丁苯酞對糖尿病大鼠認知功能及PKA-CREB通路的影響

冀俊林 周玉蘭

(東麗醫(yī)院 1急診內(nèi)科，天津 300300；2神經(jīng)內(nèi)科)

糖尿病已經(jīng)被建議成為癡呆的危險因素，獨立于其他已經(jīng)確立的危險因素如動脈粥樣硬化和高血壓〔1,2〕。據(jù)估計，2型糖尿病患者與無糖尿病人群相比，認知功能障礙的危險增加1.5倍，癡呆風(fēng)險增加1.6倍〔3〕。2型糖尿病和老年癡呆癥的發(fā)病率會隨著人口老齡化而逐漸增加〔4〕。丁苯酞是治療缺血性腦卒中的有效藥物〔5〕，它能有效抑制血小板聚集，減少缺血導(dǎo)致的氧化損應(yīng)激傷，調(diào)節(jié)能量代謝，改善微循環(huán)，減少腦梗死的范圍〔6～8〕。研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞治療可以改善快速老化小鼠和慢性腦灌注不足導(dǎo)致的認知功能障礙〔9,10〕。本實驗應(yīng)用丁苯酞治療鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的認知功能障礙，觀察其療效，并探討其可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 2月齡健康清潔級SD大鼠34只，體重200～230 g，由天津市實驗動物中心提供。每籠飼養(yǎng)2～3只大鼠，動物房采用12 h白天/黑夜循環(huán)(8 am/8 pm)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，動物均可自由獲取食物和水。實驗程序均遵循神經(jīng)科學(xué)研究關(guān)于哺乳動物的照料與使用規(guī)定。

Morris水迷宮(MWM，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所)，丁苯酞(石家莊恩必普公司)，STZ、β-actin抗體、蛋白激酶(PK)A、磷酸化(p)-環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)抗體(Abcam公司)。

1.2模型制作及藥物治療 STZ溶解于檸檬酸鹽緩沖劑(pH4.5)，24只大鼠進行STZ(60 mg/kg) 右下腹腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。注射后72 h采集尾靜脈血液，羅氏血糖儀檢測血糖水平，血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病模型制作成功，共24只。對照組大鼠(10只)給予等體積檸檬酸鹽緩沖劑。造模成功后糖尿病鼠分為模型組和治療組，每組12只。丁苯酞溶解于植物油，治療組給予劑量為100 mg/(kg·d)的丁苯酞灌胃治療，7 d/w，連續(xù)6 w。模型組及對照組大鼠每日給予等體積的植物油灌胃。

1.3MWM 治療結(jié)束后的第2天大鼠均通過MWM測試其空間相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能(每天早晨9∶00準時開始，同1個實驗人員操作，保持環(huán)境安靜，調(diào)節(jié)好燈光，盡量避免實驗的干擾因素)。MWM設(shè)備是一高度0.6 m、直徑2 m的無蓋金屬圓桶，桶壁內(nèi)側(cè)為黑色。每次實驗時桶內(nèi)裝水，水面高度為45 cm，并用黑色食品色素混勻，水溫保持在(22±1)℃。將MWM人為分為4個象限，訓(xùn)練時將平臺放置于第4象限正中(SW方向)，平臺直徑為12 cm，平臺表面位于水面下2 cm。水迷宮測試分為定位航行實驗和空間探索實驗，定位航行實驗連續(xù)5 d，每只大鼠每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔60 min，每次從不同方向面向圓筒池壁入水。每只大鼠給予120 s時間尋找平臺，記錄大鼠從入水至四肢均爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，由實驗者引導(dǎo)其找到平臺(不能直接放在平臺上)，并使大鼠在平臺上停留20 s。每次訓(xùn)練之間休息30 min。第6天為空間探索實驗，撤去平臺，使大鼠從NE方向面向圓筒池壁入水，并記錄大鼠進入原平臺所在位置的次數(shù)(穿越平臺次數(shù))。水迷宮圓筒正上方放置攝像裝置，并連接動物追蹤系統(tǒng)監(jiān)測、傳遞并記錄圖像軌跡和實驗數(shù)據(jù)。本實驗主要記錄逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)。

1.4血糖測定 實驗開始時及行為學(xué)結(jié)束后使用血糖儀測量各組大鼠尾靜脈血糖。

1.5Western印跡檢測海馬PKA、p-CREB 和BDNF表達 MWM實驗后，斷頭處死實驗動物，迅速分離腦組織，取海馬組織凍存。樣本使用裂解液混勻， 勻漿使用離心機離心后取上清液儲存于-80℃?zhèn)溆?。等量的蛋白質(zhì)被12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離并通過轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶37℃ 封閉1 h，加入一抗：兔抗PKA(1∶1 000)、p-CREB(1∶2 000)和BDNF抗體(1∶2 000)、兔抗β-actin抗體(1∶2 000)后4℃孵化過夜。清洗幾次后加入過氧化物酶標記的二抗孵化。條帶檢測分析使用 ChemiDoc XRS 系統(tǒng)和凝膠成像分析系統(tǒng)(Quantity one)。所有條帶的光密度值(OD值)均為與β-actin的相對值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件進行重復(fù)測量方差分析、LSD檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)結(jié)果 與對照組相比，模型組及治療組逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)，跨越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)；治療組與模型組比較，逃避潛伏期顯著減少，跨越平臺次數(shù)顯著增多(P<0.05)。見表1。

2.2各組血糖水平比較 治療前各組血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后與對照組相比，模型組血糖水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組血糖顯著下降(P<0.05)；治療后治療組血糖水平仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較

與對照組相比：1)P<0.05，與模型組相比：2)P<0.05；下表同

表2 治療前后各組血糖水平比較

2.3各組PKA、p-CREB、BDNF蛋白表達比較 與對照組相比，模型組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達明顯下降(P<0.05)；治療組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達明顯高于模型組(P<0.05)；但治療組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達仍低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 各組PKA、p-CREB 和BDNF蛋白含量比較

圖1 各組大鼠海馬PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達

3 討 論

流行病學(xué)研究表明，2型糖尿病患者認知障礙和癡呆的風(fēng)險顯著高于血糖正常的人群〔11，12〕。本實驗結(jié)果同樣表明糖尿病大鼠出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)和記憶能力的明顯下降。

糖尿病相關(guān)認知功能下降的機制尚未完全闡明，基于糖尿病可能影響癡呆的病理發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)病理生理機制已經(jīng)提出許多假說，包括：血腦屏障的破壞、神經(jīng)再生受損，高血糖和低血糖，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，血循環(huán)障礙，胰島素信號通路的改變等〔13～15〕。丁苯酞作為治療缺血性腦卒中有效藥物，其作用機制包括：抑制炎癥反應(yīng)、抗血小板聚集、減少神經(jīng)元的凋亡、減少氧化應(yīng)激損傷〔16～18〕。丁苯酞可能是糖尿病大鼠認知功能障礙的有效藥物。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)過6 w的丁苯酞治療，糖尿病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。慢性高血糖會對腦結(jié)構(gòu)和認知功能產(chǎn)生負面影響〔19〕，有研究報道，有效的血糖控制有益于認知功能的改善〔20〕。高血糖導(dǎo)致的認知損傷與活性氧(ROS)的增多和抗氧化水平的下降密切相關(guān)，而使用抗氧化劑可以改善糖尿病大鼠認知障礙。丁苯酞治療后糖尿病大鼠的血糖水平下降，這可能是丁苯酞發(fā)揮治療作用的機制之一。

糖尿病會導(dǎo)致突觸可塑性的損害，促進神經(jīng)元凋亡〔21,22〕。研究表明，PKA-CREB信號通路與哺乳動物學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)〔23〕。環(huán)腺苷酸(cAMP)是一個普遍存在的二級信使，它與海馬突觸的可塑性和記憶密切相關(guān)，胞質(zhì)cAMP增多促進PKA的活動，PKA隨后磷酸化并激活了CREB，CREB激活后與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件(CRE)結(jié)合，隨后調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄〔24〕，如BDNF。CREB的活性對于維持神經(jīng)功能是至關(guān)重要的，其可以調(diào)節(jié)突觸可塑性、長期記憶的形成和神經(jīng)元存活〔25〕。BDNF是一種在神經(jīng)元生長、存活的調(diào)節(jié)過程中起重要作用的神經(jīng)生長因子，它的表達增多能提高海馬的神經(jīng)可塑性，改善學(xué)習(xí)和記憶能力，減少神經(jīng)元凋亡〔26,27〕。本實驗中，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠海馬區(qū)PKA、p-CREB 和BDNF的蛋白表達下降，應(yīng)用丁苯酞治療后PKA、p-CREB 和BDNF的蛋白水平明顯上調(diào)。推斷丁苯酞改善糖尿病大鼠認知功能的另一機制可能是通過激活糖尿病大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號通路，從而上調(diào)BDNF的表達，影響了海馬突觸可塑性并減少了糖尿病鼠的神經(jīng)元凋亡。

綜上，丁苯酞能夠明顯改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的認知功能下降，提高糖尿病大鼠海馬PKA、p-CREB 和BDNF蛋白表達，其改善糖尿病大鼠認知功能的機制可能與丁苯酞治療后糖尿病大鼠血糖的降低和海馬PKA-CREB信號通路的激活密切相關(guān)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)盡管丁苯酞治療提高了糖尿病大鼠認知功能，降低了糖尿病大鼠血糖水平并提高了PKA、p-CREB 和BDNF蛋白水平的表達，但仍未達到正常水平，說明了本實驗中丁苯酞治療方案的局限性。在今后的研究中會應(yīng)用不同濃度的給藥方案或延長治療時間，乃至聯(lián)合用藥方案來觀察丁苯酞的療效。