芪芍顆粒對乙酸誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究

王曉巖 ，王丹妮 ，洪 鐵 ，*

(1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130012；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長春130021；）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種臨床常見的病因尚不十分明確的結(jié)腸和直腸非特異性炎癥性疾病，以下腹痛、便意頻繁、里急后重、粘液膿血便、肛門及直腸墜脹不適感為主要臨床癥狀。因其病因尚不完全明確，目前尚缺乏有效的治療方法，WHO將其列為現(xiàn)代難治病之一[1]。芪芍顆粒是吉林省中醫(yī)科學(xué)院臨床專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，在長期臨床實(shí)踐中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。全方由黃芪、白芍、馬齒莧、敗醬草、防風(fēng)等多味中藥組成。主要功能為補(bǔ)清并舉，補(bǔ)氣健脾，清熱燥濕，可使患者濕熱得解，氣機(jī)通暢。芪芍顆粒在多年臨床治療慢性腸炎及潰瘍性結(jié)腸炎方面取得了較好的療效。本研究探討芪芍顆粒對乙酸誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響，為芪芍顆粒治療潰瘍性結(jié)腸炎提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c雄性小鼠，體重為18～22g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（遼）2015-0001。將小鼠于SPF級動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度為20～25℃，濕度為60%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙酸（冰醋酸）由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；柳氮磺吡啶腸溶片由上海福達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）測試盒均由南京建成生物工程研究所提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）碧云天生物技術(shù)研究所提供；小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA Kit、小鼠腫瘤壞死因子 α (TNF-α)ELISA KIT由武漢默沙克生物科技有限公司提供。

1.3 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；S-124S電子天平，德國塞多利斯股份公司；TGL-16B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HPX-9052MBE電熱恒溫箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；F6/10超細(xì)勻漿機(jī)，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司。LEICA020-518.500CM/LS顯微鏡，德國LEICA公司；OLYMPUSXOO74-1生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

取BALB/c小鼠48只，按體重隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白對照組、UC模型組、陽性藥對照組（柳氮磺胺吡啶300 mg/kg）、芪芍顆粒大劑量組（14g/kg）、芪芍顆粒中劑量組（7g/kg）、芪芍顆粒小劑量組（3.5g/kg）。 各組每天上午（9：30~10：30）灌胃一次，給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量的受試物及陽性藥，空白對照組和UC模型組給予相應(yīng)體積蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。

2.2 動(dòng)物模型的建立

參照文獻(xiàn)[2、3]略加改進(jìn)對小鼠進(jìn)行造模。造模前一天小鼠禁食不禁水24h，造模開始前輕揉小鼠腹部，刺激肛門，促進(jìn)小鼠排便。乙醚吸入麻醉。輕提小鼠尾部，使其與水平面呈60°倒立，經(jīng)小鼠肛門插入直徑1mm聚乙烯軟導(dǎo)管，在結(jié)腸內(nèi)距肛門3.5cm處，緩慢注入5%乙酸溶液100μl，迅速拔出導(dǎo)管，捏緊小鼠肛門倒立2min，防止乙酸溶液漏出。造模結(jié)束后將小鼠放回籠中平躺自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)。空白對照組小鼠以同樣方法注入100μl生理鹽水予以對照。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

收集數(shù)據(jù)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，定量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對體重的影響

與空白對照組比較，UC模型組小鼠體重明顯減輕，具有顯著性差異，表明利用乙酸誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型成功。與UC模型組比較，芪芍顆粒劑量組均能升高小鼠體重，結(jié)果見圖1。

圖1 芪芍顆粒對UC小鼠每日體重影響變化

3.2 對結(jié)腸長度、重量、腸重指數(shù)的影響

與空白對照組比較，UC模型組小鼠結(jié)腸長度及重量明顯縮短，具有顯著性差異，腸質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明利用乙酸灌腸造模成功。與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組顯著增加結(jié)腸長度，結(jié)腸重量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見表1。

表1 芪芍顆粒對UC小鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸重量、腸質(zhì)量指數(shù)的影響（x±s，n=8）

3.3 結(jié)腸組織病理蘇木素-伊紅（H&E）染色鏡下觀察

圖2 各組小鼠結(jié)腸HE染色情況

與空白對1照組相比，UC模型組上皮細(xì)胞破損，隱窩結(jié)構(gòu)消失，粘膜及黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤；與UC模型組相比，SASP組與芪芍顆粒高劑量組可恢復(fù)粘膜上皮結(jié)構(gòu)，修復(fù)隱窩結(jié)構(gòu)，減少中性粒細(xì)胞浸潤，結(jié)果見圖2。

3.4 對結(jié)腸組織中SOD活性及MPO含量的影響

與空白對照組相比，UC模型組小鼠結(jié)腸組織MPO明顯升高，具有顯著性差異；與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著降低乙酸引起潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道MPO水平，具有顯著性差異。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織SOD活性明顯降低，具有顯著性差異；與模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著提高乙酸引起潰瘍性結(jié)腸炎小鼠SOD活性，具有顯著性差異，結(jié)果見圖3。

圖3 芪芍顆粒對UC小鼠結(jié)腸組織SOD活性、MPO含量的影響。

3.5 對結(jié)腸組織NO含量的影響

與空白對照組相比，UC模型組小鼠結(jié)腸組織中NO含量明顯升高，具有顯著性差異；與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著降低乙酸引起潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道NO水平，具有顯著性差異，結(jié)果見圖4。

圖4 芪芍顆粒對UC小鼠結(jié)腸組織NO含量的影響

3.6 對結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α含量的影響

與空白對照組相比，UC模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α含量明顯升高，具有顯著性差異；與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著降低乙酸引起潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道IL-1β、TNF-α水平，具有顯著性差異，結(jié)果見圖5。

圖5 芪芍顆粒對UC小鼠結(jié)腸組織 IL-1β、TNF-α含量的影響。

4 討論

結(jié)腸長度及組織病理學(xué)改變是UC研究中衡量結(jié)腸損傷的重要指標(biāo)，可評價(jià)藥物對UC小鼠結(jié)腸組織炎癥及損傷的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組末次給藥后，UC模型組結(jié)腸長度明顯縮短，HE病理染色可觀察到典型的急性炎癥表現(xiàn)，包括大量炎癥細(xì)胞聚集等；陽性藥柳氮磺嘧啶組和芪芍顆粒高、中、低劑量組結(jié)腸縮短現(xiàn)象都有好轉(zhuǎn)，且HE病理染色觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)腸粘膜及黏膜下層炎癥有不同程度的減輕。提示芪芍顆粒對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠具有治療作用。

髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞特有的一種活力酶，MPO在中性粒細(xì)胞中可使H2O2生成某些氧化物，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞自身的致炎作用，使腸道炎癥進(jìn)一步加重。研究中發(fā)現(xiàn)芪芍顆粒能降低UC模型小鼠結(jié)腸組織中的MPO含量，減少中性粒細(xì)胞的浸潤，從而改善急性潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。超氧化物歧化酶（SOD）是細(xì)胞內(nèi)主要的防御性抗氧化酶，能夠清除自由基，并可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整作用[5]。結(jié)腸炎癥因子iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，是UC中一種重要的促炎因子。由單核巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β 是目前公認(rèn)的能介導(dǎo)UC發(fā)病的促炎細(xì)胞因子，它促使中性粒細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，引起一系列的病理變化導(dǎo)致UC的形成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芪芍顆粒在減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥的同時(shí)，結(jié)腸組織中的MPO、NO、TNF-α、IL-1β含量顯著降低，SOD含量顯著增加，提示芪芍顆粒治療潰瘍性結(jié)腸炎可能是從下調(diào)腸粘膜促炎因子（IL-1β、TNF-α、MPO 等）的表達(dá)、抑制腸粘膜氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生并減少促氧化因子（NO）及增加抗氧化因子（SOD）的活力來治療潰瘍性結(jié)腸炎。關(guān)于芪芍顆粒治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。