非小細(xì)胞肺癌患者癌胚抗原和細(xì)胞角蛋白與表皮生長因子基因突變的關(guān)系及靶向治療的預(yù)測價值

王洪閣

(濱州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，山東 濱州 256600)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的85%以上〔1〕，手術(shù)和化療是主要治療方案，但80%的NSCLC確診時已處于中晚期，失去手術(shù)機會，一線化療患者生存期僅為7～10個月〔2〕。靶向治療是NSCLC治療的趨勢，其中表皮生長因子基因突變的患者對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物敏感性較好；但由于癌組織獲取困難或標(biāo)本量過少等原因，導(dǎo)致表皮生長因子基因檢測難以推廣，研究顯示，我國僅9%的NSCLC患者進(jìn)行了該基因突變檢測〔3〕。而癌胚抗原(CEA)和細(xì)胞角蛋白(Cyfra)21-1是最常見的肺癌腫瘤標(biāo)志物，標(biāo)本易獲得。本研究旨在探討CEA和Cyfra21-1濃度與表皮生長因子基因突變的關(guān)系及對靶向治療效果的預(yù)測價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2015年3月至2016年6月NSCLC患者72例，為排除吸煙對CEA的影響，均選擇非吸煙患者，其中男28例，女44例，年齡54～80〔平均(67.15±12.82)〕歲，均為臨床Ⅲ～Ⅳ期，腺癌67例，鱗癌5例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者知情同意。

1.2主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒、人表皮生長因子基因突變檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒均購于廣州健侖生物科技有限公司；小鼠抗人p-AKT、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)、磷酸化細(xì)胞信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(p-STAT)3單克隆抗體和鼠源性β-actin單克隆抗體均購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。美國Bio-Rad T100型梯度PCR儀；美國ABI 7500熒光定量PCR儀；羅氏E170自動電化學(xué)發(fā)光儀。

1.3DNA提取與測序 標(biāo)本要求：新鮮冰凍組織2～3 g；石蠟包埋標(biāo)本5～8 μm厚切片3張以上；外周血、胸水標(biāo)本，需血漿、胸水上清800 μl以上。使用石蠟組織DNA提取試劑盒獲得石蠟包埋標(biāo)本DNA；新鮮組織DNA提取試劑盒獲得冷凍組織和體液標(biāo)本DNA。上述標(biāo)本均經(jīng)病理確定為NSCLC，按試劑盒說明操作。分光光度法測定提取DNA的濃度，將合格標(biāo)本冷凍保存待用。巢氏PCR法擴增標(biāo)本DNA，依次擴增表皮生長因子受體第18～21外顯子。總反應(yīng)體系30 μl，擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定擴增結(jié)果，之后上測序儀，測序結(jié)果與Genbank上序列比對。

1.4環(huán)探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS) 使用熒光PCR法對標(biāo)本行21種人類表皮生長因子受體基因突變檢測。對應(yīng)不同擴增體系預(yù)裝于8聯(lián)PCR反應(yīng)管中：35.5 μl待測DNA(石蠟標(biāo)本DNA濃度3～4 ng/μl，新鮮組織DNA濃度0.5～0.8 ng/μl)與4.5 μl Taq酶混合后，取其中5 μl分別加入8聯(lián)PCR反應(yīng)管。陽性和陰性對照同時擴增。擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 20 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)，判斷突變結(jié)果。

1.5Western印跡檢測表皮生長因子基因下游信號分子 RIPA試劑盒分別提取表皮生長因子基因突變和未突變標(biāo)本中的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，分別滴加小鼠抗人p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3一抗(1∶200稀釋)，鼠源性β-actin單抗(1∶500)為內(nèi)參，4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，孵育4 h，ECL顯色，采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.6外周血CEA、Cyfra21-1檢測和靶向治療評價 治療前抽取患者晨起空腹外周血3 ml，離心分離血清，使用電化學(xué)發(fā)光儀和配套試劑盒檢測CEA和Cyfra21-1濃度。正常范圍：CEA<5.0 μg/L，Cyfra21-1<3.3 μg/L。根據(jù)人類表皮生長因子受體基因突變檢測結(jié)果與患者意愿，共32例接受口服吉非替尼，250 mg/d靶向治療。其中男9例，女23例；CEA正常組14例，升高組18例；Cyfra21-1正常組16例，升高組16例；CEA升高和Cyfra21-1正常14例，CEA升高和Cyfra21-1升高或CEA正常和Cyfra21-1正常8例，CEA正常和Cyfra21-1升高10例；表皮生長因子受體突變直接測序陽性24例，ARMS陽性29例。以無進(jìn)展生存期判斷療效，定義為開始治療到病情進(jìn)展的時間。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件，計量資料行t檢驗；計數(shù)資料行χ2檢驗；相關(guān)性生存分析使用Kaplan-Meier法，并進(jìn)行Cox回歸模型多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1表皮生長因子受體基因突變與腫瘤標(biāo)志物水平 表皮生長因子受體基因總突變率為62.50%(45/72)。男性基因突變率〔60.71%(17/28)〕與女性〔(63.64%(28/44)〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.012,P=0.115)。CEA升高組〔84.21%(32/38)〕明顯高于CEA正常組〔38.24%(13/34)，χ2=11.381,P=0.001〕；Cyfra21-1升高組與正常組〔64.00%(16/25)、61.70%(29/47)〕差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.957,P=0.092)。

2.2表皮生長因子基因下游信號分子表達(dá)情況 表皮生長因子基因突變組下游信號分子p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量分別為7.84±0.62、5.03±0.47、9.41±0.82，明顯高于基因未突變組的3.10±0.25、1.94±0.17、4.96±0.47(P<0.05)。見圖1。

圖1 表皮生長因子基因下游信號分子蛋白Western印跡電泳條帶

2.3不同類型患者靶向治療效果分析 男性靶向治療的無進(jìn)展生存期(7.9個月)與女性(8.2個月)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.452,P=0.551);CEA升高組(11.2個月)與CEA水平正常組(7.4個月)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.379,P=0.082)；Cyfra21-1升高組(7.9個月)明顯短于Cyfra21-1正常組(2.3個月；χ2=9.814,P=0.005)；CEA與Cyfra21-1聯(lián)合檢測顯示，CEA升高和Cyfra21-1正常組(10.6個月)與CEA升高、Cyfra21-1升高或CEA正常、Cyfra21-1正常(11.9個月)、CEA正常和Cyfra21-1升高者(6.8個月)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.899,P=0.013)；直接測序法和ARMS法檢測的表皮生長因子受體基因突變患者無進(jìn)展生存期(12.6、9.8個月)均明顯長于無基因突變患者(8.1、2.2個月；χ2=8.343、17.482,P=0.007、0.000)。

2.4靶向治療效果的預(yù)測分析 Cox回歸模型多因素分析顯示，治療前Cyfra21-1水平和表皮生長因子受體突變情況是NSCLC患者靶向治療無進(jìn)展生存期的獨立影響因素。見表1。

表1 NSCLC患者各因素和無進(jìn)展生存期的Cox回歸分析

3 討 論

最新版美國NCCN指南中首次提出，對晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性NSCLC應(yīng)進(jìn)行表皮生長因子受體基因突變檢查，對存在突變的患者推薦TKI治療〔2〕。ARMS法檢測敏感度高，直接測序法敏感度低，陽性結(jié)果需突變細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的20%以上〔4〕。CEA存在于癌組織中的黏蛋白，為最常見的腫瘤標(biāo)志物之一。研究發(fā)現(xiàn)，40%～80%的NSCLC能夠檢測出CEA濃度增加，持續(xù)性增加常見于進(jìn)展期〔5〕。但CEA濃度與表皮生長因子受體基因突變的相關(guān)性的研究較少，且無定論。本研究提示CEA水平與表皮生長因子受體基因突變存在關(guān)聯(lián)。而且表皮生長因子基因突變會引發(fā)其下游信號分子過度激活，提升抗凋亡作用，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而提升CEA蛋白表達(dá)。腫瘤標(biāo)志物是目前早期診斷癌癥和監(jiān)測療效的主要指標(biāo)，隨著靶向治療的推廣，發(fā)現(xiàn)部分腫瘤標(biāo)志物含量改變可預(yù)測其療效。本研究結(jié)果提示雖然Cyfra21-1濃度無法預(yù)測表皮生長因子受體基因突變，但可作為NSCLC靶向治療的預(yù)后指標(biāo)。相關(guān)研究顯示，CEA可與C-Myc、BCL-2聯(lián)合發(fā)揮抑癌細(xì)胞凋亡的作用，傳統(tǒng)化療NSCLC血清CEA濃度增加預(yù)后較差〔6〕；但因CEA與表皮生長因子受體基因突變的相關(guān)性，對靶向治療患者，CEA濃度升高預(yù)后較好。