采用四氯化碳誘導(dǎo)家兔肝纖維化模型的建立研究

劉閃閃，徐麗紅，李瓊，張俐娜，劉帆，楊欣，李軍

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，有研究表明，肝纖維化向肝硬化的發(fā)展是漸進(jìn)、可逆的過程，因此逆轉(zhuǎn)肝纖維化、防止其進(jìn)一步發(fā)展已經(jīng)成為慢性肝病防治中的關(guān)鍵問題［1-2］。建立肝纖維化動(dòng)物模型對(duì)肝纖維化的診斷研究及防治有重要意義，也是臨床人體研究的前提［3-4］。家兔飼養(yǎng)簡單、肝臟大小適中，是常用的肝纖維化動(dòng)物模型，四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)法是國內(nèi)應(yīng)用最多的肝纖維化建模方法［5］。本研究對(duì)家兔皮下注射純CCl4，旨在建立一種穩(wěn)定的、死亡率較低的家兔肝纖維化模型，為臨床抗炎、抗纖維化研究提供依據(jù)。

1 動(dòng)物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2015年4—9月，選用健康新西蘭大白兔46只，不限雌雄，體質(zhì)量2.0～3.5 kg，4～6月齡，由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。家兔均飼養(yǎng)在層疊式不銹鋼絲籠中，喂食2次/d，100 g/次，自由飲用自來水。動(dòng)物房通風(fēng)良好，排氣扇24 h開放，并使用循環(huán)風(fēng)紫外線消毒機(jī)消毒至少2次/d。46只家兔分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，編號(hào)為01～46，根據(jù)其體質(zhì)量是否≥3.0 kg將家兔分為A組、B組，再使用抽簽法分別將上述兩組隨機(jī)分為4組（A0～A3，B0～B3），A0和B0組合為G0組，余類推。其中，G0組為對(duì)照（10只），G1～G3組進(jìn)行造模（各12只）。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)家兔的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 分析純CCl4（含量≥99.5%）購于天津永晟精細(xì)化工有限公司；10%中性甲醛組織固定劑購于中山市康乃欣生物醫(yī)療科技有限公司；分析純水合氯醛（含量≥99.5%）購于天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2.2 模型制作 G0組皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.5 ml/kg，G1～G3組分別以 0.2、0.3、0.5 ml/kg的分析純CCl4背部皮下注射，2次/周，共16周，每周稱重1次。G2組起始劑量為0.3 ml/kg，3周后增加劑量為0.4 ml/kg，5周后增加劑量為0.5 ml/kg，此后維持劑量在0.5 ml/kg。造模后第4、6、8、10、12、14周，分別從G1～G3組隨機(jī)選取1只家兔，8%水合氯醛鹽溶液2 ml/kg耳緣靜脈緩慢注射，根據(jù)實(shí)際麻醉情況自行調(diào)整麻醉劑量。麻醉成功后，立即處死家兔并取3.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的肝組織標(biāo)本。

第16周處死所有G1～G3組家兔及2只G0組家兔，造模期間死亡的家兔立即取肝組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2.3 病理學(xué)檢查 肝組織標(biāo)本于10%中性甲醛溶液中固定48 h后，取10 mm×10 mm×15 mm肝臟標(biāo)本置于脫水盒中，放入脫水機(jī)自動(dòng)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片5張，厚度為3～5 μm。分別進(jìn)行HE及Masson染色，染色后的切片由病理科醫(yī)師獨(dú)立、盲法閱片。采用Metavir分期法，根據(jù)肝臟炎性壞死程度及肝包膜、匯管區(qū)、肝竇壁及中央靜脈等處的膠原纖維增生情況對(duì)肝臟標(biāo)本進(jìn)行肝纖維化分期，F(xiàn)0期：無纖維化；F1期：匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限竇周及小葉內(nèi)纖維化；F2期：匯管區(qū)周圍纖維化，纖維化形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；F3期：纖維間隔板小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；F4期：早期肝硬化［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。家兔死亡率及肝纖維化造模成功率的比較采用Fisher12 3s確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模期間家兔一般情況 造模期間，G0組家兔均表現(xiàn)活潑，毛發(fā)有光澤，進(jìn)食正常，大小便正常，體質(zhì)量逐漸增加。G1～G3組家兔活動(dòng)度欠佳，常靜臥于籠中，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，肌肉松弛，肌張力差。毛發(fā)日漸蓬松、脫落、稀疏，進(jìn)食減少，大小便次數(shù)及量減少，體質(zhì)量日趨下降（見圖1）。另外，G1～G3組家兔免疫力下降，注射部位皮膚經(jīng)久不愈，甚至糜爛，其中2只家兔出現(xiàn)結(jié)膜炎、耳部感染。

2.2 造模3周內(nèi)家兔死亡情況 各組造模3周內(nèi)家兔死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值=7.004，P=0.048）；其中，G3組家兔死亡率均高于G0、G1、G2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見表1）。造模3周內(nèi)死亡的7只家兔，均發(fā)生在該次造模后24～48 h，造模4周后無家兔死亡。

2.3 病理學(xué)檢查 造模期間死亡的家兔肝組織表面光滑，質(zhì)地較軟，病理顯示不同程度肝細(xì)胞腫脹、壞死，未見肝纖維化形成。G1～G3組造模第4、6、8、10、12、14周處死的家兔，肝纖維化分期見表2。第16周時(shí)處死G1～G3組家兔及2只G0組家兔，肝纖維化分期見表3。第16周時(shí)，成功建立各分期的家兔肝纖維化模型（見表4）。G1～G3組造模成功率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值=4.747，P=0.165）。家兔肝纖維化各分期病理學(xué)檢查結(jié)果見圖2、3。

3 討論

肝纖維化動(dòng)物模型的建立有多種方法［3］，需同時(shí)兼顧造模的重復(fù)性、可預(yù)測(cè)性、可比性和經(jīng)濟(jì)性等多因素，CCl4造模法最常使用［5］。

不同的給藥途徑可產(chǎn)生不同的造模效果，CCl4造模法常見的給藥途徑有口服、腹腔注射、皮下注射等，有學(xué)者采用皮下注射法成功建立了大鼠肝纖維化模型［7-8］。周賢等［8］研究顯示，CCl4皮下注射法建立動(dòng)物肝纖維化模型死亡率低，成模時(shí)間短。劉滿榮等［9］通過不同給藥途徑建立家兔肝纖維化模型的對(duì)比研究認(rèn)為，腹腔注射吸收快，肝毒性大，易導(dǎo)致急性肝衰竭；喂養(yǎng)法CCl4服入劑量受動(dòng)物食欲影響較大，有效劑量難以控制，導(dǎo)致CCl4的刺激性和肝毒性較小，造模周期長；皮下注射給藥時(shí)吸收較緩慢，較符合肝纖維化形成的緩慢過程，是最佳的給藥途徑。

圖1 造模期間G0～G3組家兔體質(zhì)量變化Figure 1 Weight changes of rabbits in groups G0，G1，G2 and G3 during modeling

表1 各組家兔造模3周內(nèi)（前6次造模）死亡情況（只）Table 1 Death number in the four groups within three weeks of modeling by the first six interventions

表2 造模8～14周處死家兔肝纖維化分期（期）Table 2 Staging of liver fibrosis of rabbits in groups G1，G2 and G3 sacrificed between the 8th and 14th weeks of modeling

表3 造模16周時(shí)G0～G3組家兔肝纖維化分期（只）Table 3 Staging of liver fibrosis of rabbits in the four groups at the end of the 16th week of modeling

圖2 家兔肝纖維化各分期病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，×40）Figure 2 Pathological fibrosis staging in rabbits12 3 liver tissue

圖3 家兔肝纖維化各分期病理學(xué)檢查結(jié)果（Masson染色，×40）Figure 3 Pathological fibrosis staging in rabbits12 3 liver tissue

表4 G1～G3組家兔肝纖維化造模成功只數(shù)（只）Table 4 The number of successfully establishing rabbit models of liver fibrosis in groups G1，G2 and G3

肝臟細(xì)胞具有較強(qiáng)的再生修復(fù)機(jī)制，為維持有效的肝損傷效果，恰當(dāng)?shù)慕o藥時(shí)間間隔十分重要。研究顯示，48 h內(nèi)重復(fù)給藥容易導(dǎo)致動(dòng)物急性中毒死亡，而給藥超過4～5 d，肝細(xì)胞可迅速恢復(fù)，因此最有效的時(shí)間間隔為 3 d［10］。

研究顯示，造模周期取決于給藥劑量和給藥途徑，一般周期為8～16周［11］。CHANG等［12］研究表明，增加CCl4劑量可縮短造模周期，但也會(huì)增加死亡率。

家兔肝臟體積適中，血容量大，更適用于病理學(xué)和影像學(xué)觀察研究，因此本研究選用家兔作為模型動(dòng)物。而造模過程中給藥劑量國內(nèi)研究尚未統(tǒng)一［13-14］，結(jié)合上述文獻(xiàn)，本研究設(shè)定G1～G3組，分別以0.2、0.3、0.5 ml/kg劑量的分析純CCl4背部皮下注射，2次/d。參考陳寶祥等［14］研究，G2組起始劑量設(shè)為0.3 ml/kg，3周后增加劑量為0.4 ml/kg，5周后增加劑量為0.5 ml/kg，此后維持劑量在0.5 ml/kg。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模期間家兔死亡多發(fā)生在3周內(nèi)，4周后趨于穩(wěn)定，主要原因是初期家兔因CCl4肝毒性劇烈而迅速，難以及時(shí)代謝，導(dǎo)致急性肝衰竭而死亡。死亡多發(fā)生在該次造模后的24～48 h，這與藥物代謝動(dòng)力學(xué)有關(guān)，藥物在肝臟的濃度于24～48 h到達(dá)峰值，之后便逐漸減小。本研究G3組死亡率（5/12）高于其他各組，與丁可等［13］研究不同，該研究中0.5 ml/kg組前3周死亡率僅為20%，考慮與家兔品種、環(huán)境氣候以及樣本量小有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。陳寶祥等［14］研究顯示，劑量遞增法建立家兔肝纖維化模型的死亡率僅為7.1%，本研究G2組死亡率（1/12）與之相近。劑量遞增法可誘導(dǎo)家兔耐受，不至于因高劑量、高濃度的CCl4加大肝臟負(fù)擔(dān)、難以快速代謝，最終因急性肝衰竭而死亡。同時(shí)也觀察到，在造模后24～48 h，家兔進(jìn)食、排便活動(dòng)明顯減弱，48 h后逐漸恢復(fù)。因此，可根據(jù)家兔造模過程中的進(jìn)食、排便情況來判斷其對(duì)CCl4的耐受和代謝情況，進(jìn)而實(shí)時(shí)調(diào)整給藥方案。此外，CCl4具有強(qiáng)毒性，嚴(yán)重破壞機(jī)體機(jī)能、削弱自我修復(fù)能力，因此注射部位常出現(xiàn)糜爛、潰瘍，經(jīng)久不愈。G1～G3組家兔免疫力也明顯下降，易罹患其他疾病，如眼結(jié)膜炎、腹瀉、便秘等。

本研究造模第4周開始每2周處死1只G1～G3組家兔以了解造模進(jìn)展，第14周時(shí)G2組和G3組均形成F4期模型，故決定于第16周處死所有G1～G3組家兔觀察造模成功率。G1組起始劑量小、3周內(nèi)死亡率低，但造模周期長，至第16周時(shí)僅有2只家兔形成F4期模型。G3組起始劑量高，雖然14周時(shí)即形成F4期模型，但短期內(nèi)死亡率高，至第16周時(shí)僅存活1只家兔。G2組采用劑量遞增法，低劑量誘導(dǎo)機(jī)體耐受，降低了早期死亡率，在14周時(shí)即形成F4期模型。

綜上所述，采用CCl4皮下注射，起始劑量為0.3 ml/kg并劑量遞增，可成功建立死亡率低的家兔肝纖維化模型，該造模方法值得在科研實(shí)驗(yàn)中推廣使用。

志謝：特別感謝石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科及石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)教研室李述剛對(duì)本研究的幫助。

作者貢獻(xiàn)：李軍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；徐麗紅、李軍進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；劉閃閃、李瓊、張俐娜、劉帆、楊欣進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理；劉閃閃進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，并撰寫論文；劉閃閃、李瓊進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；劉閃閃、李軍進(jìn)行論文的修訂，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。