間可達(dá)30 min以上，因此將熒光量子點(diǎn)材料制作成生物量探針，可以作為生物體內(nèi)一些疾病的病理和原位觀察生物分子相互作用的檢測(cè)、診斷和治療。

鄭少鸞等[9]用熱水法合成CDTeS量子點(diǎn)并將其與CK19抗體連接，采用直接熒光免疫法合成量子點(diǎn)CK19抗體探針并對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，該研究表明熒光量子點(diǎn)功能材料可以有效地在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞成像。袁潤(rùn)等[10]對(duì)于熒光量子點(diǎn)材料，采用一步法來(lái)標(biāo)記膀胱癌BUI-87細(xì)胞抗原，得出該法在活體靶向成像示蹤中具有廣闊的應(yīng)用前景。周敏等[11]使用量子點(diǎn)RGD標(biāo)記胰腺癌細(xì)胞，并結(jié)合靶向光動(dòng)力療法，可有效用于胰腺癌的早期治愈。張炎等[12]采用熒光量子點(diǎn)材料結(jié)合特異性抗體作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，可抑制癌細(xì)胞的增殖。

3 熒光量子點(diǎn)功能材料的發(fā)展趨勢(shì)

雖然熒光量子點(diǎn)功能材料已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是其在生物醫(yī)學(xué)研究中存在的問(wèn)題和需要改進(jìn)的方面如下。（1）目前熒光量子點(diǎn)的加工合成及修飾已經(jīng)日趨完善，但是還要在提高其穩(wěn)定性、提純效率、生物相容性及降低毒性、設(shè)計(jì)水溶性的量子點(diǎn)、特異性的結(jié)合生物大分子等方面做進(jìn)一步的改進(jìn)與研究。孫旭陽(yáng)等[13]總結(jié)了不同的熒光量子點(diǎn)探針在胃癌診療中的優(yōu)缺點(diǎn)，提出了熒光量子點(diǎn)合成探針應(yīng)該具有較低的生物毒性及較好的生物相容性的觀點(diǎn)，我們觀點(diǎn)與其相似。（2）盡管已經(jīng)研究出了很多熒光量子點(diǎn)功能材料的合成方法，但是仍需要進(jìn)一步探索基于各種不同應(yīng)用需求、應(yīng)用層次的高質(zhì)量熒光量子點(diǎn)的研制方法。杜晴晴等[14]總結(jié)出熒光量子點(diǎn)的生物合成方法，即采用真菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌等微生物合成量子點(diǎn)功能材料，這不僅提高了合成后標(biāo)的物的純度，也降低了生產(chǎn)成本。（3）熒光量子點(diǎn)修飾材料的穩(wěn)定性研究還需要進(jìn)一步加強(qiáng)，而且量子點(diǎn)表面難以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，因此有時(shí)會(huì)影響到利用熒光量子點(diǎn)功能材料所構(gòu)建的傳感器或者探針的生物特異性。（4）熒光量子點(diǎn)功能材料屬于不穩(wěn)定的納米材料分散體系，在離子強(qiáng)度較高的生物體環(huán)境中，會(huì)存在一些團(tuán)聚和非特異性吸附的問(wèn)題，如何克服這些問(wèn)題也是今后的研究重點(diǎn)。

雖然熒光量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用中仍存在一些不足之處，但隨著熒光量子點(diǎn)加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，其在探索細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間互相作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和聯(lián)系等方面均有廣闊的應(yīng)用前景。正如楊芳淼等[15]預(yù)測(cè)的，在未來(lái)會(huì)有越來(lái)越多的新型熒光量子點(diǎn)功能材料出現(xiàn)，并將極大地推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。