桑葚果酒發(fā)酵過程中功能性物質(zhì)的檢測及其變化情況

鈕成拓，李正學(xué)，范林旭，曲冠頤，王松濤，李令，李凱，張睿，鄭鵬飛，李崎,4*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)4(江南大學(xué)，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

桑葚色澤鮮艷，果肉酸甜多汁，同時(shí)具有烏發(fā)明目、補(bǔ)虛祛濕等功效，屬于藥食同源的食物[1]。然而，由于桑葚季節(jié)性較強(qiáng)，鮮果組織松散易腐爛，短時(shí)間內(nèi)集中上市，因此每年均會有大量桑葚腐爛變質(zhì)，造成資源浪費(fèi)[2]。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，桑葚被深加工成多種產(chǎn)品，如桑葚果酒、桑葚膏等[3-4]。然而，目前對桑葚自身的功能性物質(zhì)的研究仍然不充分，特別是對經(jīng)過深加工后的桑葚，所保留的功能性物質(zhì)的研究更少，值得進(jìn)一步研究。

桑葚果實(shí)中水分占80%～85%，糖占9%～10%，酸類物質(zhì)占1%～2%，粗蛋白占0.5%左右，粗纖維約占1%，剩余灰分占0.5%左右[5]。除去上述物質(zhì)外，桑葚果實(shí)還含有多種具有生物活性的功能性物質(zhì)，例如花色苷和多酚類物質(zhì)等[6]。桑葚是花色苷含量較高的漿果之一(150～250 mg/100g)，其成熟果肉內(nèi)的主要花色苷為矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香糖苷。花色苷不僅是桑葚中主要的色素物質(zhì)，更是一種重要的抗氧化物質(zhì)，具有較強(qiáng)的清除自由基的能力[7]?；ㄉ諏θ梭w心血管起保護(hù)作用，能清除心血管中有害物質(zhì)。此外，花色苷還具有降血糖、護(hù)肝臟、抗癌和刺激視紫紅質(zhì)再生等功能[8]。桑葚中還含有大量多酚類物質(zhì)，主要有黃酮類物質(zhì)和酚酸類物質(zhì)[9]，兩者同樣具有清除自由基，提升人體活力的功能。若在桑葚深加工過程中能夠保留這些功能性物質(zhì)，將大幅提高桑葚產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)提高產(chǎn)品市場價(jià)值。

筆者前期根據(jù)桑葚特點(diǎn)，通過三級篩選方法得到1株適用于桑葚果汁發(fā)酵的果酒酵母，并對發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，釀制了一種風(fēng)味優(yōu)良的桑葚果酒[10]。為了評價(jià)該桑葚深加工方法對桑葚功能性物質(zhì)的保留程度，本研究優(yōu)化了準(zhǔn)確檢測桑葚果酒中花色苷含量的方法，并確定了桑葚花色苷單體種類，在此基礎(chǔ)上比較了該方法測得的桑葚果酒與市售桑葚果酒功能性物質(zhì)及抗氧化能力的差別，最后對桑葚果酒發(fā)酵過程中的功能性成分及抗氧化能力進(jìn)行了跟蹤分析。

1 材料和方法

1.1 材料、菌株及發(fā)酵條件

桑葚果汁由企業(yè)提供。果酒酵母JNB-14，由實(shí)驗(yàn)室自主篩選獲得，保藏于實(shí)驗(yàn)室。白糖為市售。矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、蘆丁和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(色譜純，純度≥98%)，購自Sigma-Aldrich公司。其余化學(xué)藥品均為分析純，購自國藥公司。

采用YPD培養(yǎng)基活化篩選得到適用于桑葚果汁發(fā)酵的果酒酵母JNB-14，活化后桑葚果酒的發(fā)酵按照優(yōu)化工藝進(jìn)行，具體條件如下：用蔗糖將桑葚汁含糖量補(bǔ)充至240 g/L，接入活化好的酵母菌株1×107個(gè)/mL，發(fā)酵溫度設(shè)置為24 ℃，SO2添加量為40 mg/L，厭氧靜置發(fā)酵10 d。

1.2 總花色苷含量測定方法優(yōu)化

桑葚果汁和果酒中總花色苷含量測定方法采用pH值示差法。為了獲得果汁和果酒中精確的總花色苷含量，本研究對花色苷吸收波長、檢測pH值、平衡時(shí)間和平衡溫度進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用400～800 nm紫外可見光對樣品進(jìn)行全波長掃描，確定花色苷吸收峰對應(yīng)波長。然后取2 mL適當(dāng)稀釋的樣品與8 mL不同pH緩沖液(pH 0.5～2.0，檸檬酸-HCl緩沖液；pH 2.5～6.5，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)混合均勻，于20 ℃靜置90 min后以蒸餾水為空白，測定OD514值，取吸光度值變化較小pH值為最適pH值。針對較優(yōu)平衡時(shí)間和平衡溫度，取部分適當(dāng)稀釋的桑葚果酒樣品與最適pH緩沖液混合后，分別置于20、30和40 ℃水浴中溫浴，每隔10 min取樣測定OD514值。以吸光度值穩(wěn)定所需時(shí)間為平衡所需時(shí)間。取平衡時(shí)間較短的溫度為最適平衡溫度，對應(yīng)的時(shí)間為最適平衡時(shí)間。桑葚果酒中總花色苷含量按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：ρ，桑葚果酒中總花色苷含量，mg/L；ΔA，(OD514-OD710)pH1.0-(OD514-OD710)pH4.5；n，樣品稀釋倍數(shù)；M，矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2；ε，矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，26 900；1，比色杯光程距離，cm。

1.3 花色苷單體種類分析

采用HPLC法分別對花色苷的種類及其單體含量進(jìn)行分析。分析條件如下：花色苷單體分離采用的色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱(4.6 mm×250 mm)；檢測器為Waters W2998紫外檢測器，波長為200～700 nm；流動相A：體積分?jǐn)?shù)2%的甲酸溶液；流動相B：乙腈(色譜純)；洗脫方法采用梯度洗脫，流速為0.3 mL/min?；ㄉ諉误w的鑒定采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Waters MALDI QTOF MS系統(tǒng)。質(zhì)譜分析采用的離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；質(zhì)量范圍m/z200～800；光電倍增器電壓700 V；氣體體積流量為4.2 L/h；錐孔電壓為30 V；Analyser Vacuum 2.6 e-5。

1.4 多酚類物質(zhì)含量測定

多酚類物質(zhì)主要包含黃酮和酚酸兩類。總黃酮含量測定采用NaNO2-AlCl3法，具體方法如下：采用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇配制200 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，并分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管，依次分別加入400 μL 50 g/L NaNO2溶液和400 μL 100 g/L AlCl3溶液后靜置6 min。最后加入4 mL體積分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液，并用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液定容至25 mL，靜置15 min后測定OD509值。以蘆丁濃度為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1-a所示)。樣品測定時(shí)取1 mL樣品參與上述反應(yīng)，測定OD509值并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品內(nèi)總黃酮含量。酚酸含量的測定采用福林-肖卡試劑法，具體方法如下：采用蒸餾水配制100 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 mL溶液至比色管。先后加入3 mL福林酚溶液和6 mL 120 g/L Na2CO3溶液后采用蒸餾水定容至25 mL。避光保存2 h后測定OD765值。以沒食子酸濃度為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1-b所示)。樣品測定時(shí)取1 mL樣品參與上述反應(yīng)，測定OD765值并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑葚果汁和果酒中的酚酸含量。

圖1 蘆丁(a)和沒食子酸(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.1 Standard curves of rutin (a) and gallic acid (b)

1.5 抗氧化能力測定

本文以DPPH清除率為指標(biāo)表征桑葚果汁和果酒的抗氧化能力。DPPH清除率采用分光光度計(jì)法，具體方法如下：采用無水乙醇配制0.507 2 mmol/L DPPH自由基醇溶液后，取5 mL DPPH自由基醇溶液與5 mL樣品溶液混合，避光反應(yīng)30 min測定其OD517值。DPPH清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A0，DPPH溶液與無水乙醇混合后測定的OD517值；Ai，DPPH溶液與稀釋后樣品反應(yīng)測得OD517值；Aj，無水乙醇與稀釋后樣品混合反應(yīng)后測得OD517值。

2 結(jié)果和討論

2.1 pH值示差法優(yōu)化及桑葚果酒中總花色苷含量測定

通常采用pH值示差法測定總花色苷含量，然而針對不同環(huán)境中總花色苷含量的測定方法，其參數(shù)需要進(jìn)行優(yōu)化。本文對pH值示差法中花色苷吸收波長、測定pH值、平衡時(shí)間和平衡溫度進(jìn)行了優(yōu)化。從圖2-a中可以看出，桑葚果酒中花色苷在514 nm處存在吸收峰差，因此后續(xù)使用514 nm作為掃描波長。pH值是測定花色苷含量方法中的重要影響因素，從圖2-b可以看出，桑葚果酒花色苷在pH 0.5～1.5和pH 4.5～6.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，兩者之間吸光度值差異較大，因此選擇pH 1.0和pH 4.5作為桑葚果酒花色苷測定最適pH值。之后，對2種pH值環(huán)境下不同平衡時(shí)間和平衡溫度對桑葚果酒花色苷含量測定的影響。從圖2-c可以看出，在pH 1.0緩沖體系下，吸光度值在20、30和40 ℃隨時(shí)間延長逐漸提高。在20和30 ℃時(shí)吸光度值在溫浴90 min時(shí)即趨于平衡，而40 ℃時(shí)吸光度值平衡需要100 min。圖2-d為桑葚果酒花色苷在pH 4.5環(huán)境下吸光度值的變化情況。在20 ℃時(shí)吸光度值平衡所需時(shí)間約為90 min，而在30和40 ℃時(shí)在溫浴100 min后吸光度值才趨于平衡。因此，選取20 ℃為最優(yōu)平衡時(shí)間，在該條件下平衡時(shí)間為90 min。

a-全波長掃描；b-pH值對花色苷含量測定的影響；c-pH 1.0時(shí)平衡時(shí)間和平衡溫度對花色苷含量測定的影響；d-pH 4.5時(shí)平衡時(shí)間和平衡溫度對花色苷含量測定的影響圖2 pH值示差法優(yōu)化過程Fig.2 Optimization of pH differential method for measuring the content of total anthocyanin

分別取1份適當(dāng)稀釋的桑葚果酒和1份桑葚果汁樣品，采用優(yōu)化pH值示差法分別測定其總花色苷含量，并對其結(jié)果和精密度進(jìn)行分析。從表1可以看出，桑葚果酒樣品，5次測定的總花色苷含量分別為75.56、75.98、75.98、75.14和74.31 mg/L，平均值為75.40 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)值為0.93%。桑葚果汁樣品5次測定的總花色苷含量分別為98.52、98.10、97.69、97.69和98.10 mg/L，其平均值和RSD值分別為98.02 mg/L和0.35%。上述結(jié)果說明，采用優(yōu)化的pH值示差法測定桑葚果酒和桑葚果汁總花色苷含量，具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 優(yōu)化pH值示差法測定桑葚果酒和桑葚果汁中總花色苷含量的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision test of the optimized pH differentialmethod in determining the anthocyanin content in mulberrywine and mulberry juice

為了進(jìn)一步考察優(yōu)化pH值示差法測定桑葚果酒和桑葚果汁中總花色苷含量的回收率，本文通過在桑葚果酒和桑葚果汁樣品中外源添加矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，并采用優(yōu)化pH值示差法測定添加外源矢車菊素-3-葡萄糖苷桑葚果酒和桑葚果汁樣品的總花色苷含量。從表2可以看出，桑葚果酒樣品花色苷含量為75.14 mg/L，而外源添加的矢車菊素-3-葡萄糖苷為5 mg/L，樣品中總花色苷含量應(yīng)為80.14 mg/L。

采用優(yōu)化pH值示差法測得的樣品總花色苷含量分別為79.98、80.25和80.01 mg/L，其與標(biāo)準(zhǔn)溶液花色苷含量(80.14 mg/L)相比回收率分別為96.8%、102.2%和97.4%，RSD值為3%。

表2 優(yōu)化pH值示差法在桑葚果酒和桑葚果汁花色苷含量測定過程中的回收率分析結(jié)果Table 2 Recovery test of the optimized pH differential method in mulberry wine and mulberry juice

桑葚果汁中花色苷含量為97.69 mg/L，而外源添加的矢車菊素-3-葡萄糖苷為10 mg/L，樣品中總花色苷含量應(yīng)為107.69 mg/L。采用優(yōu)化pH值示差法測得的桑葚果汁樣品總花色苷含量分別為107.31、108.02和107.15 mg/L，回收率分別為99.6%、100.3%和99.5%，RSD值為0.44%。上述結(jié)果說明，優(yōu)化pH值示差法測定桑葚果酒具有良好的回收率。

2.2 桑葚花色苷單體種類分析

為了分析桑葚果汁和果酒中花色苷的種類，采用液相色譜法對桑葚果酒中的花色苷單體進(jìn)行分離。從圖3可以看出，在桑葚果汁中存在2個(gè)較高的峰，峰1和峰2代表2種不同的花色苷單體。在桑葚果酒中，依舊存在2個(gè)峰，其中峰1峰面積有大幅減少，而峰2峰面積則幾乎相同。以此推斷桑葚果汁和果酒中均存在2種花色苷單體。

圖3 桑葚汁(a)和桑葚果酒(b)中花色苷520 nm
LC分析
Fig.3 LC analysis of anthocyanins in mulberry juice
(a) and mulberry wine (b)

為了鑒定2種花色苷單體的結(jié)構(gòu)，采用液質(zhì)聯(lián)用法對桑葚果酒和果汁中的峰1和峰2進(jìn)行了分析。從圖4可以看出，桑葚果汁和果酒中峰1的母離子質(zhì)量均為m/z287，總分子離子質(zhì)量為m/z449，在516 nm處有最大吸收峰，進(jìn)一步分析花青素與糖苷的斷裂位置并參考矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖譜，推斷桑葚果汁和果酒液相色譜圖中峰1對應(yīng)的均為矢車菊素-3-葡萄糖苷。對桑葚果汁和果酒液相色譜圖峰2進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其母離子質(zhì)量和分子離子質(zhì)量分別為m/z287和595，其最大吸收峰對應(yīng)波長為517 nm，分析花青素與糖苷斷裂位置并參照矢車菊素-3-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖譜，確定該物質(zhì)為矢車菊素-3-蕓香糖苷。

a-圖3-a中峰1；b-圖3-b中峰1；c-圖3-a中峰2;d-圖3-b中峰2圖4 桑葚花色苷單體質(zhì)譜分析圖Fig.4 MS analysis of anthocyanin monomers

2.3 釀造桑葚果酒與市售果酒功能性物質(zhì)含量及抗氧化能力分析

實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步測定了研究室釀造桑葚果汁和桑葚酒與市售葡萄酒和其他桑葚果酒的功能性物質(zhì)含量和抗氧化能力。從表3可以看出，花色苷含量和總酚含量與DPPH清除率存在正相關(guān)關(guān)系，花色苷含量和總酚含量越高，DPPH清除率越高。桑葚果汁中花色苷含量和總酚含量分別為198.72 mg/L和1 638.15 mg/L，其DPPH清除率為51.07%。

表3 桑葚汁、桑葚酒及市售葡萄酒和桑葚酒花色苷、總酚含量及DPPH清除率分析Table 3 Contents of anthocyanin and total phenolicand DPPH scavenging capacity of mulberry juice, mulberrywine and commercial grape and mulberry wines

將桑葚果酒和其他市售葡萄酒、桑葚酒的酒精度統(tǒng)一調(diào)整為約11%，發(fā)現(xiàn)桑葚果酒的花色苷含量和總酚含量分別為75.40 mg/L和1 265.60 mg/L，DPPH清除率為44.08%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，葡萄酒具有較高花色苷和總酚含量。本研究發(fā)現(xiàn)，酒精度為11%的葡萄酒其花色苷和總酚含量分別為60.62 mg/L和1 139.11 mg/L，而其DPPH清除率為40.19%。對市售桑葚果酒樣品中功能性物質(zhì)含量和抗氧化能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4種市售桑葚果酒的花色苷含量和總酚含量范圍分別在10.52～38.21 mg/L和338.37～787.83 mg/L，而其DPPH清除率為18.42%～27.33%。上述結(jié)果說明研究室釀造的桑葚果酒其功能性物質(zhì)含量和抗氧化能力優(yōu)于葡萄酒和市售桑葚果酒。

2.4 桑葚果酒釀造過程中功能性物質(zhì)含量變化情況分析

為了分析桑葚果酒發(fā)酵過程中功能性物質(zhì)及抗氧化能力的變化情況，對桑葚果酒的發(fā)酵過程和儲存過程進(jìn)行監(jiān)控，其中發(fā)酵期間每天取樣，而儲存期間每隔30 d取樣分析。從圖5可以看出，在桑葚果酒發(fā)酵過程中，花色苷含量和多酚(黃酮和總酚)含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長均有一定程度的下降。從開始發(fā)酵到發(fā)酵第4天，花色苷含量從198.72 mg/L迅速降低至75 mg/L左右，并在剩余發(fā)酵時(shí)間和儲存期內(nèi)穩(wěn)定存在。

圖5 桑葚果酒釀造過程中功能性物質(zhì)含量和抗氧化
能力變化情況分析
Fig.5 Changes of functional component contents and
anti-oxidant abilities in mulberry wine fermentation

黃酮和總酚含量從發(fā)酵開始即緩慢下降，含量分別從2 484.53 mg/L和1 638.15 mg/L降低至約1 622.15 mg/L和1 265.60 mg/L。在桑葚果酒儲藏期內(nèi)，兩者含量幾乎不變。DPPH清除率在發(fā)酵期間緩慢下降，從51.07%下降至44.08%。在儲藏期內(nèi)DPPH清除率維持在約44%。從上述結(jié)果可以看出，研究室釀造桑葚果酒在發(fā)酵過程中，功能性物質(zhì)如花色苷、黃酮和多酚，含量以及其抗氧化能力均有一定程度的下降，但是在桑葚果酒保藏期內(nèi)功能性物質(zhì)含量和抗氧化能力均沒有變化。這說明桑葚果酒的功能性物質(zhì)和抗氧化能力能夠穩(wěn)定存在。

3 結(jié)論

本文對研究室釀造的桑葚果酒發(fā)酵過程中的功能性物質(zhì)和抗氧化能力進(jìn)行了測定和動態(tài)變化研究。優(yōu)化的pH值示差法可以準(zhǔn)確測定桑葚總花色苷含量，并通過LC-MS確定了桑葚果酒中主要有2種花色苷單體。對釀造桑葚果酒和市售果酒進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)釀造桑葚果酒的功能物質(zhì)含量和抗氧化能力遠(yuǎn)優(yōu)于市售果酒。在桑葚果酒發(fā)酵過程中，功能性物質(zhì)和抗氧化能力有一定的下降，但是在桑葚果酒儲藏期內(nèi)可以穩(wěn)定存在。