芎芷地龍湯不同時間預(yù)防給藥對偏頭痛動物模型CREB1a、CREB1b mRNA表達(dá)的影響

2岳廣欣巫鑫輝

偏頭痛是一種常見的、高度致殘的原發(fā)性頭痛，和較高的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)相關(guān)，并具有很高的患病率[1]，被世界衛(wèi)生組織列為第六大致殘疾病[2]。研究顯示，每年有2.5%左右的頭痛病人會發(fā)展為慢性偏頭痛[3]，其中約38%的慢性偏頭痛病人需要采用預(yù)防性治療[4]。偏頭痛雖然不能治愈，但大量的研究證實規(guī)范的預(yù)防治療可以明顯地降低偏頭痛病人的發(fā)作頻率，減輕發(fā)作程度，減少功能損害，提高生存質(zhì)量，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6]。但有研究顯示，目前偏頭痛的治療普遍不足，僅有約20%的人接受過預(yù)防性的治療[7]，其中超過25%的偏頭痛病人適合預(yù)防性治療，然而可能從中獲益的病人中有相當(dāng)一部分沒有得到過預(yù)防性治療[3]。我國從古就重視預(yù)防治療，如《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》：“上工治其萌芽……下工救其已成， 救其已敗?！睆纳鐣F(xiàn)狀和病情需要來看，采用中藥治療偏頭痛有重要意義。本課題組前期研究了采用芎芷地龍湯1 d、3 d、7 d預(yù)防給藥對偏頭痛模型痛閾及血管活性物質(zhì)的影響[8]，為深入探討芎芷地龍湯對偏頭痛的預(yù)防治療機(jī)制，本實驗擬觀察芎芷地龍湯不同時間點預(yù)防給藥后，三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)中三級神經(jīng)元中CREB1a、CREB1b mRNA表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體動物(SPF級)成年雄性SD大鼠，體重(200±20)g，由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品與試劑 芎芷地龍湯(川芎、白芷、生石膏、地龍、元胡)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室提取，每毫升含生藥2.0 g；硝酸甘油注射液(5 mg/mL)購于北京益民藥業(yè)有限公司；琥珀酸舒馬普坦片，每片25 mg，購于海南先聲藥業(yè)有限公司；異丙醇(無錫市化學(xué)試劑廠生產(chǎn))；焦碳酸二乙酯(DEPC)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；三氯甲烷(氯仿)，由北京化工廠生產(chǎn)；TRIZOL Reagent(Invitrogen)；High Pure RNA Tissue Kit(Roche REF12033674001)；Go Taq 2-Step RT-qPCRsystem(Promega A6010)；Go TaqqPCR Master Mix(Promega A6002)。

1.3 實驗儀器 電動手持勻漿器(KONTES)；PCR儀(Bio-RAD CFX96 Real-Time System)；三用電子恒溫水箱(SHH.W21，北京中興偉業(yè)器儀有限公司)；分光光度計(Nano Vue plus)；恒溫震蕩金屬浴(Bioer，MB-102)；低溫高速離心機(jī)(SIGMA 3K15)。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組 SD大鼠隨機(jī)分為6組：生理鹽水對照組、偏頭痛模型組、舒馬普坦組、芎芷地龍湯1 d預(yù)防給藥組(1 d XZDLT組)、芎芷地龍湯3 d預(yù)防給藥組(3 d XZDLT組)、芎芷地龍湯7 d預(yù)防給藥組(7 d XZDLT組)。

1.4.2 造模及給藥 生理鹽水對照組：給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃7 d，普通飼養(yǎng)，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射生理鹽水2 mL/kg 。偏頭痛模型組：給予生理鹽水10 mL/(kg·d )灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg(5 mg/mL)。芎芷地龍湯組：其他處理同偏頭痛模型組，給予芎芷地龍湯10.8 g/(kg·d)灌胃(1 d，3 d，7 d)，末次灌胃30 min后于頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg。舒馬普坦組：其他處理同偏頭痛模型組，給予琥珀酸舒馬普坦6 mg/(kg·d )灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油。

1.4.3 取材 在造模完成2 h后，采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)進(jìn)行深度麻醉，快速斷頭，在超凈臺內(nèi)冰上剪開顱骨取腦，剝離出硬腦膜、丘腦、三叉神經(jīng)脊束核、三叉神經(jīng)節(jié)，然后放入2 mL的無菌外旋凍存管中，于液氮中迅速冷凍，-70 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 大鼠組織總RNA的提取和含量的測定

1.4.4.1 總RNA的提取 嚴(yán)格按照試劑盒(High Pure RNA Tissue Kit)的說明書進(jìn)行操作，先將400 μL Trizol裂解細(xì)胞加入到裝有標(biāo)本組織的離心管中，然后按順序加入適量的氯仿、異丙醇、75%的預(yù)冷乙醇、DEPC水，再分別進(jìn)行純化、沉淀、洗滌、溶解總RNA操作。用微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。根據(jù)A260的值計算RNA濃度(單位：μg/μL)，然后根據(jù)A260/A280比值計算其純度，要求比值為1.8～2.0，比值低于1.6者剔除。

1.4.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(reverse transcription，RT)步驟 嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，對于20 μL反應(yīng)體系，操作步驟如下：取1.5 mL離心管配制模板，加入：RNA 11 μL，引物(Random Primer) 1 μL，加入總RNA量1.1 μg；置于震蕩型恒溫金屬浴中，70 ℃、5 min，然后快速轉(zhuǎn)至冰上至少1 min；離心使液體收集于管底，加入：5×Reaction buffer 4 μL，氯化鎂25 mmol/L 2 μL，PCR，Nucleotide Mix 10 mmol/L 1μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，GoScrpt RT 0.5 μL；RNA引物混合液12 μL與逆轉(zhuǎn)錄混合液8 μL充分混合，置于震蕩型恒溫金屬浴中，震蕩加熱25 ℃、5 min，后放入三用恒溫電子水箱，42 ℃、1 h，再置于震蕩型恒溫金屬浴中，70 ℃、15 min，冷卻；立即PCR反應(yīng)，后放入-20 ℃冰箱保存。

1.4.4.3 PCR引物設(shè)計 根據(jù)Genebank的序列和文獻(xiàn)參考，設(shè)計CREB1a、CREB1b、GAPDH的引物序列。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下，CREB1a-上游：5′GAGGTGTAGTTTGACGCGGT 3′,CREB1a-下游：5′TGAGCTGCTGGCATGGATAC 3′，擴(kuò)增長度：243bp；CREB1b-上游：5′GCAGTGACTGAGGAGCTTGT 3′，CREB1b-下游：5′TGAGCTGCTGGCATGGATAC 3′，擴(kuò)增長度：169bp；GAPDH-上游：5′GTTACCAGGGCTGCCTTCTC 3′，GAPDH-下游：5′GATGGTGATGGGTTTCCCGT 3′，擴(kuò)增長度：177 bp。

1.4.4.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time RT polymerase chain reaction，real-time PCR) 取出等量的RT反應(yīng)產(chǎn)物，分別擴(kuò)增CREB1a、CREB1b、GAPDH基因。5倍稀釋RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA：Nuclease-Free Water 40 μL，cDNA原液10 μL；real-time PCR體系：20 μL反應(yīng)體系；cDNA稀釋液：4 μL；primer F(20 pmol/μL)：0.5 μL；primer R(20 pmol/μL)：0.5 μL；Mix，10 μL，加Nuclease-Free Water至20 μL；輕輕混勻，2 000 r/min離心20 s后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；在95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，15℃、30 s下擴(kuò)增共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，得到每個樣品中相應(yīng)目的基因的Ct值，然后減去GAPDH的Ct值，得出相對Ct值作為n值，再作1/2-n運(yùn)算，得出每個樣品中目的基因的相對表達(dá)量即 Quantity(目的基因/GAPDH)，校正后得到每個樣品中目的基因CREB1a、CERB1b的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、丘腦、硬腦膜的CREB1a mRNA表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組大鼠CREB1a mRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在丘腦、硬腦膜表達(dá)水平降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥干預(yù)后，三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核CREB1a mRNA表達(dá)水平均降低，其中以7 d XZDLT組和舒馬普坦組降低明顯(P<0.01)；給藥干預(yù)后，丘腦、硬腦膜CREB1a mRNA表達(dá)水平有所變化，但其他各組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

組別只數(shù) 三叉神經(jīng)節(jié)三叉神經(jīng)脊束核 丘腦 硬腦膜對照組61.121±0.0861.126±0.0541.051±0.0440.993±0.066模型組62.471±0.0591)2.148±0.0871)0.986±0.0740.926±0.0421 d XZDLT組61.863±0.1291)2)1.900±0.0701)2)1.118±0.0430.986±0.0583 d XZDLT組61.723±0.1171)2)1.328±0.0961)2)1.090±0.0650.841±0.0487 d XZDLT組61.373±0.0801)3)1.161±0.0413)1.056±0.0220.855±0.048舒馬普坦組61.176±0.0803)1.003±0.0561)1.133±0.0400.861±0.048

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、丘腦、硬腦膜的CREB1b mRNA的表達(dá) 與對照組比較，模型組大鼠CREB1b mRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平升高(P<0.05)；在丘腦、硬腦膜表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥干預(yù)后，CREB1b mRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平升高，以7 d XZDLT組和舒馬普坦組升高明顯(P<0.01)；在丘腦、硬腦膜表達(dá)水平，各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

組別只數(shù) 三叉神經(jīng)節(jié)三叉神經(jīng)脊束核 丘腦 硬腦膜對照組6 1.208±0.0771.332±0.0332)1.015±0.0461.078±0.046模型組6 0.982±0.0451)0.993±0.0571)1.047±0.0481.013±0.0481 d XZDLT組6 1.258±0.0431.428±0.0311)2)1.105±0.0371.138±0.0373 d XZDLT組6 1.447±0.0791)1.525±0.0481)2)1.097±0.0651.082±0.0657 d XZDLT組6 1.525±0.1111)3)1.638±0.0431)3)1.155±0.0661.187±0.066舒馬普坦組6 1.583±0.1431)3)1.753±0.0261)3)1.123±0.0641.185±0.065

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；3)P<0.01

3 討 論

偏頭痛的發(fā)病機(jī)制目前沒有定論，以三叉神經(jīng)血管學(xué)說為主流學(xué)說。三叉神經(jīng)節(jié)發(fā)出假單極三叉神經(jīng)初級纖維，其突觸終止于顱內(nèi)外結(jié)構(gòu)(血管)以及脊髓三叉頸復(fù)合體。三叉頸復(fù)合體的二級神經(jīng)元通過脊髓丘腦束上行，終止于丘腦皮層的三級神經(jīng)元[9]。在大腦中，cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在不同的區(qū)域表達(dá)，并調(diào)節(jié)多種功能，如細(xì)胞生長、增殖和記憶，以響應(yīng)各種細(xì)胞內(nèi)信號事件，包括突觸功效和突觸可塑性的長期變化[10]。有研究表明，CREB在三叉神經(jīng)尾核中有大量表達(dá)，和其磷酸化產(chǎn)物pCREB是脊髓痛覺區(qū)域激活后表達(dá)的核蛋白。曲普坦減弱CREB在三叉神經(jīng)系統(tǒng)中樞的活性，這導(dǎo)致對中樞敏化的潛在抑制[11]。和c-fos相似，CREB也參與了痛覺信號的處理，在脊髓水平，CREB在組織損傷誘發(fā)的炎癥和痛覺過敏之后脊髓神經(jīng)元產(chǎn)生的長時程易化中發(fā)揮作用[12]。在核轉(zhuǎn)位之前抑制 CREB 可以阻止腦干內(nèi)痛覺敏化的發(fā)生[13]。CREB在突觸可塑性和疼痛的調(diào)節(jié)中具有重要作用，通常被用作軀體感覺神經(jīng)通路疼痛相關(guān)可塑性變化的標(biāo)志物，其在前腦內(nèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程的增強(qiáng)能提高對慢性炎癥疼痛和神經(jīng)性疼痛大鼠模型非毒性刺激的行為應(yīng)答[14]。注射過CREB反義寡聚核苷酸的大鼠表現(xiàn)出程度更低的溫度痛覺過敏，提示脊髓CREB蛋白水平的降低可以減少痛覺過敏的應(yīng)答[15]。感覺神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的變化，包括特異形式CREB蛋白活動水平的變化，對于突觸的長時程易化(long-term facilitation，LTF)是至關(guān)重要的[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，CREB1基因可能是CREB、CREM和ATF1家族基因中唯一在海兔神經(jīng)元中表達(dá)的成員。CREB1a蛋白是在長時程易化過程中的充分必需激活因子，而CREB1b則對CREB1a和長時易化起抑制作用[17]。有研究顯示，CREB1抗體能提升神經(jīng)性疼痛大鼠縮爪閾值，同時降低c-fos的表達(dá)水平[18]。

本實驗研究觀察到，注射硝酸甘油后，CREB1a mRNA在三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯升高，給藥干預(yù)后在該部位表達(dá)水平明顯降低，以芎芷地龍湯7 d預(yù)防給藥組和舒馬普坦組下降明顯(P<0.01)。注射硝酸甘油后，CREB1b mRNA在三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯降低，給藥干預(yù)后在該部位表達(dá)水平明顯升高，芎芷地龍湯7 d預(yù)防給藥組和舒馬普坦組升高明顯(P<0.01)。而在硬腦膜和丘腦處，各組CREB1a mRNA和CREB1b mRNA的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能是因為硬腦膜無菌性炎癥被普遍認(rèn)為是偏頭痛的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)[19]，以血管的擴(kuò)張、血漿蛋白外滲、肥大細(xì)胞脫顆粒而使促炎性物質(zhì)釋放，從而進(jìn)一步激活分布于其上的初級傳入纖維，引起疼痛發(fā)生[20]。丘腦則被認(rèn)為是處于傷害性信息的中央處理和整合的中心，被看作是處理傳入感覺信息的中轉(zhuǎn)中心，甚至能調(diào)節(jié)這些信息，并參與組成“痛感矩陣”，整合所有對疼痛的感受、情感和認(rèn)知應(yīng)答[9]，功能過于復(fù)雜。這也可能與CREB通過磷酸化發(fā)揮作用有關(guān)[21]，有研究證實，CREB磷酸化后可激活部分即早基因(如c-fos)的表達(dá)，激活對突觸功能起重要作用的參與痛覺傳導(dǎo)的物質(zhì)如神經(jīng)元型一氧化氮和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[22]，同時也在神經(jīng)病理性疼痛[23]和炎性疼痛[24]的病理過程中起著重要的作用，并在注射硝酸甘油或硝普鈉后表達(dá)增加[25]。因此，CREB在偏頭痛三叉神經(jīng)血管通路中的作用還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，預(yù)防使用芎芷地龍湯可以減少硝酸甘油誘發(fā)的三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核CREB1a mRNA表達(dá)，增加三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核CREB1b mRNA表達(dá)，其中以預(yù)防給藥7 d組效果最好。