超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肝中3種β-受體激動(dòng)劑殘留

沈東強(qiáng)，劉標(biāo)

(湖州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量管理站，浙江 湖州 313000)

β-受體激動(dòng)劑是一類人工合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，又稱“瘦肉精”，能夠促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)、抑制動(dòng)物脂肪生長(zhǎng)[1-3]。β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物性食品中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)嚴(yán)重影響人類健康。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第196號(hào)和235號(hào)公告均禁止β-受體激動(dòng)劑類藥物作為飼料添加劑用于畜牧業(yè)。

目前，有關(guān)報(bào)道的動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)的方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7-9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)[10-13]。ELISA法無法精準(zhǔn)定量，GC-MS法需要衍生，步驟繁瑣，且不適用于多種目標(biāo)物的同時(shí)測(cè)定，HPLC-MS/MS法無需衍生、檢出限低、靈敏度高，但前處理過程比較復(fù)雜。本文在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了前處理步驟，采用島津超高效液相色譜儀(LC-30A)和三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(LCMS-8050)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定β-受體激動(dòng)劑藥物殘留，分析準(zhǔn)確，效率高，為當(dāng)前β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)領(lǐng)域提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀、LCMS-8050三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；N-EVAP氮吹儀，美國(guó)Organomation公司； T25勻漿儀，德國(guó)IKA公司；SKY-110WX水浴搖床，廣州滬瑞明儀器有限公司；MS1渦漩式混合器，上海珂淮儀器有限公司。

甲醇(色譜純)，甲酸(色譜純)，水(超純水)，Oasis MCX陽離子交換柱(60 mg·(3 mL-1))?？藗愄亓_、萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99%，萊克多巴胺-D3購(gòu)自加拿大CDN isotopes公司，純度≥98%。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別為克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇。用甲醇配制成1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18 ℃避光保存。臨用時(shí)，用0.1%甲酸水溶液將1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液依次稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg·L-1濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

同位素內(nèi)標(biāo)物分別為克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3。用甲醇配制成100 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存。臨用時(shí)，用0.1%甲酸水溶液將100 μg·mL-1混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確至0.01 g)經(jīng)搗碎的豬肝樣品于50 mL離心管中，加入250 μL 100 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)液和8 mL 0.2 mol·L-1pH值5.2乙酸銨溶液，充分混勻，再加入50 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液，振蕩混勻后，37 ℃水浴水解16 h后取出冷卻，10 000 r·min-1離心5 min，取出上清液，下層溶液中加入8 mL 0.1 mol·L-1高氯酸溶液，振蕩提取2 min，10 000 r·min-1離心5 min，合并2次上清液，混勻，待凈化。

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX固相萃取柱，然后取上清液過柱，棄去濾液，再依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，棄去濾液，最后用2.5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45 ℃氮吹吹至近干，用0.1%甲酸水溶液定容至5 mL，漩渦混勻1 min，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.9 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積10 μL。

梯度洗脫，B相初始濃度3%，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI+)，離子源接口電壓4 kV，霧化氣為氮?dú)?3.0 L·min-1)，干燥氣為氮?dú)?10 L·min-1)，碰撞氣為氬氣，脫溶劑管溫度250 ℃，加熱模塊溫度400 ℃，接口溫度300 ℃，噴霧針距離1.0 mm，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，駐留時(shí)間100 ms，MRM 參數(shù)見表2。

表 2 MRM 參數(shù)

注：*表示定量離子對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

將濃度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

2.2 精密度

配制0.2、0.5、5.0 μg·L-1濃度β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定6次，3種化合物的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.018 0%～0.089 7%和0.67%～3.41%，結(jié)果表明儀器精密度良好(表4)。

表4 重復(fù)測(cè)定的精密度

2.3 靈敏度

配制0.1μg·L-1β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，根據(jù)S/N=3和10計(jì)算檢出限和定量限(表5)。

2.4 回收率

取豬肝樣品，添加3個(gè)濃度做回收實(shí)驗(yàn)，平行4次，結(jié)果顯示見表6。

表5 0.1μg·L-1 β-受體激動(dòng)劑的靈敏度實(shí)驗(yàn)

表6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

本研究建立了一種使用島津超高效液相色譜儀(LC-30A)和三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(LCMS-8050)聯(lián)用測(cè)定豬肝中3種β-受體激動(dòng)劑的方法?？疾炝思状己鸵译孀鳛榱鲃?dòng)相，甲醇分離度和靈敏度都高于乙腈；考察了PCX小柱和MCX小柱的凈化效果， MCX小柱能更大程度地去除雜質(zhì)，達(dá)到更好的凈化效果。綜上，通過方法驗(yàn)證，符合現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的要求，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，效率高，可用于動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的日常檢測(cè)。