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    Twist通過(guò)ERK通路對(duì)體外鼻咽癌細(xì)胞血管生成的影響*

    2019-02-28 09:13:00孫旭鴦
    中國(guó)病理生理雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:小管培養(yǎng)箱鼻咽癌

    孫旭鴦, 陳 湧

    (1浙江省麗水市中心醫(yī)院耳鼻喉科, 浙江 麗水 323000; 2岳陽(yáng)市二人民醫(yī)院胃腸外科, 湖南 岳陽(yáng) 414000)

    鼻咽癌作為一種好發(fā)于鼻咽部咽隱窩和頂前壁黏膜上皮的惡性腫瘤,其病因和遺傳易感性、EB病毒及環(huán)境污染等因素密切相關(guān)。早期鼻咽癌缺乏典型臨床癥狀,同時(shí)鼻咽癌的血供極為豐富,早期就可能發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致鼻咽癌患者的預(yù)后較差。目前尚未鑒定出與鼻咽癌特異性較高的癌基因和抑癌基因,導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)病機(jī)制仍不明確[1-2]。因此,尋找鼻咽癌特異性分子標(biāo)志并從基因水平上抑制促癌基因的表達(dá)或者上調(diào)抑癌基因的表達(dá),可能對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展起抑制作用。

    Twist轉(zhuǎn)錄因子作為主要由胎盤和中胚層組織分泌的細(xì)胞因子,在胎兒時(shí)期呈高表達(dá),出生后在正常組織中表達(dá)含量極低,其不僅在胚胎發(fā)育成熟過(guò)程中扮演著重要角色,同時(shí)在誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和組織塑性過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。在研究Twist與惡性腫瘤的關(guān)系中發(fā)現(xiàn),Twist在鼻咽癌、食管癌、骨肉瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織均明顯升高[5-7];進(jìn)一步分析Twist與惡性腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系中發(fā)現(xiàn),Twist可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附因子、促血管生成因子和金屬基質(zhì)蛋白酶等腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和脈管生成等過(guò)程,利于腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。通過(guò)聚類分析和芯片雜交等技術(shù)研究胚胎干細(xì)胞發(fā)育與血管分化的關(guān)系中發(fā)現(xiàn),Twist可能參與了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、ANG1、PDGF等基因的調(diào)控,從而在血管生成(angiogenesis)過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[8]。既往研究已經(jīng)表明Twist參與多種惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為,目前尚未有Twist與鼻咽癌細(xì)胞血管生成的研究見(jiàn)諸報(bào)道,為此,本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)特異性沉默Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),探討Twist對(duì)體外鼻咽癌細(xì)胞血管生成的影響及其可能作用機(jī)制,為鼻咽癌血管靶向治療提供新的臨床參考。

    材 料 和 方 法

    1 試劑和材料

    DMEM高糖培養(yǎng)基、無(wú)血清Opti-MEMI培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購(gòu)自Gibco;空載體pEGFP和Twist沉默載體pEGFP-siTwist購(gòu)自北京合生基因科技有限公司;Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購(gòu)自Thermo;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司;cDNA第一鏈合成試劑盒和RT Master Mix熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa;Twist和GAPDH的上、下游引物由上海英濰捷基公司合成;CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購(gòu)自Corning;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD;抗Twist和β-actin抗體購(gòu)自Abcam;抗p-JNK、JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38和VEGF抗體購(gòu)自Epitomics;JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059和p38通路抑制劑SB203580購(gòu)自Sigma。

    2 細(xì)胞培養(yǎng)

    人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,細(xì)胞均使用含20%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,細(xì)胞培養(yǎng)箱調(diào)整溫度為37 ℃,二氧化碳濃度為5%,將細(xì)胞懸液接種于60 mL斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,內(nèi)盛10 mL完全培養(yǎng)基,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)方式為單層貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)3 d后即可生長(zhǎng)至80%~90%瓶底面積,然后使用含EDTA胰酶進(jìn)行消化,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)操作。

    3 實(shí)驗(yàn)方法

    3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為5×109/L,將細(xì)胞懸液接種至6孔板中,每孔100 μL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,將細(xì)胞分為TwistsiRNA+Lipofectamine 2000組(siTwist組)、陰性對(duì)照(negative control, NC)+Lipofectamine 2000組(NC組)和空白對(duì)照(blank control, BC)組,按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    3.2Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) CNE2細(xì)胞提取蛋白后經(jīng)按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白,每份樣品使用20 μg蛋白質(zhì),使用10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,在4 ℃下使用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜,硝酸纖維素膜經(jīng)I抗和II抗反應(yīng)后滴加新鮮配置的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

    3.3Real-time PCR檢測(cè)Twist mRNA的表達(dá) CNE2細(xì)胞經(jīng)TRIzol作用后提取細(xì)胞總 RNA,利用紫外分光光度儀檢測(cè)稀釋好的RNA標(biāo)本的吸光度(A)值,設(shè)定波長(zhǎng)為260 nm和280 nm,計(jì)算A260/A280比值為1.8~2.1之間。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按real-time PCR說(shuō)明書配制反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為: 50 ℃ 2 min; 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s、80 ℃ 15 s,讀板后重復(fù)44個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。Twist上游引物為5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3’,下游引物為 5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3’;GAPDH上游引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線中繪制的各個(gè)樣本的拷貝數(shù),以測(cè)定的Twist表達(dá)量與GAPDH表達(dá)量的比值作為基準(zhǔn)來(lái)校準(zhǔn)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    3.4收集鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM) 將CNE2細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中,加入適量完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用移液器吸去原培養(yǎng)基,用PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次,再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基20 mL,放置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h后收集上清液,以2 500 rpm速度下常溫離心5 min,將上清液用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后,保存于4 ℃冰箱中。

    3.5HUVECs與CM共培養(yǎng) 將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)瓶中,加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用移液器吸去原培養(yǎng)基,用PBS緩沖液反復(fù)沖洗2次,加入CM培養(yǎng)24 h。

    3.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將HUVECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,加入適量完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用胰酶消化并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,并調(diào)整濃度為5×107/L,將細(xì)胞懸液接種至96孔板中,每孔100 μL,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,在結(jié)束前1 h將10 μL的CCK-8溶液加入96孔板中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h后立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A值,設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm,同時(shí)設(shè)空白調(diào)零組(不加細(xì)胞僅加等量培養(yǎng)基)。

    3.7Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel均勻鋪被到Transwell上室底部,待Matrigel完全凝固后,小心取出上室中殘余液體,再加入50 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。調(diào)整HUVECs濃度1×108/L,將200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室中,同時(shí)在Transwell下室中添加500 μL含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,然后將Transwell小室放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將放置培養(yǎng)箱中孵育24 h的Transwell小室取出,去除上室及下室中的培養(yǎng)基,用棉棒小心擦去小室底膜上的細(xì)胞,將Transwell上室放置在10%甲醇溶液中固定20 min,用PBS液清洗3遍后再用結(jié)晶紫溶液染色15 min。將Transwell上室自結(jié)晶紫溶液中取出后,使用PBS溶液清洗3遍,將Transwell上室置于載物片上,放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照,在高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野拍照并采集圖像。

    3.8小管形成實(shí)驗(yàn) 將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel放置4℃冰箱過(guò)夜預(yù)冷,待其變成膠凍狀,以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel,將250 μL稀釋后的Matrigel加入24孔板中,再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,至Matrigel凝固。調(diào)整HUVECs濃度為2×105/L,將0.1 mL細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔板中,再放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜,最后在倒置顯微鏡下觀察小管形成狀況,利用ImageJ 1.51f軟件對(duì)管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量進(jìn)行定量分析[9]。

    3.9JNK、ERK和p38信號(hào)通路抑制劑對(duì)HUVECs小管形成的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置NC組、siTwist組、siTwist+SP600125組、siTwist+PD98059組和siTwist+SB203580組,NC組和siTwist組CNE2細(xì)胞添加PBS作用2 h,后3組分別用10 μmol/L的JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059和p38通路抑制劑SB203580作用CNE2細(xì)胞2 h,提取各組細(xì)胞CM,按照3.8方法檢測(cè)HUVECs小管形成,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有本次實(shí)驗(yàn)所得的計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,率的比較用卡方檢驗(yàn),采用SNK-q法分析總體及總體中兩樣本均數(shù)之間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 Real-time PCR和Western blot檢測(cè)Twist siRNA的干擾效率

    將空載體和Twist沉默載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞48 h后,提取各組CNE2細(xì)胞總RNA進(jìn)行real-time PCR以檢測(cè)Twist mRNA的相對(duì)表達(dá)量,NC組和BC組CNE2細(xì)胞中Twist mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.84±0.07和0.87±0.08,與siTwist組(0.17±0.02)相比較顯著升高(P<0.01),而NC組和BC組之間相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot檢測(cè)Twist蛋白在siTwist組CNE2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為2.32±0.16,與僅轉(zhuǎn)染空載體的CNE2細(xì)胞(6.51±0.52)和BC組細(xì)胞(6.94±0.65)相比較顯著降低(P<0.01),NC組和BC組之間相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖1。

    2 沉默Twist基因?qū)UVECs體外活力的影響

    為評(píng)估干擾Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)后對(duì)體外HUVECs活力的影響,分別提取NC組、BC組和siTwist組CNE2細(xì)胞CM,通過(guò)CCK-8法對(duì)HUVECs活力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,HUVECs經(jīng)siTwist組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后,A值為0.53±0.13,而HUVECs經(jīng)NC組和BC組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后A值分別為1.49±0.35和1.37±0.24,siTwist組與NC組和BC組相比較顯著降低(P<0.01),表明沉默Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)可顯著抑制HUVECs活力。

    Figure 1.Knockdown ofTwistwas analyzed by Western blot assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

    圖1Westernblot檢測(cè)Twist蛋白在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)水平

    3 干擾Twist基因的鼻咽癌細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs侵襲能力的影響

    在體外CNE2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染siTwist和空載體后,提取各組細(xì)胞CM,HUVECs經(jīng)CM作用24 h后進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HUVECs經(jīng)siTwist組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后侵襲出Matrigel的細(xì)胞數(shù)較NC組和BC組顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖2。

    4 干擾Twist基因的鼻咽癌細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs小管形成的影響

    利用小管形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)干擾Twist基因的鼻咽癌細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs的體外血管生成能力,結(jié)果顯示,HUVECs在體外Matrigel基質(zhì)環(huán)境中生長(zhǎng)12 h后,細(xì)胞逐漸向兩端延長(zhǎng)呈梭形,同時(shí)細(xì)胞延長(zhǎng)端開(kāi)始在Matrigel膠中伸展,相鄰細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。HUVECs經(jīng)siTwist組CNE2細(xì)胞所提取的CM作用24 h后體外小管形成數(shù)較NC組和BC組顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖3。

    Figure 2.The effect ofTwistsilencing on the invasive ability of HUVECsinvitro(×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

    圖2Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默Twist對(duì)HUVECs侵襲能力的影響

    Figure 3.The effect ofTwistsilencing on the tube formation of HUVECsinvitro(×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

    圖3小管形成實(shí)驗(yàn)觀察沉默Twist對(duì)HUVECs小管形成的影響

    5 Twist對(duì)CNE2細(xì)胞中p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF表達(dá)的影響

    分別轉(zhuǎn)染空載體和siTwist至CNE2細(xì)胞后,通過(guò)Western blot檢測(cè)p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示,siTwist組CNE2細(xì)胞的ERK磷酸化水平明顯高于NC組和BC組,而VEGF蛋白水平明顯低于NC組和BC組(P<0.01);下調(diào)Twist在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)p-p38和p-JNK的表達(dá)無(wú)明顯影響,見(jiàn)圖4。

    Figure 4.The protein levels of p-ERK, p-p38, p-JNK and VEGF were assessed by Western blot analysis in the CNE2 cells after transfected with negative control (NC), blank control (BC) and siTwist. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

    圖4Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染siTwist對(duì)CNE2細(xì)胞中p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF表達(dá)的影響

    6 ERK、JNK和p38信號(hào)通路抑制劑對(duì)HUVECs體外小管形成的影響

    NC組、siTwist組、siTwist+PD98059組、siTwist+SP600125組和siTwist+SB203580組CNE2細(xì)胞所提取CM作用HUVECs后,HUVECs體外小管形成數(shù)分別為48.3±4.2、22.7±3.6、39.1±4.7、25.6±3.3和27.5±2.8。與NC組相比,siTwist組HUVECs體外小管形成數(shù)顯著減少(P<0.01);與siTwist組相比,siTwist+PD98059組顯著升高(P<0.05);而siTwist組與siTwist+SP600125組或siTwist+SB203580組相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖5。

    討 論

    Twist作為定位于人類7號(hào)染色體的基因,編碼由202個(gè)氨基酸組成的Twist蛋白。Twist蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)家族成員,首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn),這種蛋白在果蠅中胚層的發(fā)育和誘導(dǎo)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Twist在多種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào),Twist可通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)換,從而在細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和血管新生中起到重要調(diào)控作用。目前關(guān)于Twist在實(shí)體瘤中的表達(dá)以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究已有較多見(jiàn)諸報(bào)道,但Twist與腫瘤血管新生的相關(guān)性研究較少,尤其是在鼻咽癌中[6-8]。

    血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)側(cè)的一層扁平上皮細(xì)胞,在機(jī)體各臟器中分布廣泛,血管內(nèi)皮細(xì)胞作為組織和血液間的第一道屏障,在細(xì)胞炎癥信號(hào)、切應(yīng)力和激素水平等信號(hào)的作用下,可分泌多種血管活性物質(zhì),從而調(diào)節(jié)血液穩(wěn)態(tài)、新生血管形成和組織再生等作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞已成為在機(jī)體多種病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的重要器官。腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織形態(tài)、增生方式和免疫學(xué)特征等方面和正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞存在較大差異,腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為順應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的需要,在腫瘤細(xì)胞分泌的多種促血管生長(zhǎng)因子的作用下,腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力、侵襲能力以及新生血管能力均得到不同程度增強(qiáng),以適應(yīng)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的需要。為此,根據(jù)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn),靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞治療應(yīng)運(yùn)而生,有效抑制包括鼻咽癌在內(nèi)的腫瘤新生血管形成,可有效抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移,從而改善惡性腫瘤患者預(yù)后[10-11]。在本研究中,將Twist沉默載體轉(zhuǎn)染至體外CNE2細(xì)胞,并通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)Twist沉默載體可顯著下調(diào)Twist mRNA和蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá),并獲取干擾Twist基因后鼻咽癌細(xì)胞特定培養(yǎng)基,并用該特定培養(yǎng)基作用體外HUVECs,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活力、侵襲能力和血管新生能力進(jìn)行了進(jìn)一步研究。首先,我們利用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析干擾Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)后對(duì)體外HUVECs活力的影響,結(jié)果表明,沉默CNE2細(xì)胞中Twist的表達(dá)后可有效抑制體外HUVECs活力,從而表明Twist在HUVECs體外生長(zhǎng)中發(fā)揮了一定作用。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,沉默Twist的表達(dá)后可有效抑制體外HUVECs侵襲行為。另外通過(guò)小管形成實(shí)驗(yàn)?zāi)MHUVECs體外血管形成,在體外Matrigel基質(zhì)環(huán)境中生長(zhǎng)12 h后,細(xì)胞逐漸向兩端延長(zhǎng)呈梭形,同時(shí)細(xì)胞延長(zhǎng)端開(kāi)始在Matrigel中伸展,相鄰細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu),低表達(dá)Twist基因的CNE2細(xì)胞上清液可明顯抑制體外HUVECs體外小管形成,從而表明Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平在體外鼻咽癌細(xì)胞促進(jìn)血管新生行為中也發(fā)揮了一定作用,提示Twist可能在鼻咽癌體外血管新生的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)功能,應(yīng)該被視為鼻咽癌潛在的一個(gè)新的靶向作用位點(diǎn)。

    Figure 5.Analysis of the tube formation of HUVECs treated with CM from CNE2 cells in siTwist, siTwist+PD98059, siTwist+SP600125 and siTwist+SB203580 groups (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

    圖5小管形成實(shí)驗(yàn)觀察ERK、p38和JNK信號(hào)通路抑制劑對(duì)HUVECs體外小管形成的影響

    ERK作為一種脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶,主要位于細(xì)胞漿中,在諸如生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子、高糖和缺氧等刺激后作用下被激活,激活后ERK可進(jìn)入細(xì)胞核中,進(jìn)一步激活NF-κB及P70核蛋白體S6激酶,使得相鄰脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。磷酸化ERK在介導(dǎo)信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,p-ERK可激活STATs、c-Myc、Jun、ELK-1、ATF2和Max等轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子各自靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程產(chǎn)生影響,最終對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和増殖等多種生理學(xué)功能發(fā)揮調(diào)控作用[12-14]。SP600125作為ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性抑制劑,可通過(guò)阻斷Raf 對(duì)ERK的磷酸化從而進(jìn)一步阻斷下游信號(hào)通路。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子作為一種在可由正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子,VEGF在正常組織細(xì)胞中呈低水平表達(dá),且表達(dá)水平較為恒定,但其在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞新生的最重要調(diào)節(jié)因子。有研究表明,VEGF在惡性腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與腫瘤肝轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)性,同時(shí)與惡性腫瘤患者的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)。VEGF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與ERK磷酸化水平關(guān)系密切,重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可通過(guò)ERK信號(hào)通路上調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤組織中血管生長(zhǎng)[15]。在本研究中,下調(diào)Twist在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)可促進(jìn)CNE2細(xì)胞中ERK的磷酸化水平,同時(shí)下調(diào)VEGF的表達(dá),但對(duì)JNK和p38的表達(dá)無(wú)明顯影響,而進(jìn)一步使用ERK信號(hào)通路特異性抑制劑作用后發(fā)現(xiàn),SP600125可部分阻斷沉默Twsit對(duì)體外HUVECs小管形成的抑制作用,使用JNK和p38通路抑制劑卻沒(méi)有觀察到這種抑制作用,從而表明Twist可能調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路,影響VEGF的表達(dá)從而在體外血管新生過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。

    綜上所述,Twist可通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路的激活而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞對(duì)體外內(nèi)皮細(xì)胞活力、侵襲和小管形成的作用,表明Twist可能在鼻咽癌血管新生中扮演了重要角色。Twist有望成為治療鼻咽癌新的作用靶點(diǎn),后續(xù)會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證及探討。

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