循環(huán)miRNA-26a對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后對(duì)比劑腎病的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

對(duì)比劑腎病(contrast media induced nephropathy，CIN)是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)的一個(gè)重要并發(fā)癥[1]，出現(xiàn)CIN的病人發(fā)生后期心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)較無CIN的病人更高，CIN會(huì)導(dǎo)致與時(shí)間相關(guān)的腎臟損傷[2]，早期診斷對(duì)于病人至關(guān)重要，現(xiàn)在CIN通常采用血管內(nèi)給予造影劑后72 h內(nèi)血漿肌酐(serum creatinine，SCr)水平升高作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。然而，肌酐是CIN不可靠的指標(biāo)，因?yàn)樗悄I功能急性變化過程中的間接和不敏感指標(biāo)[3]。根據(jù)最近的一項(xiàng)薈萃分析顯示，血漿胱抑素C(cystatin C，CyC)可以準(zhǔn)確檢測(cè)腎臟疾病并進(jìn)行分期，是一個(gè)更好的生物標(biāo)志物，但是CyC只在對(duì)比劑暴露12 h后才增加[4]。一些新的生物標(biāo)志物，如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，在變化時(shí)間上優(yōu)于CyC，然而，這些新型生物標(biāo)志物對(duì)CIN的特異性仍不是很高，因?yàn)樗鼈兒苋菀资艿皆S多共存變量的影響[5]。因此，對(duì)CIN潛在的新型早期生物標(biāo)志物的研究仍然是最受關(guān)注的領(lǐng)域。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，可調(diào)控各種生物體和生理過程中的基因表達(dá)。組織特異性/富集的miRNA可以在正常狀態(tài)下發(fā)揮獨(dú)特的功能作用。它們?cè)谘獫{、尿液和其他體液中的表達(dá)模式與各種疾病密切相關(guān)，循環(huán)中的miRNA可以在血漿中以非常穩(wěn)定的形式輕易檢測(cè)到，表達(dá)譜具有巨大的潛力，可用作診斷和監(jiān)測(cè)人類疾病(如癌癥和組織損傷)的新型無創(chuàng)生物標(biāo)志物[6-7]。其中，miRNA-26a也涉及與腎病有關(guān)的途徑。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a主要在小鼠的腎小球以及其他物種(包括人)的腎小球中表達(dá)，miRNA-26a的表達(dá)降低與腎小球足細(xì)胞損傷的進(jìn)展密切相關(guān)[8]。本研究假設(shè)miRNA-26a可能在CIN期間釋放到循環(huán)中，并可用于檢測(cè)腎功能損傷，利用CIN大鼠模型[9]，探討CIN期間血漿和腎臟中miRNA-26a表達(dá)的變化，探究循環(huán)miRNA-26a作為疾病早期檢測(cè)CIN的潛在生物標(biāo)志物依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠CIN模型 將雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250～300 g)30只分為大鼠CIN組及大鼠對(duì)照組，各15只，大鼠禁水3 d，然后以10 mg/kg的劑量肌內(nèi)

注射呋塞米。大鼠CIN組以10 mL/kg的劑量通過尾靜脈在5 d的過程中使用非離子型低滲對(duì)比劑(contrast medium，CM)碘海醇(350 mg/mL； GE Healthcare，中國(guó)上海)，劑量為10 mL/(kg·min)。大鼠對(duì)照組給予等量的生理鹽水(normal saline，NS)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在83.3%的CIN大鼠中觀察到SCr增加≥25%[9]。組織病理學(xué)分析顯示，所有CIN大鼠均出現(xiàn)腎小管壞死和髓質(zhì)充血，表明這種方法可有效地誘導(dǎo)大鼠CIN，在CM/NS給藥后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h 獲取兩組大鼠外周血。重復(fù)構(gòu)建大鼠CIN模型，在CM/NS給藥后8 h獲取兩組大鼠主要器官(腎、心、肝、脾、肺、腦)的組織樣本。

1.2 臨床資料及血漿收集 選取2016年1月—2018年1月在我中心進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療并發(fā)生術(shù)后CIN的病人160例，其中術(shù)后出現(xiàn)CIN病人80例為病人CIN組，未出現(xiàn)CIN或其他并發(fā)癥病人80例為病人對(duì)照組，兩組年齡、性別、吸煙史、高血壓等臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：PCI術(shù)后SCr和CyC測(cè)量中病人出現(xiàn)SCr≥25%或CyC≥10%的相對(duì)增加。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期CM暴露(2 d內(nèi))，其他原因的腎損傷，進(jìn)行過透析，心搏驟停，SCr或CyC值缺失，妊娠或哺乳期女性。

所有病人均使用非離子型，低滲透壓CM和靜脈水化，水合的持續(xù)時(shí)間和體積由醫(yī)師決定。用于miRNA分析的血液樣品在CM暴露后4～6 h前瞻性收集，將外周血(5 mL)收集到含乙二胺四乙酸管(BD Vacutainer，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中，并在室溫下1 h內(nèi)處理。通過4 ℃離心10 min收集血漿，將其轉(zhuǎn)移至新鮮的不含RNase / DNase管中，在4 ℃以16 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中并儲(chǔ)存在-80 ℃環(huán)境中。在入院時(shí)和手術(shù)后24～48 h測(cè)量病人SCr和CyC。入組前，將研究方案詳細(xì)告知病人本人及家屬，并獲得知情同意，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)定量 PCR 使用TRIzol試劑提取待測(cè)血漿及組織的總RNA，隨后用75%乙醇代替異丙醇進(jìn)行RNA沉淀。使用NanoDrop 1 000分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量。以DBI Bestar qPCR RT試劑盒(DBI Bioscience，Ludwigshafen，德國(guó))將總計(jì)1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用7500 Fast Real-Time PCR，在以下條件進(jìn)行qRT-PCR：95 ℃溫育2 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95 ℃退火15 s，60 ℃ 60 s。miRNA-26a PCR引物由瑞博生物科技有限公司設(shè)計(jì)，序列如下：miRNA-26a 上游：5′-GTCATCTAGAAAGCTTGATGCAGGAAAGAGCTTTGG-3′，下游：5′-TGACAGATCTCAGCTGACATCCTCTAGGCTGGGGTT-3′；內(nèi)參U6，上游：5′- CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游：5′- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。使用2-ΔΔCt公式對(duì)miRNA進(jìn)行定量。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)病人依據(jù)血漿miRNA-26a相對(duì)表達(dá)中位數(shù)分為miRNA-26a高表達(dá)組(68例)以及低表達(dá)組(92例)。

1.4 CIN危險(xiǎn)因素評(píng)分 對(duì)入組病人進(jìn)行CIN危險(xiǎn)因素評(píng)分，采用Mehran評(píng)分系統(tǒng)[10]，Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分項(xiàng)目：低血壓(0分不存在或5分存在)，主動(dòng)脈內(nèi)球囊反搏(0分不存在或5分存在)，充血性心力衰竭(0分為不存在或5分存在)；年齡>75歲(如果是，評(píng)分為4分)，糖尿病(評(píng)分為0分或3分)；估算的腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)40～60mL /( min·1.73 m2)為2分；20～39 mL /( min·1.73 m2)為4分；<20 mL /( min·1.73 m2)為6分；預(yù)先存在的貧血(0分不存在或3分存在)和CM體積(每100 mL，1分)，Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為所有項(xiàng)目相加之和。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-26a在大鼠CIN模型及病人血漿中的表達(dá) miRNA-26a在大鼠CIN組的血漿及腎臟組織中的表達(dá)較大鼠對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miRNA-26a在PCI術(shù)后病人CIN組血漿中的表達(dá)也較病人對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。詳見表1。

組別樣本量血漿腎臟組織大鼠CIN組153.42±0.231)3.34±0.211)大鼠對(duì)照組150.98±0.101.03±0.09病人CIN組803.19±0.202)-病人對(duì)照組800.99±0.11-

1)與大鼠對(duì)照組比較，P<0.05；2)與病人對(duì)照組比較，P<0.05

2.2 miRNA-26a在CIN大鼠主要器官中的表達(dá) miRNA-26a在腎臟中出現(xiàn)明顯的高表達(dá)，在其余5種器官中表達(dá)水平明顯較低(P<0.05)。詳見表2。

部位miRNA-26a相對(duì)表達(dá)腎1.00±0.07心0.11±0.031)肝0.12±0.021)脾0.09±0.021)肺0.10±0.011)腦0.15±0.041)

與腎臟比較，1)P<0.05

2.3 血漿miRNA-26a在大鼠CIN模型構(gòu)建時(shí)的表達(dá) 大鼠CIN組血漿miRNA-26a表達(dá)在CM給藥后2 h出現(xiàn)明顯升高(P<0.05)，4 h時(shí)達(dá)到峰值，后逐漸回落，12 h時(shí)CIN組大鼠血漿miRNA-26a仍明顯高于大鼠對(duì)照組(P<0.05)。詳見表3。

組別 只數(shù)0 h2 h4 h8 h12 h24 h大鼠CIN組151.23±0.112.39±0.101)7.11±0.421)2)3.41±0.221)2)2.05±0.191)2)1.35±0.122)大鼠對(duì)照組151.22±0.131.26±0.121.24±0.101.20±0.091.29±0.121.30±0.12

與大鼠對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，1)P<0.05；與同組上一時(shí)間點(diǎn)比較，2)P<0.05

2.4 病人血漿miRNA-26a表達(dá)與Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分 miRNA-26a高表達(dá)組病人Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分明顯高于低表達(dá)組(P<0.05)，Mehran評(píng)分≥6分病人比例較低表達(dá)組明顯升高(P<0.05)，Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-26a表達(dá)與Mehran評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.372，P<0.05)。詳見表4。

表4 病人血漿miRNA-26a表達(dá)與Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分

與miRNA-26a低表達(dá)組比較，1)P<0.05

3 討 論v

循環(huán)miRNA在診斷人類疾病中具有巨大的潛力，有望成為新型微創(chuàng)生物標(biāo)志物。許多miRNA與對(duì)比劑腎損傷或者急性腎損傷有牽連，其中一些通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥擴(kuò)大或減少急性損傷應(yīng)答來促成發(fā)病機(jī)制，而另一些則調(diào)節(jié)纖維化和血管生成，參與腎臟恢復(fù)或進(jìn)展到纖維化[11]。CIN中許多miRNA的生物學(xué)和病理學(xué)功能尚未完全了解，除了在組織中表達(dá)之外，還可以在各種細(xì)胞外體液如血漿、尿液、唾液和腦脊液中檢測(cè)到miRNA。目前已有研究發(fā)現(xiàn)某些miRNAs作為CIN早期檢測(cè)或預(yù)測(cè)的新型生物標(biāo)志物的潛力，體內(nèi)特定miRNAs模擬物或拮抗劑的系統(tǒng)或局部施用可能提供預(yù)防或改善腎損傷的策略[12]。在本研究中，血漿miRNA-26a在大鼠CIN模型以及CIN病人中出現(xiàn)明顯的表達(dá)升高(P<0.05)，這說明miRNA-26a可能是CIN的生物標(biāo)志物。在非離子型低滲CM輸注后構(gòu)建的CIN大鼠模型中，不僅觀察到大鼠血漿和腎臟中miRNA-26a的表達(dá)變化，還發(fā)現(xiàn)在CM暴露后4～8 h miRNA-26a即出現(xiàn)明顯增加，其反應(yīng)速度較傳統(tǒng)標(biāo)志物更快，可能比傳統(tǒng)的CIN標(biāo)記物更具有優(yōu)勢(shì)。

miRNA-26a可能與CIN的病理生理學(xué)有關(guān)，在大鼠CIN模型中，腎臟miRNA-26a的表達(dá)遠(yuǎn)高于其他器官，表明miRNA-26a的血漿水平主要受腎損傷的影響。miRNA-26a是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miRNA-26a可通過沉默結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表達(dá)，減少M(fèi)APK-JNK/p38途徑的激活[13]。MAPK-JNK/p38途徑是CM誘導(dǎo)腎小管腎細(xì)胞損傷的主要機(jī)制[14]，miRNA-26a可能在CI-AKI的病理生理學(xué)中起重要作用，但是目前引起miRNA-26a表達(dá)變化的機(jī)制以及其對(duì)CIN病理生理學(xué)中的作用仍然未知，需要進(jìn)一步研究。

術(shù)前對(duì)病人進(jìn)行CIN風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，可為CIN的預(yù)防和示警提供參考，Mehran評(píng)分系統(tǒng)對(duì)于PCI術(shù)后CIN具有臨床預(yù)測(cè)意義，能夠協(xié)助臨床醫(yī)生判斷病人預(yù)后[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a與Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有相關(guān)性(r=0.372，P<0.05)，可能是一個(gè)有效的CIN發(fā)生和預(yù)后預(yù)測(cè)因子。在CIN傳統(tǒng)標(biāo)志物SCr/Cyc的基礎(chǔ)上，血漿miRNA-26a表達(dá)監(jiān)測(cè)可能有助于早期診斷CIN和預(yù)后不良病人的早期鑒別。

在CIN大鼠血漿中miRNA-26a表達(dá)明顯升高，CM輸注后4 h即可出現(xiàn)差異性水平改變，且miRNA-26a以腎特異性方式表達(dá)，可能與腎損傷直接相關(guān)。CIN病人血漿miRNA-26a的表達(dá)升高，且miRNA-26a表達(dá)與病人Mehran風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，血漿miRNA-26a可作為CIN早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。miRNA-26a的峰值出現(xiàn)在4 h，持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)， miRNA-26a檢測(cè)的狹窄時(shí)間窗口可能會(huì)限制miRNA-26a用作疾病監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物的臨床實(shí)用性，另外，miRNA-26a在CIN過程中的確切生理作用和調(diào)控機(jī)制還需更多的基礎(chǔ)研究支持。