養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)中微生物菌群結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化

黃 薇,劉蘭英,吳妙鴻,陳麗華,呂 新,葉美鋒,林代炎,宋永康*

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養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)中微生物菌群結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化

黃 薇1,劉蘭英1,吳妙鴻1,陳麗華1,呂 新1,葉美鋒2,林代炎2,宋永康1*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建 福州 350003)

采用高通量測序技術(shù)對養(yǎng)豬場廢水處理系統(tǒng)的細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析,同時對細(xì)菌群落、污水水質(zhì)和抗生素含量相關(guān)性進(jìn)行分析.研究結(jié)果表明,污水各處理單元中的菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異,且細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)隨處理進(jìn)程逐步改變,其中集污池與厭氧反應(yīng)器的細(xì)菌菌群優(yōu)勢門類為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria,曝氣池的細(xì)菌菌群優(yōu)勢門類變?yōu)镕irmicutes、Verrucomicrobia、Bacteroidetes、Proteobacteria和Candidatus Saccharibacteria,氧化塘的細(xì)菌菌群優(yōu)勢門類為Firmicutes、Proteobacteria、Chloroflexi、Euryarchaeota和Bacteroidetes.相關(guān)性分析結(jié)果表明,污水中的細(xì)菌群落與水質(zhì)環(huán)境因子之間存在顯著相關(guān)(<0.05).其中,種屬與COD、TN、NH4+-N呈顯著正相關(guān),與TN、NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān),與磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、強(qiáng)力霉素、土霉素呈極顯著正相關(guān),與恩諾沙星、四環(huán)素呈顯著正相關(guān),與環(huán)丙沙星呈顯著正相關(guān),與氧氟沙星呈顯著正相關(guān).

養(yǎng)豬廢水；細(xì)菌群落；水質(zhì)；抗生素

近年來,隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,其污染排放問題也日趨嚴(yán)重[1].畜禽養(yǎng)殖污水不僅富含化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、總磷(TP)等常規(guī)污染物,還含有大量的抗生素和各種病原菌,對公共健康和生態(tài)安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2].研發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的畜禽養(yǎng)殖廢水處理工藝已成為養(yǎng)殖企業(yè)和環(huán)保行業(yè)的研究熱點,且已開發(fā)出包括UASB-SBR、ABR-MABR、AMBR-MABR等在內(nèi)的多種處理工藝[3-7].然而,目前的畜禽養(yǎng)殖廢水處理工藝開發(fā)主要從工程角度進(jìn)行設(shè)計,鮮有考慮微生物群落結(jié)構(gòu)和功能及其與環(huán)境因素的響應(yīng)規(guī)律[8].

在污水處理系統(tǒng)中,微生物是污染物去除的主體,系統(tǒng)的處理效果、穩(wěn)定運(yùn)行和出水安全性與其中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能緊密相關(guān)[8-9].Fang等[10]和Liu[11]等的研究結(jié)果均顯示特定的微生物菌群能夠促進(jìn)廢水處理系統(tǒng)中某些復(fù)雜大分子有機(jī)化合物的降解.因此,分析養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)各單元細(xì)菌群落組成、明確占主導(dǎo)地位的細(xì)菌群落以及細(xì)菌群落與污染物濃度之間的關(guān)聯(lián)性,對優(yōu)化廢水處理系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu),提高水質(zhì)凈化效率具有重要作用[12].但目前對養(yǎng)殖廢水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其豐度變化的研究仍少見報道.

傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法在養(yǎng)殖廢水微生物研究中的應(yīng)用較多[13].然而由于細(xì)菌在自然條件的生長情況與培養(yǎng)基不同,以及自然界中大多數(shù)微生物不可培養(yǎng),使得傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法很難對處理系統(tǒng)中各單元的優(yōu)勢種群及其差異進(jìn)行識別[14].近幾年,隨著高通量測序及其分析技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外學(xué)者通過高通量技術(shù)在土壤、腸道微生物、極端環(huán)境等多種復(fù)雜介質(zhì)中微生物群落的研究都取得了較好的進(jìn)展[15-17].因此,本文擬采用高通量測序技術(shù)對某穩(wěn)定運(yùn)行養(yǎng)豬廢水處理系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,以期明確各處理單元中起主導(dǎo)作用的細(xì)菌及其在整個處理過程中的動態(tài)變化;同時通過相關(guān)性分析對環(huán)境因子和微生物群落的變化進(jìn)行分析,探索對污染物質(zhì)降解起重要作用的功能微生物,以期發(fā)現(xiàn)微生物群落變化的主要推動力.

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖廢水處理工藝流程

選擇福建省三明市一家典型的規(guī)?；i養(yǎng)殖場為研究對象,該養(yǎng)豬場的生豬養(yǎng)殖規(guī)模約5000頭,廢水排放量為80m3/d.養(yǎng)豬場廢水處理工藝流程見圖1,養(yǎng)殖廢水通過管道進(jìn)入機(jī)械粗格柵攔截廢水中的大顆粒物質(zhì)及纖維狀污染物,出水用振動篩擠壓分離機(jī)進(jìn)行固液分離,分離后的液體進(jìn)入集污池繼續(xù)沉淀廢水中的部分細(xì)小顆粒,集污池中的污水經(jīng)管道進(jìn)入?yún)捬醴磻?yīng)器中進(jìn)行厭氧發(fā)酵,排除的沼液通過管道依次進(jìn)入一級、二級、三級曝氣池,經(jīng)曝氣處理后的污水進(jìn)入氧化塘進(jìn)行深度凈化,氧化塘中種植穗花狐尾藻()以及養(yǎng)殖胡子鯰(),最終出水達(dá)到《畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 18596-2001)[18],用于豬舍沖洗和周邊苗木、蔬菜灌溉.

圖1 養(yǎng)豬廢水處理工藝流程示意

1.2 水樣采集

依據(jù)處理系統(tǒng)的運(yùn)行情況,于2018年1月19日進(jìn)行1次系統(tǒng)地樣品采集,共采集12個點,其中在集污池、厭氧反應(yīng)器、三級曝氣池、氧化塘各取3個,采樣點布置在處理單元的出水口或出水口一側(cè),樣品保存方法參考文獻(xiàn)[19],在0~4℃條件下保存運(yùn)輸,48h內(nèi)完成污水水質(zhì)和抗生素的檢測分析.

1.3 微生物菌群分析

1.3.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序 收集的水樣通過0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾,取濾膜采用PowerWater DNA Isolation kit(MOBio, CarIsbad, CA, USA)進(jìn)行提取,提取過程參考操作說明書進(jìn)行.提取得到的DNA樣品濃度和質(zhì)量采用Qubit 2.0 Fluorometer(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)檢測,將符合試驗要求的DNA樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增采用16S rRNA基因V3~V4區(qū)的通用引物341F(5′-CCCTACACGCT- CTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWG- CAG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTGGCA- CCCGAGAATTCCA (barcode) GACTACHVGGGT- ATCTAATCC-3′).PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR Purification kit(Qiagen, Düsseldorf, Germany)進(jìn)行純化.純化后的PCR產(chǎn)物采用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行高通量測序,原始數(shù)據(jù)提交NCBI’s Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫保存,序列號SRP151692.

1.3.2 高通量數(shù)據(jù)處理 Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)首先使用FLASH軟件[20]進(jìn)行拼接,之后運(yùn)用cutadapt軟件[21]裁切序列中的正反向引物,使用Prinseq軟件[22]質(zhì)控去除score<20的低質(zhì)量序列,然后使用Usearch軟件[23]去除嵌合體以及按97%序列相似度劃分分類操作單元(OTUs).利用Ribosomal Database Project (RDP) classifier將OUT代表序列與數(shù)據(jù)庫對比進(jìn)行物種注釋(置信度閾值默認(rèn)為0.8以上),得到每條序列從門到屬各個水平的分類信息,基于分類學(xué)信息,可以在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析[24].利用Mothur軟件統(tǒng)計每個生物樣本的Good’s coverage、ACE、Chao1、Shannon、Simpson等alpha多樣性指數(shù)[25].使用QIIME軟件計算weighted UniFrac距離,用于beta多樣性的評估分析[26].

1.4 水質(zhì)與抗生素含量檢測分析

COD采用HJ/T 399-2007(快速消解分光光度法)[27]測定,TN采用HJ636-2012(堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法)[28]測定,NH4+-N采用HJ 535-2009 (納氏試劑分光光度法)[29].污水中抗生素含量的測定采用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS),測定的抗生素有:磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFLX)、強(qiáng)力霉素(DOX)、四環(huán)素(TET)、土霉素(OTC)[30].

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運(yùn)用EXCEL軟件統(tǒng)計平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)方差.采用SPSS軟件對污水水質(zhì)、抗生素含量、差異物種、多樣性指數(shù)等進(jìn)行單因素方差分析(LSD法)和Spearman相關(guān)性分析.應(yīng)用R軟件統(tǒng)計細(xì)菌群落數(shù)據(jù)并繪制柱狀圖、熱圖、進(jìn)化樹、PCoA圖,同時運(yùn)行相似度分析(Anosim)對樣品組間差異顯著性進(jìn)行檢測以及對環(huán)境因素和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析(RDA)、Pearson Correlation相關(guān)性分析[31-32].通過LEfSe軟件線性判別分析找出對樣品劃分產(chǎn)生顯著性影響的差異物種[33].

2 結(jié)果與討論

2.1 廢水水質(zhì)及抗生素含量動態(tài)變化

養(yǎng)殖污水凈化處理過程中,水質(zhì)動態(tài)變化見表1.從表中可知,養(yǎng)殖廢水有機(jī)物濃度較高,集污池中污水COD濃度高達(dá)5180mg/L,經(jīng)過厭氧反應(yīng)器后,COD濃度急劇降低,降至1246mg/L,去除率達(dá)到75.95%,而曝氣池和氧化塘對COD的貢獻(xiàn)率僅為15.41%和1.68%,最終COD出水濃度為361mg/L.這與已有的多數(shù)研究結(jié)果基本一致[2-5],養(yǎng)殖廢水中的有機(jī)物被厭氧微生物分解、代謝、消化,去除率可達(dá)到65%~80%;但出水后的沼液具有低COD/N的特性,其有機(jī)質(zhì)不易被微生物利用[34].在脫氮方面,養(yǎng)殖廢水中的TN含量主要以NH4+-N為主,TN和NH4+-N在厭氧反應(yīng)器中的去除量不高,而在曝氣池和氧化塘中被大量去除,去除率分別為75.75%和83.83%,出水TN濃度為137.67mg/L,NH4+-N濃度為63.67mg/L.有的研究認(rèn)為曝氣使自養(yǎng)型硝化細(xì)菌處于優(yōu)勢,可以穩(wěn)定高效地轉(zhuǎn)化NH4+-N為NO3--N[1].

表1 各處理單元出水水質(zhì)分析(mg/L)

注:數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3),同行不同字母表示處理單元間差異顯著(<0.05),LSD法.

在抗生素去除方面,本研究共檢測了2種磺胺類、3種氟喹諾酮類以及3種四環(huán)素類,這幾種抗生素在豬場中被普遍使用且檢出率較高[35-37].抗生素濃度在各處理單元的變化情況具體見表2.總體上看,除TET外,其他7種抗生素都具有明顯的去除效果,去除率達(dá)到86.91%~100%.從表中可知,厭氧反應(yīng)器對污水中CIP、TET沒有明顯的消減作用,對ENR的消減作用達(dá)到89.76%,但SMZ、SMM、OFX、DOX、OTC等均表現(xiàn)出負(fù)去除現(xiàn)象.分析認(rèn)為,原因可能是固體顆粒中吸附的抗生素解吸到水相中[1,36].曝氣池處理后,多種抗生素濃度大幅降低,SMZ、SMM、CIP、DOX、OTC濃度均顯著(<0.05)小于厭氧反應(yīng)器中濃度,其中CIP濃度已經(jīng)低于儀器檢測下限.曝氣池處理后的出水經(jīng)過包含穗花狐尾藻和胡子鯰的氧化塘,各種抗生素濃度均得到進(jìn)一步降低,SMZ和SMM濃度低于儀器檢測下限,ENR和OFX濃度僅為0.01μg/L和0.17μg/L.此外,養(yǎng)殖污水中四環(huán)素類抗生素TET、DOX、OTC經(jīng)處理系統(tǒng)處理后,出水中的濃度仍較高,分別為4.80μg/L、5.77μg/L和2.30μg/L,這與多項研究結(jié)果大體相似[38-39],表明處理系統(tǒng)對四環(huán)素類抗生素的降解能力較小.這可能與四環(huán)素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),其降解機(jī)制復(fù)雜、半衰期長,甚至在特定情況下降解產(chǎn)物還會轉(zhuǎn)化為母體化合物;且四環(huán)素類抗生素是疏水性有機(jī)物,與其他抗生素相比,更容易被吸附在固體顆粒上而受到保護(hù)[40].

表2 各處理單元出水抗生素含量分析(μg/L)

注: -為末檢驗,數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3),同行不同字母表示處理單元間差異顯著(<0.05),LSD法.

2.2 污水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征與動態(tài)變化

如表3所示,12個污水樣品獲得的有效16S rRNA序列數(shù)為42537~69256條,共計608526條.基于97%的序列相似性,共獲得8508個OTUs,平均每個樣品為2263個OTUs.OUT覆蓋率(Good’s coverage)顯示97%以上的微生物被捕捉到,表明本研究獲取的數(shù)據(jù)量能夠很好地反映特定樣品的細(xì)菌多樣性情況.Alpha多樣性分析結(jié)果表明(表3),不同處理單元出水中的微生物群落的豐富度指數(shù)(ACE和Chaol)和多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)都存在一定的差異,上游處理單元的細(xì)菌物種數(shù)和群落多樣性要比下游處理單元高,厭氧反應(yīng)器中的細(xì)菌物種數(shù)和群落多樣性要比有氧處理單元高.一般來說,細(xì)菌物種數(shù)和群落多樣性越豐富,污染物的去除效果越好[41].

利用RDP classifier對97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行物種分類注釋,共得到31個門水平的細(xì)菌和一些無法歸類的細(xì)菌(圖2).從圖2中可見,集污池中的污水優(yōu)勢菌為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria,分別占全部細(xì)菌總數(shù)的41.47%、30.52%和24.07%;Lamendella等[42]研究顯示豬腸道微生物的主要類群為Firmicutes和Bacteroidetes,表明生豬養(yǎng)殖廢水中的微生物主要以腸道微生物為主.在厭氧反應(yīng)器中,優(yōu)勢群體的種類沒有改變,但數(shù)量明顯發(fā)生了變化,Firmicutes(62.99%)顯著(<0.05)高于集污池,而Bacteroidetes(23.32%)和Proteobacteria (5.15%)顯著(<0.05)低于集污池;在曝氣池中,優(yōu)勢細(xì)菌變?yōu)镕irmicutes(35.33%)、Verrucomicrobia (12.94%)、Bacteroidetes(12.40%)、Proteobacteria (12.09%)和Candidatus Saccharibacteria(8.28%),且各種群含量與厭氧反應(yīng)器均存在顯著差異(<0.05);進(jìn)入氧化塘后,優(yōu)勢群體的種類為Firmicutes (37.39%)、Proteobacteria(12.09%)、Chloroflexi (7.84%)、Euryarchaeota(6.12%)和Bacteroidetes (5.63%),除Firmicutes和Euryarchaeota,其他種群含量與曝氣池均存在顯著差異(<0.05);說明不同的污水處理單元,細(xì)菌的優(yōu)勢菌群具有明顯差異.

表3 Illumina測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

注:數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3),同行不同字母表示處理單元間差異顯著(<0.05),LSD法.

圖2 門水平下不同處理單元污水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

圖3 屬水平下不同處理單元污水中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

通過高通量測序,在整個生豬養(yǎng)殖污水處理過程中共檢測到548個屬的細(xì)菌,對屬水平的細(xì)菌群落數(shù)量在前50的屬進(jìn)行熱圖分析,結(jié)果見圖3.從樣品間的屬水平的聚類關(guān)系可以看出,污水中細(xì)菌種群有高達(dá)20.30%~38.40%的物種未分類,且其種類及數(shù)量隨著處理進(jìn)程逐步發(fā)生改變.在集污池中,優(yōu)勢細(xì)菌屬為(10.81%)、(9.25%)和(7.25%);進(jìn)入?yún)捬醴磻?yīng)器中,優(yōu)勢細(xì)菌屬發(fā)生了明顯的變化,變?yōu)?9.80%)和(7.93%);在曝氣池中,含量顯著降低(<0.05),和大幅增長(<0.05),優(yōu)勢菌屬為(7.80%)、(7.70%)、(7.50%),進(jìn)入氧化塘后,、和顯著增長(<0.05),優(yōu)勢菌屬為(9.09%)、(7.33%)、(6.11%)和(5.43%).

2.3 組間群落結(jié)果差異分析

圖4 生豬養(yǎng)殖污水凈化系統(tǒng)各處理單元細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

a為聚類分析;b為PCoA

為比較污水各處理單元樣品中細(xì)菌群落的差異性,根據(jù)各樣本物種豐度計算Beta多樣性距離矩陣,計算樣本間距離的方法為weighted Unifrac,樣本間的距離越大,說明樣本間的細(xì)菌群落差異越大.基于距離矩陣進(jìn)行聚類分析可以發(fā)現(xiàn)(圖4a),細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化是隨著處理進(jìn)程逐步發(fā)生改變的;基于距離矩陣進(jìn)行PCoA發(fā)現(xiàn)(圖4b),前3個主坐標(biāo)可以代表90%的變量信息,并且各樣品細(xì)菌群落隨處理進(jìn)程的變化過程主要是在PCoA1軸方向發(fā)生.曝氣池和氧化塘樣品的距離較近,表明這2個處理單元的微生物組成相似.

圖5 生豬養(yǎng)殖污水凈化系統(tǒng)各處理單元細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析

Anosim分析結(jié)果可以看出各處理單元污水樣品組間差異大于組內(nèi)差異(=1),并且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(=0.002<0.05),表明生豬養(yǎng)殖污水的各處理單元的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化(圖5).進(jìn)一步通過LEfSe判別分析估算各物種類群對差異效果影響的大小,篩選出對樣本分類有顯著影響作用的物種,結(jié)果見圖6.從圖中可以看出,集污池、厭氧反應(yīng)器、曝氣池和氧化塘對組間基因或功能差異有顯著影響的物種類群分別為45,17,29以及53類.其中集污池與其他處理單元存在顯著差異的菌群主要包括Proteobacteria中的Gammaproteobacteria和Bacteroidales等,研究表明Proteobacteria和Bacteroidetes均為畜禽養(yǎng)殖污水中的優(yōu)勢菌群, Proteobacteria主要負(fù)責(zé)有機(jī)和營養(yǎng)物的去除, Bacteroidetes在污水中的作用僅次于Proteobacteria[43-44].厭氧反應(yīng)器中存在顯著差異的門類為Firmicutes和Spirochaetes,Ducey等[45]研究表明,包含產(chǎn)酸菌Clostridiales、Clostridium、Acidobacteria以及產(chǎn)甲烷菌的Firmicutes在厭氧處理階段起著關(guān)鍵作用.Verrucomicrobia是曝氣池顯著高于其他處理階段的菌群門類,其是高效活性污泥中常見門類,主要用于對有機(jī)物的降解[46-47].在氧化塘中檢測到眾多與其他處理單元存在顯著差異的菌群,主要隸屬于門Proteobacteria、Planctomycetes、Euryarchaeota、Deinococcus- Thermus、Chloroflexi和Actinobacteria,這些差異菌群的存在可能與穗花狐尾藻根系微生物和胡子鯰腸道微生物有一定的關(guān)系.

圖6 生豬養(yǎng)殖污水凈化系統(tǒng)各處理單元細(xì)菌物種類群LEfSe分析環(huán)形樹狀

不同顏色表示不同分組,不同顏色的節(jié)點表示在該顏色所代表的分組中起重要作用的微生物群,黃色節(jié)點表示在不同分組中沒有起到重要作用的微生物類群,圖例為組間在豐度上存在顯著差異的物種名稱(<0.05)

2.4 細(xì)菌群落與水質(zhì)環(huán)境因子之間的關(guān)系

水質(zhì)環(huán)境因子影響著微生物的微生態(tài)生存環(huán)境,微生物的生長代謝反過來影響著水質(zhì)中化學(xué)物質(zhì)的存在形態(tài)和濃度[48-49].在屬分類上對菌群(相對豐度>2%)進(jìn)行Pearson Correlation相關(guān)性分析,結(jié)果如表4所示.

表4 屬分類水平上細(xì)菌菌群與水質(zhì)環(huán)境因子的Pearson Correlation分析(相對豐度>2%)

注:*表示顯著相關(guān)(<0.05),**表示極顯著相關(guān)(<0.01).

與COD、TN、NH4+-N呈顯著正相關(guān),與TN、NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān).在抗生素方面,磺胺類SMZ、SMM和四環(huán)素類DOX、OTC與菌群的相關(guān)性一致,均與呈極顯著正相關(guān);氟喹諾酮類ENR和四環(huán)素類TET與菌群的相關(guān)性相似,與呈顯著正相關(guān);氟喹諾酮類CIP與呈顯著正相關(guān),而OFLX與菌群呈顯著正相關(guān).

由上述分析結(jié)果可知,不同的外部環(huán)境因子對于生豬養(yǎng)殖凈化系統(tǒng)中的微生物群落組成均有著顯著的影響.因此,對于生豬養(yǎng)殖污水的處理,創(chuàng)造合理的生存條件,促進(jìn)微生物特別是功能菌的增殖,最大程度發(fā)揮降解有機(jī)物和脫除氮的功能,可能是提高其處理效果的有效途徑[2].

3 結(jié)論

3.1 本研究的生豬養(yǎng)殖污水凈化處理系統(tǒng)中具有極其豐富的生物多樣性,共檢測得到31個門、548個屬的細(xì)菌.其中,集污池的優(yōu)勢種群為Firmicutes (41.47%)、Bacteroidetes(30.52%)和Proteobacteria (24.07%);厭氧反應(yīng)器優(yōu)勢群體為Firmicutes (62.99%)、Bacteroidetes(23.32%)和Proteobacteria (5.15%);在曝氣池中,優(yōu)勢細(xì)菌種群變?yōu)镕irmicutes (35.33%)、Verrucomicrobia(12.94%)、Bacteroidetes (12.40%)、Proteobacteria(12.09%)和Candidatus Saccharibacteria(8.28%);進(jìn)入氧化塘后,優(yōu)勢群體的種類為Firmicutes(37.39%)、Proteobacteria(12.09%)、Chloroflexi(7.84%)、Euryarchaeota(6.12%)和Bacteroidetes(5.63%).

3.2 生豬養(yǎng)殖污水各處理單元中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨處理進(jìn)程逐步發(fā)生改變,并且存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(<0.05).集污池、厭氧反應(yīng)器、曝氣池和氧化塘對各處理單元細(xì)菌基因或功能差異有顯著影響的物種類群分別為45,17,29以及53類.其中集污池存在顯著差異的菌群為Proteobacteria和Bacteroidales,厭氧反應(yīng)器中存在顯著差異的門類為Firmicutes和Spirochaetes,曝氣池顯著差異的門類為Verrucomicrobia,而氧化塘中檢測到眾多與其他處理單元存在顯著差異的菌群,隸屬于Proteobacteria、Planctomycetes、Euryarchaeota、Deinococcus- Thermus、Chloroflexi和Actinobacteria.

3.3 本研究的生豬養(yǎng)殖污水中的細(xì)菌群落與水質(zhì)環(huán)境因子之間存在顯著相關(guān)(<0.05).其中, Acinetobacter、Bacteroides、Prevotella、Lachnospiracea_incertae_sedis與COD、TN、NH4+-N呈顯著正相關(guān),Clostridium sensu strict、Methanothrix與TN、NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān).在抗生素方面,SMZ、SMM、DOX、OTC與Petrimonas、Lachnospiracea_ incertae_sedis、Clostridium XlVa、Tissierella呈極顯著正相關(guān),ENR、TET與Acinetobacter、Bacteroides、Prevotella呈顯著正相關(guān),CIP與Prevotella、Lachnospiracea_incertae_sedis呈顯著正相關(guān),OFLX與菌群Clostridium sensu stricto、Petrimonas呈顯著正相關(guān).

[1] 莊榆佳,高陽俊,鄧玉君,等.微生物固化曝氣技術(shù)對養(yǎng)殖廢水的深度處理 [J]. 環(huán)境化學(xué), 2015,34(7):1356-1362. Zhuang Yu-jia, Gao Yang-jun, Deng Yu-jun, et al.Advanced treatment of swine wastewater by the immobilized-microorganism and aeration technology [J]. Environmental Chemistry, 2015,34(7):1356-1362.

[2] 翟一帆,袁青彬,胡 南.養(yǎng)豬廢水處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)變化及影響因素研究 [J]. 水資源保護(hù), 2018,34(1):88-94. Zhai Yi-fan, Yuan Qing-bin, Hu Nan. Study on structure variation and influencing factors of microbial community in swine wastewater treatment system [J]. Water Resources Protection, 2018,34(1):88-94.

[3] 申童童,袁林江,溫丹丹,等.側(cè)流污泥返送到缺氧池對A2/O系統(tǒng)效能影響研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(9):3335-3342. Shen Tong-tong, Yuan Lin-jiang, Wen Dan-dan, et al. Effect of side- stream sludge returning to anoxic tank on A2/Osystem effectiveness [J]. China Environmental Science, 2018,38(9):3335-3342.

[4] 杜 龑,周北海,袁蓉芳,等.UASB-SBR工藝處理規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖廢水 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2018,12(2):497-504. Du Yan, Zhou Bei-hai, Yuan Rong-fang, et al. Treatment of large- scale livestock wastewater by UASB-SBR process [J]. Chinese Journalof Environmental Engineering, 2018,12(2):497-504.

[5] 支 堯,張光生,錢 凱,等.生物吸附/MBR/硫鐵自養(yǎng)反硝化組合工藝優(yōu)化研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(6):2097-2104. Zhi Yao, Zhang Guang-sheng, Qian Kai, et al. Research on optimal operation by a combined biological adsorption-MBR-Sulfur/Iron autotrophic denitrification process [J]. China Environmental Science, 2018,38(6):2097-2104.

[6] 陳 晴,王毅力,趙 麗,等.ABR-MABR耦合工藝處理畜禽養(yǎng)殖廢水的同步啟動[J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2017,30(2):298-305. Chen Qing, Wang Yi-li, Zhao Li, et al. Synchronous Start-Up of Anaerobic Baffled Reactor-Membrane Biofilm Bioreactor (ABR- MABR) Coupling Process Treating Synthetic Livestock and Poultry Wastewater [J]. Research of Environmental Sciences, 2017,30(2): 298-305.

[7] 趙 麗,王毅力.AMBR-MABR耦合工藝處理模擬畜禽養(yǎng)殖廢水的啟動和運(yùn)行[J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2017,11(11):5799-5809. Zhao Li, Wang Yi-li. Start-up and operation of anaerobic migrating blanket reactor-membrane biofilm bioreactor (AMBR-MABR) coupling process treating synthetic livestock wastewater [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2017,11(11):5799-5809.

[8] Cydzikkwiatkowska A, Zielińska M. Bacterial communities in full-scale wastewater treatment systems [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2016,32(4):66.

[9] 王維奇,王秀杰,李 軍,等.包埋厭氧氨氧化的脫氮特性及其微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(9):3343-3350. Wang Wei-qi, Wang Xiu-jie, Li Jun, et al. Nitrogen removal characteristics and microbial community structure analysis of entrapped anaerobic ammonium oxidizingbacteria [J]. China Environmental Science, 2018,38(9):3343-3350.

[10] Fang F, Han H, Zhao Q, et al. Bioaugmentation of biological contact oxidation reactor (BCOR) with phenol-degrading bacteria for coal gasification wastewater (CGW) treatment [J]. Bioresource Technology, 2013,150:314-320.

[11] Liu X, Chen Y, Zhang X, et al. Aerobic granulation strategy for bioaugmentation of a sequencing batch reactor (SBR) treating high strength pyridine wastewater [J]. Journal of Hazardous Materials, 2015,295:153-160.

[12] Chen Y, Lan S, Wang L, et al. A review: Driving factors and regulation strategies of microbial community structure and dynamics in wastewater treatment systems [J]. Chemosphere, 2017,174:173-182.

[13] Renbao L, Cheng M P, Wu M C, et al. Use of metagenomic approaches to isolate lipolytic genes from activated sludge [J]. Bioresource Technology, 2010,101(21):8323-8329.

[14] Garciaarmisen T, Anzil A, Cornelis P, et al. Identification of antimicrobial resistant bacteria in rivers: insights into the cultivation bias [J]. Water Research, 2013,47(14):4938-4947.

[15] Li Y, Adams J, Shi Y, et al. Distinct Soil Microbial Communities in habitats of differing soil water balance on the Tibetan Plateau [J]. Scientific Reports, 2017,7:46407.

[16] Kallenbach C M, Frey S D, Grandy A S. Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls [J]. Nature Communications, 2016,7:13630.

[17] Barton W, Penney N C, Cronin O, et al. The microbiome of professional athletes differs from that of more sedentary subjects in composition and particularly at the functional metabolic level [J]. Gut, 2018,67(4):625-633.

[18] GB 18596-2001 畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn) [S]. GB 18596-2001 Discharge standard of pollutants forlivestock and poultry breeding [S].

[19] GB 12999-1991 水質(zhì)采樣樣品的保存和管理技術(shù)規(guī)定 [S]. GB 12999-1991 Water quality sampling-Technical regulation of the preservation and handling of samples [S].

[20] Mago? T, Salzberg S L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies [J]. Bioinformatics, 2011,27(21): 2957-2963.

[21] Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads [J]. Embnet Journal, 2011,17(1):10-12.

[22] Schmieder R, Edwards R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets [J]. Bioinformatics, 2011,27(6):863-864.

[23] Edgar R C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST [J]. Bioinformatics, 2010,26(19):2460-2461.

[24] Ye L, Shao M F, Zhang T, et al. Analysis of the bacterial community in a laboratory-scale nitrification reactor and a wastewater treatment plant by 454-pyrosequencing [J]. Water Research, 2011,45(15):4390- 4398.

[25] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2009,75(23):7537-7541.

[26] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis ofhigh-throughput communitysequencingdata [J]. NatMethods, 2010, 7(5):335-336.

[27] HJ/T 399-2007 水質(zhì)化學(xué)需氧量的測定快速消解分光光度法. HJ/T 399-2007 Water quality-Determination of the chemical oxygen demand-Fast digestion-Spectrophotometric method.

[28] HJ636-2012 水質(zhì)總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法. HJ636-2012 Water quality-Determination of total nitrogen-Alkaline potassium persulfate digestion UV spectrophotometric method.

[29] HJ/T 535-2009 水質(zhì)氨氮的測定納氏試劑分光光度法. HJ/T 535-2009 Waterquality-Determinationofammonianitrogen- Nessler’sreagentspectrophotometry.

[30] 郭欣妍,王 娜,郝利君,等.超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水、土壤及糞便中25種抗生素 [J]. 分析化學(xué), 2015,(1):13-20. Guo Xin-Yan, Wang Na, Hao Li-Jun, et al. Simultaneous detection of 25kinds of veterinary antibiotics in soil, manure and water samples using liquid chromatography_tandem mass spectrometry [J]. Chinese journal of analytical chemistry, 2015,(1):13-20.

[31] Oksanen J B F, Kindt R, Legendre P, et al. Vegan: community ecology R package, v2.0-10 [Z]. https://CRAN.R-project.org/package=vegan/ 2013-12-12.

[32] Warnes G R, Bolker B, Bonebakker L, et al. gplots: Various R programming tools for plotting data.https://CRAN.R-project.org/ package=gplots /2016-03-30.

[33] Segata N, Izard J, Waldron L, et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation [J]. Genome Biology, 2011,12(6):R60.

[34] 朱映紅.微生物強(qiáng)化豬場沼液脫氮工藝研究 [D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015. Zhu Ying-hong. Research on high-perform ancenitrogen removalofpiggerybiogaseffluentbymicrobialbio-augmentation [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2015.

[35] 劉元望,李兆君,馮 瑤,等.微生物降解抗生素的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016,35(2):212-224.Liu Yuan-wang, Li Zhao-jun, Feng Yao, et al. Research progress in microbial degradation of antibiotics [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016,35(2):212-224.

[36] 靳紅梅,黃紅英,管永祥,等.規(guī)模化豬場廢水處理過程中四環(huán)素類和磺胺類抗生素的降解特征[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報, 2016,32(6): 978-985.Jin Hong-mei, Huang Hong-ying, Guan Yong-xiang, et al. Characteristics of degradation tetracyclines and sulfonamides during wastewater treating processes in an in-tensive swine farm [J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2016,32(6):978-985.

[37] Wang N, Guo X, Xu J, et al. Pollution characteristics and environmental risk assessment of typical veterinary antibiotics in livestock farms in Southeastern China [J]. Journal ofenvironmental science and health. Part B, 2014,49(7):468-479.

[38] Prado N, Ochoa J, Amrane A. Biodegradation and biosorption of tetracycline and tylosin antibiotics in activated sludge system [J]. Process Biochemistry. 2009,44(11):1302-1306.

[39] Kim S E P, Jensen J N, et al. Removal of antibiotics in wastewater: Effect of hydraulic and solid retention times on the fate of tetracycline in the activated sludge process [J]. Environmental Science & Technology, 2005,39(15):5816-5823.

[40] 楊曉芳,楊 濤,王 瑩,等.四環(huán)素類抗生素污染現(xiàn)狀及其環(huán)境行為研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境工程, 2014,32(2):123-127. Yang Xiao-fang, Yang Tao, Wang Ying, et al. Research progress in progress in pollution status and environmental behavior of tetracycline antibiotics [J]. Environmental Engineering, 2014,32(2):123-127.

[41] 劉志偉,周美修,宋俊玲,等.復(fù)合垂直流人工濕地污染物去除特征及微生物群落多樣性分析[J]. 環(huán)境工程, 2014,32(2):38-42. Liu Zhi-wei, Zhou Mei-xiu, Song Jun-ling, et al. Pollutants removal characteristics and analysis of microbial communitu diversity in integrated vertical-flow constructed wetland [J]. Environmental Engineering, 2014,32(2):38-42.

[42] Lamendella R, Domingo J W, Ghosh S, et al. Comparative fecal metagenomics unveils unique functional capacity of the swine gut [J]. Bmc Microbiology, 2011,11(1):103.

[43] Wagner M, Loy A. Bacterial community composition and function in sewage treatment systems [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13(3):218-227.

[44] Hu M, Wang X, Wen X, et al. Microbial community structures in different wastewater treatment plants as revealed by 454- pyrosequencing analysis [J]. Bioresource Technology, 2012,117:72– 79.

[45] Ducey T F, Hunt P G. Microbial community analysis of swine wastewater anaerobic lagoons by next-generation DNA sequencing [J]. Anaerobe, 2013,21(6):50-57.

[46] Wang X, Hu M, Xia Y, et al. Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in 14wastewater treatment systems in China [J]. Bioresource Technology, 2012,78(19):7042-7047.

[47] Yu K, Zhang T. Metagenomic and metatranscriptomicanalysis of microbial community structure and gene expression of activated sludge [J]. PLoS One, 2012,7(5):e38183.

[48] Cydzik-Kwiatkowska A, Zielińska M. Bacterial communities in full-scale wastewater treatment systems [J]. World J Microbiology & Biotechnology, 2016,32(4):66.

[49] Looft T J T, Allen H K, Bayles D O, et al. In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012,109(5): 1691-1696.

Microbial community structure and dynamics in swine wastewater treatment system.

HUANG Wei1, LIU Lan-ying1, WU Miao-hong1, CHEN Li-hua1, Lü Xin1, YE Mei-feng2, LIN Dai-yan2, SONG Yong-kang1*

(1.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China；2.Institute of Agricultural Engineering and Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)., 2019,39(2)：839~848

To elucidate the bacterial community dynamics in swine wastewater treatment system, the bacterial community characteristics in different treatment units of swine wastewater was analyzed by Illumina Miseq high-throughput sequencing technologies, and the correlation between bacterial community and water quality or antibiotics was investigated. The results demonstrated that microbial community structure varies greatly in different wastewater treatment processes. The dominant bacteria in fouling pool and anaerobic reator were Firmicutes, Bacteroidetes and Proteobacteria, the dominant bacteria in aeration tan were Firmicutes, Verrucomicrobia, Bacteroidetes, Proteobacteria and Candidatus Saccharibacteria, while in oxidation pond, the dominant bacteria were Firmicutes, Proteobacteria, Chloroflexi, Euryarchaeota and Bacteroidetes. The microbial comminity structure in wasterwater treatment system was significantly correlated with both water quality and antibiotics (<0.05).,,,correlated closely with COD、TN、NH4+-N.correlated closely with TN、NH4+-N.,,,extremely significant positively correlated with sulfamethoxazole, sulfamethoxazole, doxycycline, oxytetracycline.,,significant positively correlated with enrofloxacin and tetracycline.,positively correlated with ciprofloxacin.,positively correlated ofloxacin.

swine wastewater；bacterial community；water quality；antibiotics

X172

A

1000-6923(2019)02-0839-10

黃 薇(1986-),女,江西撫州人,助理研究員,碩士,主要從事環(huán)境微生物組學(xué)方面研究.發(fā)表論文40余篇.

2018-07-03

福建省公益類科研院所專項(2015R1025-8,2018R1018-1);福建省農(nóng)科院全產(chǎn)業(yè)鏈科技示范項目(kjFW19)

* 責(zé)任作者, 研究員, songlibby@sina.com