滅菌方法和培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)沙氏鹿茸草種子發(fā)芽的影響

郎曉平，孫健，沈曉霞，江建銘，王志安

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

沙氏鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch.)為玄參科鹿茸草屬多年生草本植物，廣泛分布于我國華南地區(qū)的浙江、江西、湖南、貴州等省份。全草入藥，具有清熱解毒之功效，常用于感冒、咳嗽、赤痢、便血、風(fēng)濕骨痛、牙痛和乳癰等癥的治療，收錄于浙江省炮制規(guī)范。目前，有關(guān)研究主要集中于沙氏鹿茸草的有效成分分析[1-3]、種子的去休眠[4]、組培苗的愈傷誘導(dǎo)與培養(yǎng)[5-6]等方面。沙氏鹿茸草的組培滅菌方法主要為消毒液滅菌，如用升汞、NaClO溶液和乙醇處理蒴果。然而，成熟的沙氏鹿茸草蒴果容易開裂，即使未開裂的蒴果經(jīng)4 ℃儲(chǔ)藏1個(gè)月后變得脆而硬，后續(xù)的接種操作困難，因此，探索了剝離種子氣體滅菌的方法。愈傷組織誘導(dǎo)和組培苗培養(yǎng)是優(yōu)異沙氏鹿茸草種苗快速繁育的重要手段，已有的研究均以成熟植株?duì)I養(yǎng)體器官誘導(dǎo)愈傷組織，存在污染率高、成活率低、愈傷組織誘導(dǎo)率低等問題，為此，作者探索了無菌種苗的組培條件，以便為后續(xù)的幼苗愈傷組織的誘導(dǎo)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

未完全成熟的沙氏鹿茸草種子，2017年6月19日采集于浙江省麗水市縉云縣的同一自然群體，并于4 ℃冰箱保存。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 氣體滅菌

將沙氏鹿茸草的蒴果剪開，剝離蒴果內(nèi)種子。種子用濾紙包裹，置于5 L密封皿中，取5%NaClO溶液80 mL于100 mL燒杯中，加入3 mL濃鹽酸，分別處理1、2、3和4 h。處理后的種子，接種于含有20 g·L-1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種20粒種子，于25 ℃、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx、光照12 h的條件下培養(yǎng)。接種后21 d統(tǒng)計(jì)沙氏鹿茸草種子的萌發(fā)和染菌情況。

1.2.2 基質(zhì)設(shè)置

設(shè)置7種培養(yǎng)基組別(表1)進(jìn)行試驗(yàn)。氯氣滅菌3 h，接種后至28 d記錄不同培養(yǎng)基上沙氏鹿茸草種子的萌發(fā)和染菌情況。

1.2.3 抑菌劑處理

選取腈菌唑?yàn)樯呈下谷撞莸囊志鷦?，以控制接種染菌率，同時(shí)考查不同濃度腈菌唑?qū)ι呈下谷撞莘N子萌發(fā)與生長的影響。在20 g·L-1蔗糖的1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加25%的腈菌唑，最終濃度分別為0(CK)、50(A)、100(B)、200(C)、300 μL·L-1(D)，氯氣滅菌3 h后接種，接種后的18和23 d觀察種子的發(fā)芽率與污染率，其他試驗(yàn)方法同1.2.1節(jié)。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

污染率=污染瓶數(shù)/總瓶數(shù)×100%；發(fā)芽率為隨機(jī)選取12瓶未污染的組培瓶，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和相關(guān)性狀。使用SPSS 18.0軟件(IBM，USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理間差異性分析使用最小顯著差數(shù)法(LSD)，P≤0.05為顯著水平。

表1 不同培養(yǎng)基組別的組成

2 結(jié)果與分析

2.1 氯氣滅菌體系優(yōu)化

表2所示，隨著氯氣處理時(shí)間的延長，沙氏鹿茸草種子的組培污染率明顯降低，處理3 h污染率下降至15.0%。隨氯氣處理時(shí)間加長，沙氏鹿茸草發(fā)芽率呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，處理間差異顯著，說明氯氣對(duì)沙氏鹿茸草種子具有一定毒害作用。本試驗(yàn)體系下，氯氣處理3 h是較優(yōu)的滅菌方案，具有較高的發(fā)芽率，并且可以較好地控制污染率。

表2 不同氯氣處理時(shí)間的種子發(fā)芽率和污染率

注：同列無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P≤0.05)。表3～5同。

2.2 基質(zhì)對(duì)沙氏鹿茸草種子發(fā)芽的影響

接種后3～7 d，染菌現(xiàn)象開始出現(xiàn)，7 d后染菌現(xiàn)象不再增加。土壤基質(zhì)經(jīng)過滅菌后仍然具有較高的污染率(表3)，該現(xiàn)象可能與土壤基質(zhì)富含有機(jī)質(zhì)、滅菌不徹底有關(guān)。接種后12 d，Z1、Z2、Z3、Z1、Z2組均萌發(fā)長出2片幼葉，而CK與S組萌發(fā)較慢，多數(shù)種子僅種皮開裂，未長出綠色葉片。接種后14 d，各組處理多數(shù)種子萌發(fā)，并長出1條主根及2片嫩綠色葉片，苗高2.8～4.9 mm(表4)，根長2～4 mm，S組種子萌發(fā)較少，未萌發(fā)的種子多數(shù)有發(fā)芽跡象。接種后21 d，各組種子均完成萌發(fā)，開始進(jìn)入生長階段，未萌發(fā)的種子無萌發(fā)跡象，不會(huì)再萌發(fā)。接種后28 d，已萌發(fā)的種子開始長出4片綠葉，葉片顏色加深，形狀變大且更為細(xì)長，苗高7.4～12.5 mm。

表3 不同培養(yǎng)基組別的種子發(fā)芽特征

從表3看出，CK、T1、S組的發(fā)芽率顯著低于Z1、Z2、Z3、T2的發(fā)芽率，其中S組(土壤處理)發(fā)芽率最低。Z3與T2的發(fā)芽率較高，而T2、Z1、Z2、Z3之間發(fā)芽率無顯著差異，初步證明蔗糖對(duì)沙氏鹿茸草的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，活性炭不影響種子萌發(fā)。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到30 g·L-1，污染率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，同時(shí)，活性炭能在一定程度上減少培養(yǎng)基的污染。由表4可知，土壤組生長最為緩慢，加入蔗糖的Z1、Z2、Z3、T2組生長顯著快于CK、T1、S組，T2組幼苗顯著高于其他處理。

表4 不同培養(yǎng)基組別的幼苗發(fā)育特征

2.3 抑菌劑對(duì)沙氏鹿茸草種子發(fā)芽的影響

分別在接種后18與23 d觀察沙氏鹿茸草種子的發(fā)芽率與污染率，結(jié)果(表5)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)污染率沒有變化。

從表5可知，隨著腈菌唑濃度的增加，沙氏鹿茸草的發(fā)芽率有下降的趨勢(shì)，CK組的發(fā)芽率為66.0%。未加腈菌唑組多數(shù)在12～14 d發(fā)芽，而加入腈菌唑后發(fā)芽時(shí)間明顯推遲，尤其是腈菌唑濃度為300 μL·L-1的D組，發(fā)芽時(shí)間推遲到接種后20 d 左右，說明腈菌唑?qū)τ谏呈下谷撞莸拿劝l(fā)有抑制作用。腈菌唑的添加使得鹿茸草的染菌情況有所抑制，污染率隨腈菌唑濃度的上升而下降，兩者呈負(fù)相關(guān)，但其抑菌效果并不突出，與對(duì)照組無顯著差異。從苗高的數(shù)據(jù)可以看出，腈菌唑處理對(duì)幼苗生長有明顯抑制作用，表現(xiàn)為生長受抑制，苗高顯著降低，且葉片變小、顏色加深。因此，培養(yǎng)基中添加腈菌唑不能起到顯著的抑菌作用，反而會(huì)抑制種子的萌發(fā)和幼苗的生長。

表5 不同濃度腈菌唑處理組別的種子發(fā)芽率和污染率

3 小結(jié)與討論

為防止沙氏鹿茸草蒴果成熟后開裂，供試種子在未完全成熟時(shí)采收，會(huì)存在部分未成熟種子，因此沙氏鹿茸草的種子發(fā)芽率在80%左右。目前，外植體和種子滅菌方法主要是液體滅菌和氣體滅菌，具體包括升汞、次氯酸鈉和氯氣處理等。已有研究表明，氯氣滅菌對(duì)種子的毒害作用較小[7]。本試驗(yàn)體系下，氯氣滅菌后發(fā)芽率下降至60%～70%，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。沙氏鹿茸草發(fā)芽培養(yǎng)基質(zhì)的研究表明，蔗糖和MS培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)有利于種子的萌發(fā)和生長[8]，且20 g·L-1以上的蔗糖濃度才能保證沙氏鹿茸草的快速生長。腈菌唑是廣譜殺菌劑，熱穩(wěn)定性較好，可以抑制真菌麥角甾醇的生物合成，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)子囊菌、擔(dān)子菌等均具有較好的防治效果，常用于種子包衣劑[9]。本試驗(yàn)中，高濃度的腈菌唑?qū)τ谏呈下谷撞萦酌绫憩F(xiàn)出明顯的毒害作用，300 μL·L-1處理的污染率為13.3%。一方面，一個(gè)組培瓶中只要有一粒種子滅菌不完全就會(huì)導(dǎo)致真菌或細(xì)菌污染；另一方面，該現(xiàn)象可能是由無法徹底滅菌的種子內(nèi)生菌引起[10]，長勢(shì)強(qiáng)壯的T2和Z3組具有較低的污染率可以間接證明這一推測(cè)[11]。綜上所述，經(jīng)過氯氣滅菌3 h后，20 g·L-1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基可以滿足沙氏鹿茸草的萌發(fā)和生長需求。