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    鞣花酸通過(guò)降低自噬作用減輕缺氧缺血性腦損傷*

    2019-02-28 09:13:06蔡晨晨葉麗霞朱將虎白俊杰曾珊珊陳尚勤林振浪
    中國(guó)病理生理雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:花酸乳鼠氯化

    蔡晨晨, 葉麗霞, 朱將虎, 白俊杰, 曾珊珊, 陳尚勤, 林振浪

    (溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 育英兒童醫(yī)院新生兒科, 浙江 溫州 325027)

    缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是以圍產(chǎn)期窒息為主要病因的疾病,具有高致死率和高致殘率的特點(diǎn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),發(fā)達(dá)國(guó)家每1 000個(gè)新生兒,患有缺氧缺血性腦病有1~8個(gè);在發(fā)展中國(guó)家,每1 000個(gè)新生兒出生即有26個(gè)患有缺氧缺血性腦病[2]。2010年美國(guó)兒科學(xué)會(huì)已將亞低溫治療作為新生兒嚴(yán)重窒息后發(fā)生新生兒缺氧缺血性腦病的常規(guī)處理[3]。但對(duì)于重度的缺氧缺血性腦病,該治療效果甚微,而且亞低溫治療的時(shí)間窗只有6 h。以往國(guó)內(nèi)研究報(bào)道,對(duì)患有缺氧缺血性腦病的新生兒予以催產(chǎn)素[4]或去鐵胺[5]等,療效佳,但是也有少部分報(bào)道,這些藥物的指征把握不當(dāng)反而引發(fā)或加重病情[6]。因此,有必要尋找新的且安全的治療方法來(lái)保護(hù)缺氧缺血性腦損傷并促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)。

    鞣花酸(ellagic acid,EA)是一種天然多酚二內(nèi)酯,提取于水果(藍(lán)莓和石榴等)及堅(jiān)果類等,研究發(fā)現(xiàn)它具有抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤等作用,但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用鮮有報(bào)道[7]。

    自噬是機(jī)體一個(gè)生理現(xiàn)象,在正常情況下以代謝異常蛋白和異常細(xì)胞器為主,可再生有利的物質(zhì)以供機(jī)體循環(huán)利用[8],從而維持機(jī)體內(nèi)部代謝環(huán)境提供良好的平衡。在以往研究中,自噬被證明參與了HIE的發(fā)病機(jī)制,它還涉及神經(jīng)細(xì)胞存亡、病原清除或抗原呈遞等作用[9]。同時(shí),正常反應(yīng)強(qiáng)度的自噬可結(jié)合凋亡或其它病理機(jī)制等對(duì)神經(jīng)元功能和神經(jīng)元活性起到維持或改善作用[10]。但是,近幾年研究發(fā)現(xiàn)窒息后的新生兒腦部神經(jīng)元大量死亡與大量激發(fā)的自噬有關(guān)[11],可見(jiàn)自噬有利有弊。另外,鞣花酸的療效是否涉及神經(jīng)元的自噬機(jī)制尚不清楚,而且國(guó)內(nèi)缺氧缺血性腦病研究中尚未報(bào)道該類藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成果。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證以下的假說(shuō):在缺氧缺血性腦損傷中,鞣花酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的自噬水平而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

    材 料 和 方 法

    1 材料和試劑

    Sprague-Dawley (SD)大鼠購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物中心。PC12細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM和胰酶等購(gòu)自Gibco;EA購(gòu)自MedChemExpress;2’, 7’-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(2’, 7’-dichlorodihydroflurescein diacetate,DCFH-DA)、CCK-8(Cell Count Kit-8)試劑盒和HE染色試劑盒購(gòu)自碧云天;抗beclin-1、P62、LC3-II/-I、Atg5和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology(CST);單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)及四甲基羅丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE)熒光試劑均購(gòu)自Sigma。

    2 方法

    2.1動(dòng)物飼養(yǎng)、造模和給藥 雌雄SD成年大鼠(240~320 g)飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境,水和普通飼料充足,保證12 h日光周期。正常雌雄SD大鼠交配后,各雌性大鼠單獨(dú)飼養(yǎng),分娩乳鼠。收集7 d 齡乳鼠隨機(jī)分組:假手術(shù)(sham)組(n=5)、HIE造模(HIE)組(n=6)和HIE造模+鞣花酸預(yù)給藥(HIE+EA pretreatment)組(n=6)。EA預(yù)給藥組中,利用尖頭磨鈍的灌胃針將玉米油(10 mL/kg)混合EA(10 mg/kg)依據(jù)乳鼠體重進(jìn)行依次計(jì)算后灌胃。隨后,假手術(shù)組將頸部正中皮膚切開(kāi)分離出左頸總動(dòng)脈不結(jié)扎,后縫合皮膚,其余組別乳鼠參照以上步驟并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈上、下端并在中間切斷。以上操作均在乙醚氣麻下進(jìn)行,隨后,乳鼠放回至母鼠籠中恢復(fù)2 h。準(zhǔn)備氣密箱通入混合氣體(92% N2,8% O2),將乳鼠放入該氣密箱通氣120 min。結(jié)束后將乳鼠放回母鼠籠中,24 h后腦部組織取樣。

    2.2乳鼠腦組織的TTC染色 造模24 h后取各組乳鼠的腦組織放于-20 ℃冰箱冰凍10 min,沿冠狀軸將腦組織由前向后分為5部分,即腦部前端與視交叉的中心水平、視交叉水平、漏斗柄部以及漏斗部與腦部后端的中心水平,放入1% TTC溶液進(jìn)行水浴染色20 min。取出腦組織,進(jìn)行水份擦拭以及組織圖片的拍攝。

    2.3乳鼠腦組織的HE染色 取造模后24 h的乳鼠,乙醚氣麻下,進(jìn)行左心腔PBS灌流(10 mL),后預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液(10 mL)進(jìn)行心腔灌注,待乳鼠全身肌肉僵直提示多聚甲醛溶液進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。灌注成功后,取乳鼠腦組織放于4%多聚甲醛過(guò)夜,隨后脫水及石蠟包埋。腦組織石蠟塊沿冠狀面進(jìn)行5 μm切片,然后HE染色。依據(jù)碧云天HE染色步驟說(shuō)明依次操作。

    2.4細(xì)胞培養(yǎng)與給藥 取分化的PC12細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+DMEM),置于5% CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇經(jīng)24 h培養(yǎng)后,予以換液以及傳代,細(xì)胞狀態(tài)以及形狀保持良好。在氯化鈷(CoCl2)缺氧實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞以每孔2×104個(gè)種入96孔板,按 24 h孵育時(shí)間標(biāo)準(zhǔn),設(shè)置濃度梯度(100~1 200 μmol/L)來(lái)確定合適的藥物濃度。與此同時(shí),在明確氯化鈷藥物濃度后,鞣花酸的藥物按24 h標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置濃度梯度(1~12 μmol/L)進(jìn)行預(yù)給藥及明確藥物的最佳保護(hù)效果。

    2.5細(xì)胞活力的檢測(cè) 以上細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定氯化鈷的適宜造模條件與鞣花酸預(yù)給藥的最佳藥物濃度由CCK-8細(xì)胞活力試劑盒檢測(cè)。在細(xì)胞給藥后去除原先培養(yǎng)液,PBS輕柔洗滌3次吸凈后,將CCK-8試劑與DMEM混合成一定比例的溶液注入96孔板實(shí)驗(yàn)區(qū)域。在培養(yǎng)箱中孵育2 h,取出96孔板放于微孔檢測(cè)器中(490 nm波長(zhǎng))檢測(cè)吸光度(A)值,確定最佳實(shí)驗(yàn)效果。

    2.6PC12細(xì)胞生成活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的檢測(cè) 將PC12細(xì)胞均勻種入6孔板,按正常(control)組、氯化鈷(CoCl2)組及氯化鈷+鞣花酸(CoCl2+EA pretreatment)組進(jìn)行分組。各組細(xì)胞在PBS清洗后,將DCFH-DA試劑和DMEM培養(yǎng)基按一定比例(按碧云天說(shuō)明書(shū)要求)混合配制成的溶液沿壁在各組中加入1 mL,放回培養(yǎng)箱孵育25 min。孵育后去除液體再PBS洗凈,用胰酶離心細(xì)胞再輕柔吹打重懸細(xì)胞放入流式樣品管。各組流式樣品放于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    2.7線粒體膜電位熒光的檢測(cè) 在各組培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞爬片,按每組造模及給藥要求處理后,將熒光試劑按說(shuō)明書(shū)的工作液比例進(jìn)行配制并避光孵育。PBS洗凈雜質(zhì)和死細(xì)胞后取出爬片置于載玻片。按一般細(xì)胞熒光的固定要求,PC12細(xì)胞在暗室中做好各項(xiàng)處理并用TMRE染色,滴加抗熒光淬滅劑放于熒光顯微鏡下觀察膜電位情況。

    2.8PC12細(xì)胞自噬小體的檢測(cè) 用MDC染色法主要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體的產(chǎn)生情況,同上細(xì)胞爬片的要求,MDC試劑按說(shuō)明書(shū)工作液比例進(jìn)行加樣以及孵育。取出各組爬片,于暗室按一般細(xì)胞熒光的操作處理,最后置于熒光顯微鏡下觀察熒光情況,判定PC12細(xì)胞自噬的情況。

    2.9Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織及PC12細(xì)胞中Atg5、P62、beclin-1和LC3-II/-I蛋白的表達(dá)水平 處理后的各組細(xì)胞用PBS洗凈后置于冰上,加入RIPA及PMSF按一定比例混合的裂解液作用30 min。取乳鼠損傷側(cè)腦部皮質(zhì)進(jìn)行勻漿后同樣加入裂解液處理。利用細(xì)胞刮刀對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞刮取并收集相應(yīng)的蛋白裂解液。12 000 r/min高速離心30 min后得到上清液, 利用BCA試劑盒及酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白濃度。最后PBS、Loading buffer試劑與蛋白混合配制為蛋白樣品進(jìn)行上樣30 μg。配制12%的膠體后進(jìn)行分組蛋白上樣,電泳75 V 90 min及電轉(zhuǎn)250 mA 85 min后得到轉(zhuǎn)有分離蛋白的PVDF膜。配制5%脫脂奶粉50 mL,將膜放入其中進(jìn)行封閉2 h。 I 抗原液利用 I 抗稀釋液進(jìn)行配制,待封閉結(jié)束后將膜中相應(yīng)分子量的條帶切割放入對(duì)應(yīng)的 I 抗稀釋液進(jìn)行孵育4 ℃過(guò)夜。之后,條帶用TBST清洗后加入對(duì)應(yīng)的山羊抗兔的 II 抗配制液進(jìn)行室溫下孵育2 h,TBST清洗后于Bio-Rad蛋白免疫印跡成像儀中顯示蛋白結(jié)果及分析趨勢(shì)。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,LSD檢驗(yàn)以及Bonferroni校正的t檢驗(yàn)用于各組間均數(shù)的兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 鞣花酸對(duì)乳鼠缺氧缺血性腦損傷的影響

    造模24 h后取出的腦組織進(jìn)行TTC染色及HE染色,發(fā)現(xiàn)鞣花酸預(yù)給藥處理能夠有效預(yù)防HIE造模的損傷從而起到保護(hù)腦組織的作用。相較于HIE組的TTC染色情況,鞣花酸預(yù)給藥處理能夠有效減少腦部因缺血缺氧造成的梗死面積,見(jiàn)圖1。HE染色發(fā)現(xiàn),HIE造模組中乳鼠腦部的結(jié)構(gòu)完整性被大量破壞伴明顯水腫,神經(jīng)元少見(jiàn);鞣花酸預(yù)給藥組腦組織僅部分損傷,神經(jīng)元分布較HIE組多,且結(jié)構(gòu)完整,見(jiàn)圖2。

    Figure 1.The effect of EA on neonatal rats with HIE observed by TTC staining. The scale bar=1 cm.

    圖1鞣花酸對(duì)乳鼠缺氧缺血性腦損傷TTC染色的影響

    Figure 2.The effect of EA on neonatal rats with HIE observed by HE staining (×100).

    圖2鞣花酸對(duì)乳鼠缺氧缺血性腦損傷HE染色的影響

    2 鞣花酸對(duì)乳鼠腦皮質(zhì)中自噬標(biāo)志蛋白Atg5、 P62、 beclin-1和LC3-II/-I表達(dá)水平的影響

    與假手術(shù)組比較,HIE組腦部皮質(zhì)Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),而P62蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);鞣花酸預(yù)處理組腦皮質(zhì)Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平均顯著低于HIE組(P<0.01、P<0.05),而P62蛋白水平相較于HIE組呈現(xiàn)高表達(dá)量(P<0.01),見(jiàn)圖3。

    3 鞣花酸在缺氧環(huán)境下保護(hù)PC12細(xì)胞

    氯化鈷對(duì)PC12細(xì)胞的有效致死濃度可通過(guò)時(shí)間梯度與濃度梯度進(jìn)行確定。與正常組相比,800 μmol/L濃度的氯化鈷培養(yǎng)24 h是造成PC12細(xì)胞適宜的致死量,與control組比較,細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖4。在確定氯化鈷的造模條件后,鞣花酸預(yù)給藥處理,與氯化鈷組相比,鞣花酸8 μmol/L濃度下24 h預(yù)處理能夠有效減輕氯化鈷的損害,與CoCl2組比較,細(xì)胞活力顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖5。

    4 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

    為檢測(cè)3組PC12細(xì)胞各自的氧化應(yīng)激水平,DCFH-DA試劑分別添加至3組培養(yǎng)液中。孵育后收集各組細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示氯化鈷組的氧化應(yīng)激水平明顯高于正常組(P<0.01);與氯化鈷組比較,鞣花酸預(yù)處理后確有降低氧化應(yīng)激的趨勢(shì)(P<0.05),見(jiàn)圖6。

    5 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

    氯化鈷組PC12細(xì)胞的線粒體膜電位顯示低熒光數(shù)值,與control組相比顯著降低(P<0.01);鞣花酸預(yù)處理組相較于氯化鈷組能夠升高線粒體膜電位水平,在TMRE熒光染色中顯示較高水平(P<0.05),見(jiàn)圖7。

    6 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)自噬的影響

    用MDC熒光染色反映PC12細(xì)胞內(nèi)部自噬小體的數(shù)量及自噬強(qiáng)度,與control組相比,CoCl2組熒光值顯著升高(P<0.01);鞣花酸預(yù)處理組能夠有效降低自噬小體的數(shù)量或自噬強(qiáng)度(P<0.01),見(jiàn)圖8。

    7 鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞Atg5、 P62、 beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平的影響

    與正常對(duì)照組比較,氯化鈷組的Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)呈現(xiàn)高水平(P<0.01),而P62蛋白表達(dá)呈現(xiàn)低水平(P<0.01);鞣花酸預(yù)處理后,PC12細(xì)胞的Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),而P62蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖9。

    討 論

    Figure 3.The effects of EA on protein expression of Atg5, P62, beclin-1 and LC3-II/-I in the cortex. Mean±SD.n=5.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsHIE group.

    圖3鞣花酸對(duì)乳鼠腦皮質(zhì)中Atg5、P62、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平的影響

    Figure 4.The effect of CoCl2at different doses on the viability of PC12 cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

    圖4不同濃度氯化鈷作用下各組細(xì)胞活力的變化

    Figure 5.The effect of EA at different doses on the viability of PC12 treated with CoCl2. Mean±SD.n=5.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsCoCl2group.

    圖5不同濃度鞣花酸預(yù)給藥情況下細(xì)胞活力的變化

    以往研究發(fā)現(xiàn),HIE的發(fā)病機(jī)制涉及炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡以及自噬等多項(xiàng)病理機(jī)制[12-15]。近年來(lái),自噬的發(fā)現(xiàn)為HIE的治療提供了一個(gè)新的視點(diǎn)[16]。在正常個(gè)體體內(nèi),自噬主要起到消化異常蛋白、其它小分子和細(xì)胞器的作用,從而維持內(nèi)環(huán)境平衡。一般而言,自噬被視為一種良性的生理過(guò)程。自噬在機(jī)體內(nèi)可分為保護(hù)性自噬與危害性自噬,后者指在過(guò)分刺激或不利環(huán)境下,自噬也可能演變?yōu)椴涣嫉姆磻?yīng),即過(guò)度自噬(excessive autophagy)[17-18]。特別在神經(jīng)元缺氧情況下,過(guò)度自噬的發(fā)生會(huì)干擾正常自噬的作用,即吞噬異常蛋白或細(xì)胞器的同時(shí),甚至吞噬正常蛋白或細(xì)胞器,嚴(yán)重影響神經(jīng)元的正常功能。

    Figure 6.The effect of EA on ROS level in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsCoCl2group.

    圖6鞣花酸對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

    Figure 7.The effect of EA pretreatment on mitochondrial membrane potential of PC12 cells. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsCoCl2group.

    圖7鞣花酸預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

    Figure 8.The effect of EA pretreatment on formation of autophagosomes in the PC12 cells. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCoCl2group.

    圖8鞣花酸預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成的影響

    Figure 9.The effects of EA on the protein expression of Atg5, P62, beclin-1 and LC3-II/-I in the PC12 cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCoCl2group.

    圖9EA對(duì)PC12細(xì)胞Atg5、P62、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表達(dá)水平的影響

    鞣花酸主要提取于堅(jiān)果內(nèi)的天然化合物,毒性極低,因其具有抗氧化應(yīng)激,抗炎癥,抗凋亡和抗腫瘤等特性廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域[7]。各個(gè)研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn),鞣花酸的抗氧化應(yīng)激作用效果明顯[19]。但在缺氧缺血性腦損傷模型中,給藥鞣花酸能否通過(guò)降低體內(nèi)外神經(jīng)元內(nèi)過(guò)度自噬起到神經(jīng)保護(hù)作用目前尚不清楚。以往研究提出,神經(jīng)元缺氧損傷下,氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引發(fā)自噬的產(chǎn)生甚至加強(qiáng)自噬的強(qiáng)度。適當(dāng)激活的自噬可對(duì)氧化應(yīng)激水平有一定的抑制作用[20]。但是大量氧化應(yīng)激的情況下,過(guò)度自噬的產(chǎn)生反而會(huì)對(duì)神經(jīng)元的內(nèi)部環(huán)境造成紊亂,甚至細(xì)胞整體情況惡化[21]。因此,本文依據(jù)鞣花酸的藥理特性推測(cè),鞣花酸在一定的有效劑量下可改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平進(jìn)而影響自噬的進(jìn)展。

    本研究發(fā)現(xiàn)中,HIE組的乳鼠左側(cè)半腦梗死面積大,腦部結(jié)構(gòu)水腫或破壞,大量神經(jīng)元損傷。為了更深入探討機(jī)體內(nèi)自噬的改變情況與后期給藥后鞣花酸對(duì)自噬的調(diào)節(jié)情況,本次實(shí)驗(yàn)選擇蛋白表達(dá)層面上反映自噬過(guò)程。Beclin-1是自噬始發(fā)過(guò)程的關(guān)鍵指標(biāo),其高表達(dá)水平可提示細(xì)胞內(nèi)大量自噬[22],本次實(shí)驗(yàn)中造模組beclin-1的高表達(dá)水平提示了損傷條件下乳鼠左側(cè)半腦的皮質(zhì)內(nèi)自噬的大量激活。此外,本次研究中選擇Atg5作為自噬相關(guān)蛋白,在自噬小體的形成中起重要作用[23],結(jié)果顯示左側(cè)損傷半腦皮質(zhì),Atg5大量表達(dá)與beclin-1趨勢(shì)相符合。除了以上2個(gè)自噬相關(guān)指標(biāo)外,LC3-II/-I是自噬的最關(guān)鍵蛋白,直接反映自噬的最終進(jìn)程[24],同樣在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)一個(gè)過(guò)度自噬的表達(dá)水平。自噬激活途徑的相關(guān)蛋白在上述實(shí)驗(yàn)皆被證明,但是自噬在正常生理狀況下存在平衡,即自噬的發(fā)生過(guò)程由自噬的激活和自噬的抑制加以調(diào)節(jié)平衡。換言之,自噬過(guò)程的任一方面失衡,自噬可能發(fā)生異常。本次實(shí)驗(yàn)同樣探討了機(jī)體內(nèi)選擇性抑制自噬進(jìn)程的部分指標(biāo),即經(jīng)典的P62指標(biāo)。P62的低水平表達(dá)意味著自噬激活或大量產(chǎn)生[25]。本研究結(jié)果中,HIE組乳鼠損傷側(cè)腦部提取的皮質(zhì)蛋白中,Atg5、beclin-1和LC3-II/-I的蛋白表達(dá)水平均明顯升高且伴P62下降,提示HIE造模后,腦組織內(nèi)過(guò)度自噬的病理改變?cè)斐山M織結(jié)構(gòu)大量破壞。同樣,本研究中采用PC12細(xì)胞代替神經(jīng)元,主要由于該細(xì)胞的分化型不僅結(jié)構(gòu)上類似神經(jīng)元而且具有神經(jīng)元特性。既往研究指出,與原代神經(jīng)元的體外藥物試驗(yàn)相比,分化型PC12細(xì)胞不僅在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與原代神經(jīng)細(xì)胞相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果或趨勢(shì),而且培養(yǎng)周期與培養(yǎng)成本低,可以替代動(dòng)物預(yù)測(cè)人體藥物反應(yīng)[26]。同樣,國(guó)內(nèi)外研究中在探討神經(jīng)毒性及神經(jīng)保護(hù)等方面,利用分化型PC12細(xì)胞代替動(dòng)物原代神經(jīng)細(xì)胞同樣得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[27]。PC12細(xì)胞經(jīng)氯化鈷處理后,其MDC熒光水平極高,反映細(xì)胞內(nèi)過(guò)度自噬。神經(jīng)元內(nèi)發(fā)生大量的自噬影響細(xì)胞整體狀態(tài),包括氧化應(yīng)激在缺氧情況的大量激活,推動(dòng)二次損傷或自噬的進(jìn)一步加強(qiáng)(過(guò)度自噬)以及凋亡水平逐漸增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平升高;TMRE熒光染色降低,反映凋亡水平升高[28]。因此,以上動(dòng)物和細(xì)胞模型均顯示自噬相關(guān)指標(biāo)顯著升高,存在過(guò)度自噬。

    然而,乳鼠預(yù)給藥鞣花酸后,與HIE組相比,TTC染色顯示損傷側(cè)半腦梗死面積減少,HE染色可見(jiàn)腦部結(jié)構(gòu)大體保持完整。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)給藥鞣花酸在早期能減輕缺氧環(huán)境對(duì)神經(jīng)元的損傷,我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。神經(jīng)元在缺氧環(huán)境下,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平提高。以往研究已經(jīng)證明,作為自噬上游激動(dòng)因子之一,氧化應(yīng)激主要發(fā)生在損傷或功能異常線粒體[29-30]。因此,線粒體功能檢測(cè)在本研究中至關(guān)重要,而且線粒體膜電位的檢測(cè)是線粒體結(jié)構(gòu)或功能完整性最為直接的反映[31]。同時(shí),TMRE指標(biāo)與凋亡初期水平相關(guān),TMRE降低,提示凋亡水平上升。在本研究中,鞣花酸的預(yù)處理不僅降低氯化鈷處理的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,同時(shí)降低了凋亡水平。在自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)方面,鞣花酸預(yù)處理的腦部皮質(zhì)蛋白與PC12細(xì)胞的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。鞣花酸預(yù)處理后,蛋白P62表達(dá)水平提高,提示抑制自噬產(chǎn)生的作用增強(qiáng),同時(shí)蛋白beclin-1表達(dá)水平降低,兩者均提示自噬水平降低。另外,Atg5是參與自噬調(diào)控的重要成分,它與Atg12、Atg16是形成自噬小體的關(guān)鍵成分,自噬小體是自噬發(fā)生較為直觀的反映[32]。鞣花酸處理后,在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)蛋白Atg5表達(dá)水平明顯降低,同時(shí)該組PC12細(xì)胞的MDC熒光數(shù)值降低,兩者提示自噬小體產(chǎn)生減少及自噬強(qiáng)度下降。最后,蛋白LC3-II/-I表達(dá)情況的比值作為自噬途徑的經(jīng)典指標(biāo),也在本研究中被納入檢測(cè)。相較于正常組,在氯化鈷組中蛋白LC3-II/-I表達(dá)情況的比值明顯升高,提示該組自噬的高強(qiáng)度,同樣,鞣花酸預(yù)處理后的PC12細(xì)胞的蛋白LC3-II/-I表達(dá)情況的比值降低,提示自噬強(qiáng)度下調(diào)。以上結(jié)果均提示鞣花酸預(yù)處理后對(duì)神經(jīng)元具有良好的保護(hù)效果。

    綜上所述,本研究從在體和細(xì)胞2個(gè)水平,初步證實(shí)了鞣花酸具有對(duì)抗缺氧缺血性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。鞣花酸可能通過(guò)降低神經(jīng)元內(nèi)過(guò)分自噬的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用。鞣花酸為天然提取成分,毒性小,因此,將鞣花酸用于治療新生兒缺氧缺血性腦病,具有一定的臨床應(yīng)用前景。

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