鞣花酸通過(guò)降低自噬作用減輕缺氧缺血性腦損傷*

蔡晨晨， 葉麗霞， 朱將虎， 白俊杰， 曾珊珊， 陳尚勤， 林振浪

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 育英兒童醫(yī)院新生兒科， 浙江 溫州 325027)

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是以圍產(chǎn)期窒息為主要病因的疾病，具有高致死率和高致殘率的特點(diǎn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家每1 000個(gè)新生兒，患有缺氧缺血性腦病有1～8個(gè)；在發(fā)展中國(guó)家，每1 000個(gè)新生兒出生即有26個(gè)患有缺氧缺血性腦病[2]。2010年美國(guó)兒科學(xué)會(huì)已將亞低溫治療作為新生兒嚴(yán)重窒息后發(fā)生新生兒缺氧缺血性腦病的常規(guī)處理[3]。但對(duì)于重度的缺氧缺血性腦病，該治療效果甚微，而且亞低溫治療的時(shí)間窗只有6 h。以往國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，對(duì)患有缺氧缺血性腦病的新生兒予以催產(chǎn)素[4]或去鐵胺[5]等，療效佳，但是也有少部分報(bào)道，這些藥物的指征把握不當(dāng)反而引發(fā)或加重病情[6]。因此，有必要尋找新的且安全的治療方法來(lái)保護(hù)缺氧缺血性腦損傷并促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)。

鞣花酸(ellagic acid，EA)是一種天然多酚二內(nèi)酯，提取于水果(藍(lán)莓和石榴等)及堅(jiān)果類等,研究發(fā)現(xiàn)它具有抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤等作用，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用鮮有報(bào)道[7]。

自噬是機(jī)體一個(gè)生理現(xiàn)象，在正常情況下以代謝異常蛋白和異常細(xì)胞器為主，可再生有利的物質(zhì)以供機(jī)體循環(huán)利用[8]，從而維持機(jī)體內(nèi)部代謝環(huán)境提供良好的平衡。在以往研究中，自噬被證明參與了HIE的發(fā)病機(jī)制，它還涉及神經(jīng)細(xì)胞存亡、病原清除或抗原呈遞等作用[9]。同時(shí)，正常反應(yīng)強(qiáng)度的自噬可結(jié)合凋亡或其它病理機(jī)制等對(duì)神經(jīng)元功能和神經(jīng)元活性起到維持或改善作用[10]。但是，近幾年研究發(fā)現(xiàn)窒息后的新生兒腦部神經(jīng)元大量死亡與大量激發(fā)的自噬有關(guān)[11]，可見(jiàn)自噬有利有弊。另外，鞣花酸的療效是否涉及神經(jīng)元的自噬機(jī)制尚不清楚，而且國(guó)內(nèi)缺氧缺血性腦病研究中尚未報(bào)道該類藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成果。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證以下的假說(shuō)：在缺氧缺血性腦損傷中，鞣花酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的自噬水平而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

Sprague-Dawley (SD)大鼠購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物中心。PC12細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM和胰酶等購(gòu)自Gibco；EA購(gòu)自MedChemExpress；2’, 7’-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(2’, 7’-dichlorodihydroflurescein diacetate，DCFH-DA)、CCK-8(Cell Count Kit-8)試劑盒和HE染色試劑盒購(gòu)自碧云天；抗beclin-1、P62、LC3-II/-I、Atg5和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology(CST)；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)及四甲基羅丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE)熒光試劑均購(gòu)自Sigma。

2 方法

2.1動(dòng)物飼養(yǎng)、造模和給藥 雌雄SD成年大鼠(240～320 g)飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境，水和普通飼料充足，保證12 h日光周期。正常雌雄SD大鼠交配后，各雌性大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，分娩乳鼠。收集7 d 齡乳鼠隨機(jī)分組：假手術(shù)(sham)組(n=5)、HIE造模(HIE)組(n=6)和HIE造模+鞣花酸預(yù)給藥(HIE+EA pretreatment)組(n=6)。EA預(yù)給藥組中，利用尖頭磨鈍的灌胃針將玉米油(10 mL/kg)混合EA(10 mg/kg)依據(jù)乳鼠體重進(jìn)行依次計(jì)算后灌胃。隨后，假手術(shù)組將頸部正中皮膚切開(kāi)分離出左頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，后縫合皮膚，其余組別乳鼠參照以上步驟并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈上、下端并在中間切斷。以上操作均在乙醚氣麻下進(jìn)行，隨后，乳鼠放回至母鼠籠中恢復(fù)2 h。準(zhǔn)備氣密箱通入混合氣體(92% N2，8% O2)，將乳鼠放入該氣密箱通氣120 min。結(jié)束后將乳鼠放回母鼠籠中，24 h后腦部組織取樣。

2.2乳鼠腦組織的TTC染色 造模24 h后取各組乳鼠的腦組織放于-20 ℃冰箱冰凍10 min，沿冠狀軸將腦組織由前向后分為5部分，即腦部前端與視交叉的中心水平、視交叉水平、漏斗柄部以及漏斗部與腦部后端的中心水平，放入1% TTC溶液進(jìn)行水浴染色20 min。取出腦組織，進(jìn)行水份擦拭以及組織圖片的拍攝。

2.3乳鼠腦組織的HE染色 取造模后24 h的乳鼠，乙醚氣麻下，進(jìn)行左心腔PBS灌流(10 mL)，后預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液(10 mL)進(jìn)行心腔灌注，待乳鼠全身肌肉僵直提示多聚甲醛溶液進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。灌注成功后，取乳鼠腦組織放于4%多聚甲醛過(guò)夜，隨后脫水及石蠟包埋。腦組織石蠟塊沿冠狀面進(jìn)行5 μm切片，然后HE染色。依據(jù)碧云天HE染色步驟說(shuō)明依次操作。

2.4細(xì)胞培養(yǎng)與給藥 取分化的PC12細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+DMEM)，置于5% CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇經(jīng)24 h培養(yǎng)后，予以換液以及傳代，細(xì)胞狀態(tài)以及形狀保持良好。在氯化鈷(CoCl2)缺氧實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞以每孔2×104個(gè)種入96孔板，按 24 h孵育時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置濃度梯度(100～1 200 μmol/L)來(lái)確定合適的藥物濃度。與此同時(shí)，在明確氯化鈷藥物濃度后，鞣花酸的藥物按24 h標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置濃度梯度(1～12 μmol/L)進(jìn)行預(yù)給藥及明確藥物的最佳保護(hù)效果。

2.5細(xì)胞活力的檢測(cè) 以上細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定氯化鈷的適宜造模條件與鞣花酸預(yù)給藥的最佳藥物濃度由CCK-8細(xì)胞活力試劑盒檢測(cè)。在細(xì)胞給藥后去除原先培養(yǎng)液，PBS輕柔洗滌3次吸凈后，將CCK-8試劑與DMEM混合成一定比例的溶液注入96孔板實(shí)驗(yàn)區(qū)域。在培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出96孔板放于微孔檢測(cè)器中(490 nm波長(zhǎng))檢測(cè)吸光度(A)值，確定最佳實(shí)驗(yàn)效果。

2.6PC12細(xì)胞生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的檢測(cè) 將PC12細(xì)胞均勻種入6孔板，按正常(control)組、氯化鈷(CoCl2)組及氯化鈷+鞣花酸(CoCl2+EA pretreatment)組進(jìn)行分組。各組細(xì)胞在PBS清洗后，將DCFH-DA試劑和DMEM培養(yǎng)基按一定比例(按碧云天說(shuō)明書(shū)要求)混合配制成的溶液沿壁在各組中加入1 mL，放回培養(yǎng)箱孵育25 min。孵育后去除液體再PBS洗凈，用胰酶離心細(xì)胞再輕柔吹打重懸細(xì)胞放入流式樣品管。各組流式樣品放于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7線粒體膜電位熒光的檢測(cè) 在各組培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞爬片，按每組造模及給藥要求處理后，將熒光試劑按說(shuō)明書(shū)的工作液比例進(jìn)行配制并避光孵育。PBS洗凈雜質(zhì)和死細(xì)胞后取出爬片置于載玻片。按一般細(xì)胞熒光的固定要求，PC12細(xì)胞在暗室中做好各項(xiàng)處理并用TMRE染色，滴加抗熒光淬滅劑放于熒光顯微鏡下觀察膜電位情況。

2.8PC12細(xì)胞自噬小體的檢測(cè) 用MDC染色法主要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體的產(chǎn)生情況，同上細(xì)胞爬片的要求，MDC試劑按說(shuō)明書(shū)工作液比例進(jìn)行加樣以及孵育。取出各組爬片，于暗室按一般細(xì)胞熒光的操作處理，最后置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況，判定PC12細(xì)胞自噬的情況。

2.9Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織及PC12細(xì)胞中Atg5、P62、beclin-1和LC3-II/-I蛋白的表達(dá)水平 處理后的各組細(xì)胞用PBS洗凈后置于冰上，加入RIPA及PMSF按一定比例混合的裂解液作用30 min。取乳鼠損傷側(cè)腦部皮質(zhì)進(jìn)行勻漿后同樣加入裂解液處理。利用細(xì)胞刮刀對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞刮取并收集相應(yīng)的蛋白裂解液。12 000 r/min高速離心30 min后得到上清液， 利用BCA試劑盒及酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白濃度。最后PBS、Loading buffer試劑與蛋白混合配制為蛋白樣品進(jìn)行上樣30 μg。配制12%的膠體后進(jìn)行分組蛋白上樣，電泳75 V 90 min及電轉(zhuǎn)250 mA 85 min后得到轉(zhuǎn)有分離蛋白的PVDF膜。配制5%脫脂奶粉50 mL，將膜放入其中進(jìn)行封閉2 h。 I 抗原液利用 I 抗稀釋液進(jìn)行配制，待封閉結(jié)束后將膜中相應(yīng)分子量的條帶切割放入對(duì)應(yīng)的 I 抗稀釋液進(jìn)行孵育4 ℃過(guò)夜。之后，條帶用TBST清洗后加入對(duì)應(yīng)的山羊抗兔的 II 抗配制液進(jìn)行室溫下孵育2 h，TBST清洗后于Bio-Rad蛋白免疫印跡成像儀中顯示蛋白結(jié)果及分析趨勢(shì)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)以及Bonferroni校正的t檢驗(yàn)用于各組間均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鞣花酸對(duì)乳鼠缺氧缺血性腦損傷的影響

造模24 h后取出的腦組織進(jìn)行TTC染色及HE染色，發(fā)現(xiàn)鞣花酸預(yù)給藥處理能夠有效預(yù)防HIE造模的損傷從而起到保護(hù)腦組織的作用。相較于HIE組的TTC染色情況，鞣花酸預(yù)給藥處理能夠有效減少腦部因缺血缺氧造成的梗死面積，見(jiàn)圖1。HE染色發(fā)現(xiàn)，HIE造模組中乳鼠腦部的結(jié)構(gòu)完整性被大量破壞伴明顯水腫，神經(jīng)元少見(jiàn)；鞣花酸預(yù)給藥組腦組織僅部分損傷，神經(jīng)元分布較HIE組多，且結(jié)構(gòu)完整，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The effect of EA on neonatal rats with HIE observed by TTC staining. The scale bar=1 cm.

圖1鞣花酸對(duì)乳鼠缺氧缺血性腦損傷TTC染色的影響

Figure 2.The effect of EA on neonatal rats with HIE observed by HE staining (×100).

圖2鞣花酸對(duì)乳鼠缺氧缺血性腦損傷HE染色的影響

2 鞣花酸對(duì)乳鼠腦皮質(zhì)中自噬標(biāo)志蛋白Atg5、 P62、 beclin-1和LC3-II/-I表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較，HIE組腦部皮質(zhì)Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而P62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);鞣花酸預(yù)處理組腦皮質(zhì)Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平均顯著低于HIE組(P<0.01、P<0.05)，而P62蛋白水平相較于HIE組呈現(xiàn)高表達(dá)量(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

3 鞣花酸在缺氧環(huán)境下保護(hù)PC12細(xì)胞

氯化鈷對(duì)PC12細(xì)胞的有效致死濃度可通過(guò)時(shí)間梯度與濃度梯度進(jìn)行確定。與正常組相比，800 μmol/L濃度的氯化鈷培養(yǎng)24 h是造成PC12細(xì)胞適宜的致死量,與control組比較，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。在確定氯化鈷的造模條件后，鞣花酸預(yù)給藥處理，與氯化鈷組相比，鞣花酸8 μmol/L濃度下24 h預(yù)處理能夠有效減輕氯化鈷的損害,與CoCl2組比較，細(xì)胞活力顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

4 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

為檢測(cè)3組PC12細(xì)胞各自的氧化應(yīng)激水平，DCFH-DA試劑分別添加至3組培養(yǎng)液中。孵育后收集各組細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示氯化鈷組的氧化應(yīng)激水平明顯高于正常組(P<0.01);與氯化鈷組比較，鞣花酸預(yù)處理后確有降低氧化應(yīng)激的趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

5 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

氯化鈷組PC12細(xì)胞的線粒體膜電位顯示低熒光數(shù)值,與control組相比顯著降低(P<0.01)；鞣花酸預(yù)處理組相較于氯化鈷組能夠升高線粒體膜電位水平，在TMRE熒光染色中顯示較高水平(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

6 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)自噬的影響

用MDC熒光染色反映PC12細(xì)胞內(nèi)部自噬小體的數(shù)量及自噬強(qiáng)度，與control組相比，CoCl2組熒光值顯著升高(P<0.01)；鞣花酸預(yù)處理組能夠有效降低自噬小體的數(shù)量或自噬強(qiáng)度(P<0.01)，見(jiàn)圖8。

7 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞Atg5、 P62、 beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，氯化鈷組的Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)呈現(xiàn)高水平(P<0.01)，而P62蛋白表達(dá)呈現(xiàn)低水平(P<0.01);鞣花酸預(yù)處理后，PC12細(xì)胞的Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，而P62蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖9。

討 論

Figure 3.The effects of EA on protein expression of Atg5, P62, beclin-1 and LC3-II/-I in the cortex. Mean±SD.n=5.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsHIE group.

圖3鞣花酸對(duì)乳鼠腦皮質(zhì)中Atg5、P62、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 4.The effect of CoCl2at different doses on the viability of PC12 cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖4不同濃度氯化鈷作用下各組細(xì)胞活力的變化

Figure 5.The effect of EA at different doses on the viability of PC12 treated with CoCl2. Mean±SD.n=5.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsCoCl2group.

圖5不同濃度鞣花酸預(yù)給藥情況下細(xì)胞活力的變化

以往研究發(fā)現(xiàn)，HIE的發(fā)病機(jī)制涉及炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡以及自噬等多項(xiàng)病理機(jī)制[12-15]。近年來(lái)，自噬的發(fā)現(xiàn)為HIE的治療提供了一個(gè)新的視點(diǎn)[16]。在正常個(gè)體體內(nèi)，自噬主要起到消化異常蛋白、其它小分子和細(xì)胞器的作用，從而維持內(nèi)環(huán)境平衡。一般而言，自噬被視為一種良性的生理過(guò)程。自噬在機(jī)體內(nèi)可分為保護(hù)性自噬與危害性自噬，后者指在過(guò)分刺激或不利環(huán)境下，自噬也可能演變?yōu)椴涣嫉姆磻?yīng)，即過(guò)度自噬(excessive autophagy)[17-18]。特別在神經(jīng)元缺氧情況下，過(guò)度自噬的發(fā)生會(huì)干擾正常自噬的作用，即吞噬異常蛋白或細(xì)胞器的同時(shí)，甚至吞噬正常蛋白或細(xì)胞器，嚴(yán)重影響神經(jīng)元的正常功能。

Figure 6.The effect of EA on ROS level in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsCoCl2group.

圖6鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

Figure 7.The effect of EA pretreatment on mitochondrial membrane potential of PC12 cells. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsCoCl2group.

圖7鞣花酸預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

Figure 8.The effect of EA pretreatment on formation of autophagosomes in the PC12 cells. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCoCl2group.

圖8鞣花酸預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成的影響

Figure 9.The effects of EA on the protein expression of Atg5, P62, beclin-1 and LC3-II/-I in the PC12 cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCoCl2group.

圖9EA對(duì)PC12細(xì)胞Atg5、P62、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平的影響

鞣花酸主要提取于堅(jiān)果內(nèi)的天然化合物，毒性極低，因其具有抗氧化應(yīng)激，抗炎癥，抗凋亡和抗腫瘤等特性廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域[7]。各個(gè)研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)，鞣花酸的抗氧化應(yīng)激作用效果明顯[19]。但在缺氧缺血性腦損傷模型中，給藥鞣花酸能否通過(guò)降低體內(nèi)外神經(jīng)元內(nèi)過(guò)度自噬起到神經(jīng)保護(hù)作用目前尚不清楚。以往研究提出，神經(jīng)元缺氧損傷下，氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引發(fā)自噬的產(chǎn)生甚至加強(qiáng)自噬的強(qiáng)度。適當(dāng)激活的自噬可對(duì)氧化應(yīng)激水平有一定的抑制作用[20]。但是大量氧化應(yīng)激的情況下，過(guò)度自噬的產(chǎn)生反而會(huì)對(duì)神經(jīng)元的內(nèi)部環(huán)境造成紊亂，甚至細(xì)胞整體情況惡化[21]。因此，本文依據(jù)鞣花酸的藥理特性推測(cè)，鞣花酸在一定的有效劑量下可改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平進(jìn)而影響自噬的進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)中，HIE組的乳鼠左側(cè)半腦梗死面積大，腦部結(jié)構(gòu)水腫或破壞，大量神經(jīng)元損傷。為了更深入探討機(jī)體內(nèi)自噬的改變情況與后期給藥后鞣花酸對(duì)自噬的調(diào)節(jié)情況，本次實(shí)驗(yàn)選擇蛋白表達(dá)層面上反映自噬過(guò)程。Beclin-1是自噬始發(fā)過(guò)程的關(guān)鍵指標(biāo)，其高表達(dá)水平可提示細(xì)胞內(nèi)大量自噬[22]，本次實(shí)驗(yàn)中造模組beclin-1的高表達(dá)水平提示了損傷條件下乳鼠左側(cè)半腦的皮質(zhì)內(nèi)自噬的大量激活。此外，本次研究中選擇Atg5作為自噬相關(guān)蛋白，在自噬小體的形成中起重要作用[23],結(jié)果顯示左側(cè)損傷半腦皮質(zhì)，Atg5大量表達(dá)與beclin-1趨勢(shì)相符合。除了以上2個(gè)自噬相關(guān)指標(biāo)外，LC3-II/-I是自噬的最關(guān)鍵蛋白，直接反映自噬的最終進(jìn)程[24]，同樣在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)一個(gè)過(guò)度自噬的表達(dá)水平。自噬激活途徑的相關(guān)蛋白在上述實(shí)驗(yàn)皆被證明，但是自噬在正常生理狀況下存在平衡，即自噬的發(fā)生過(guò)程由自噬的激活和自噬的抑制加以調(diào)節(jié)平衡。換言之，自噬過(guò)程的任一方面失衡，自噬可能發(fā)生異常。本次實(shí)驗(yàn)同樣探討了機(jī)體內(nèi)選擇性抑制自噬進(jìn)程的部分指標(biāo)，即經(jīng)典的P62指標(biāo)。P62的低水平表達(dá)意味著自噬激活或大量產(chǎn)生[25]。本研究結(jié)果中，HIE組乳鼠損傷側(cè)腦部提取的皮質(zhì)蛋白中，Atg5、beclin-1和LC3-II/-I的蛋白表達(dá)水平均明顯升高且伴P62下降，提示HIE造模后，腦組織內(nèi)過(guò)度自噬的病理改變?cè)斐山M織結(jié)構(gòu)大量破壞。同樣，本研究中采用PC12細(xì)胞代替神經(jīng)元，主要由于該細(xì)胞的分化型不僅結(jié)構(gòu)上類似神經(jīng)元而且具有神經(jīng)元特性。既往研究指出，與原代神經(jīng)元的體外藥物試驗(yàn)相比，分化型PC12細(xì)胞不僅在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與原代神經(jīng)細(xì)胞相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果或趨勢(shì)，而且培養(yǎng)周期與培養(yǎng)成本低，可以替代動(dòng)物預(yù)測(cè)人體藥物反應(yīng)[26]。同樣，國(guó)內(nèi)外研究中在探討神經(jīng)毒性及神經(jīng)保護(hù)等方面，利用分化型PC12細(xì)胞代替動(dòng)物原代神經(jīng)細(xì)胞同樣得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[27]。PC12細(xì)胞經(jīng)氯化鈷處理后，其MDC熒光水平極高，反映細(xì)胞內(nèi)過(guò)度自噬。神經(jīng)元內(nèi)發(fā)生大量的自噬影響細(xì)胞整體狀態(tài)，包括氧化應(yīng)激在缺氧情況的大量激活，推動(dòng)二次損傷或自噬的進(jìn)一步加強(qiáng)(過(guò)度自噬)以及凋亡水平逐漸增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平升高；TMRE熒光染色降低，反映凋亡水平升高[28]。因此，以上動(dòng)物和細(xì)胞模型均顯示自噬相關(guān)指標(biāo)顯著升高，存在過(guò)度自噬。

然而，乳鼠預(yù)給藥鞣花酸后，與HIE組相比，TTC染色顯示損傷側(cè)半腦梗死面積減少，HE染色可見(jiàn)腦部結(jié)構(gòu)大體保持完整。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)給藥鞣花酸在早期能減輕缺氧環(huán)境對(duì)神經(jīng)元的損傷，我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。神經(jīng)元在缺氧環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平提高。以往研究已經(jīng)證明，作為自噬上游激動(dòng)因子之一，氧化應(yīng)激主要發(fā)生在損傷或功能異常線粒體[29-30]。因此，線粒體功能檢測(cè)在本研究中至關(guān)重要，而且線粒體膜電位的檢測(cè)是線粒體結(jié)構(gòu)或功能完整性最為直接的反映[31]。同時(shí)，TMRE指標(biāo)與凋亡初期水平相關(guān)，TMRE降低，提示凋亡水平上升。在本研究中，鞣花酸的預(yù)處理不僅降低氯化鈷處理的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，同時(shí)降低了凋亡水平。在自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)方面，鞣花酸預(yù)處理的腦部皮質(zhì)蛋白與PC12細(xì)胞的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。鞣花酸預(yù)處理后，蛋白P62表達(dá)水平提高，提示抑制自噬產(chǎn)生的作用增強(qiáng)，同時(shí)蛋白beclin-1表達(dá)水平降低，兩者均提示自噬水平降低。另外，Atg5是參與自噬調(diào)控的重要成分，它與Atg12、Atg16是形成自噬小體的關(guān)鍵成分，自噬小體是自噬發(fā)生較為直觀的反映[32]。鞣花酸處理后，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)蛋白Atg5表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)該組PC12細(xì)胞的MDC熒光數(shù)值降低，兩者提示自噬小體產(chǎn)生減少及自噬強(qiáng)度下降。最后，蛋白LC3-II/-I表達(dá)情況的比值作為自噬途徑的經(jīng)典指標(biāo)，也在本研究中被納入檢測(cè)。相較于正常組，在氯化鈷組中蛋白LC3-II/-I表達(dá)情況的比值明顯升高，提示該組自噬的高強(qiáng)度,同樣，鞣花酸預(yù)處理后的PC12細(xì)胞的蛋白LC3-II/-I表達(dá)情況的比值降低，提示自噬強(qiáng)度下調(diào)。以上結(jié)果均提示鞣花酸預(yù)處理后對(duì)神經(jīng)元具有良好的保護(hù)效果。

綜上所述，本研究從在體和細(xì)胞2個(gè)水平，初步證實(shí)了鞣花酸具有對(duì)抗缺氧缺血性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。鞣花酸可能通過(guò)降低神經(jīng)元內(nèi)過(guò)分自噬的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用。鞣花酸為天然提取成分，毒性小，因此，將鞣花酸用于治療新生兒缺氧缺血性腦病，具有一定的臨床應(yīng)用前景。