CircRNAs在骨科常見病診治中的研究進展

何 鵬，武振方綜述，劉曉偉，許 斌審校

0 引 言

環(huán)狀RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一種廣泛存在于真核細胞中的具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性特殊非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）［1］。早在1976年Sanger等［2］在研究類病毒RNA時首次在電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)證實了circRNA存在，與常規(guī)病毒結(jié)構(gòu)不同，其是一種無蛋白質(zhì)外殼包裹的單鏈閉合的RNA分子，然而限于當時的檢測方法及研究技術，發(fā)現(xiàn)初期并未引起人們的重視［3-4］。但隨著高通量測序技術及生物信息技術的出現(xiàn)和廣泛應用，學者們預測人體內(nèi)至少存在約20 000種circRNAs，其數(shù)量超過相應線性RNA的10倍［3-5］。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可特異性結(jié)合微小RNA（micro RNA，miRNA），通過其分子海綿機制參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，也可與RNA結(jié)合蛋白（RNA bindingproteins，RBPs）結(jié)合或直接翻譯表達蛋白質(zhì)在眾多疾病中發(fā)揮生物學調(diào)控作用［6-11］。此外，越來越多的研究證實circRNAs在腫瘤（如鼻咽癌［7］、肺癌［12］、胃癌［13］、骨肉瘤［14］等）、心血管系統(tǒng)疾?。?］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5］以及運動系統(tǒng)疾?。ü顷P節(jié)炎［16］、腰椎間盤突出［17］）的發(fā)生發(fā)展和治療中起著重要作用。本文就近年來circRNA在骨科系統(tǒng)疾病中的研究情況作一綜述。

1 CircRNAs的生物學特性及功能

CircRNAs由3'和5'端相連形成共價閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由于沒有5'-3'的極性以及多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，使得其可免受核酸外切酶或水解酶的降解，因而其在細胞內(nèi)比線性RNA更加穩(wěn)定［1，11］。CircRNAs一般由幾百個核苷酸構(gòu)成，可來源于基因組的各個片段，大多數(shù)circRNAs來源于外顯子，主要分布在細胞質(zhì)，而少數(shù)來源于內(nèi)含子，主要存在于細胞核內(nèi)。而根據(jù)序列形成和組合方式的不同，可將circRNA分為3種類型：外顯子circRNA（exonic circRNA，ecRNA）、內(nèi)含子 circRNA（ circular intronicRNA，ciRNA）和外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-introncircRNA，EIciRNA）。此外，circRNA還具有高度的物種保守性和時空特異性，各物種間遺傳穩(wěn)定性較好，在不同物種中存在較多相似序列，但在不同的組織中或同一組織不同的發(fā)育時期，circRNAs的種類和表達量亦千差萬別［18-19］。

既往大量研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可通過不同的分子機制在眾多疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其主要的分子功能為：①miRNA海綿，circRNAs內(nèi)具有相同的miRNA響應元件（miRNA response element，MRE），可通過競爭性結(jié)合miRNA靶向調(diào)控目的基因的表達。CDR1as/ciRS-7是首個被發(fā)現(xiàn)具有miRNA分子海綿作用的circRNA，含有74個miR-7結(jié)合位點，其可通過競爭性結(jié)合miR-7而阻礙其目的基因的表達而發(fā)揮作用［20］。Zhang等［8］證實BMSCs細胞中circIGSF11能與miR-199b-5p結(jié)合，從而阻礙miR-199b-5p通過GSK-3β信號通路來調(diào)節(jié)BMSCs的分化及新骨形成；②直接與mRNA結(jié)合，circRNAs直接參與mRNA選擇性剪接或轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，如ci-ankrd52及ci-sirt7能夠直接與polⅡ復合物相互作用，下調(diào)相關錨蛋白重復域52（parent gene ankrd52）或去乙?；?的基因表達。EIci-RNA也可與小核糖體U1snRNP相互作用，繼而與polⅡ結(jié)合促進親本基因的轉(zhuǎn)錄［21］；③與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，CDRlas可與miRNA作用因子Ago2蛋白結(jié)合共同發(fā)揮蛋白水解功能［22］。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs還可與其他RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定地的RNA-蛋白復合 體（RNA-protein complexes，RPCs），如 RNA quaking（QKI）、盲肌蛋白（muscle blind，MBL）、真核起始因子4A-III（EIF4A3）等；④直接翻譯合成蛋白，circRNAs可作為翻譯的模板指導蛋白質(zhì)的合成，Wang等［23］在體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)瞬時載入circRNA-GFP可直接轉(zhuǎn)錄翻譯出完整功能的GFP蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在真核細胞中乙型肝炎病毒的亞病毒衛(wèi)星病毒能夠以天然存在的circRNA形式編碼出單一的蛋白質(zhì)［24］；⑤circRNAs的其他功能：circRNAs能調(diào)控細胞間信號通路［25］、影響細胞分化［8］、形成假基因［26］及參與應激反應等，從而影響疾病的發(fā)生及發(fā)展過程。

2 CircRNAs與骨科相關疾病

2.1 CircRNAs與骨性關節(jié)炎骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種由多種因素引起以關節(jié)疼痛為主要癥狀的退行性疾病，其病理特點為關節(jié)軟骨變性壞死，滑膜炎性病變，骨贅形成。常好發(fā)于中老年人群，65歲以上的人群50%以上為OA患者，也是老年致殘的主要因素之一。既往研究利用基因芯片或高通量測序技術在正常軟骨和OA患者關節(jié)軟骨中篩選出大量差異性表達的cirRNA并通過生物信息技術預測其靶基因、信號通路，構(gòu)建共表達網(wǎng)絡，為較多疾病的機制研究提供重要參考。Zhou等［9］將IL-1β誘導的大鼠OA模型組與正常對照組比較發(fā)現(xiàn)255種circRNAs出現(xiàn)了差異性表達，其中在OA模型組中有119種circRNAs表達上調(diào)，136種circRNAs表達出現(xiàn)了下調(diào)，并通過熒光定量PCR驗證cirRNA-36866，cirRNA-33186，cirRNA-2443，cir-RNA-7063呈顯著性上調(diào)，而cirRNA-30365，cirRNA-33736，cirRNA-2483呈顯著性下調(diào)。也通過GO分析（Gene Ontology）和信號通路富集分析以及circRNA-miRNA共表達網(wǎng)絡的構(gòu)建來預測差異性表達circRNAs的功能。Liu等［27］在損傷軟骨與正常軟骨中篩選出104種差異性表達的circRNAs，其中44種circRNAs表達上調(diào)，60種circRNAs表達下調(diào)，并構(gòu)建了包括45種circRNAs、42種miRNAs和42種mRNAs的circRNAs-miRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡，預測并驗證了circRNAs-MSR可調(diào)控TNF-α的表達，也可參與軟骨細胞外基質(zhì)的降解過程。

學者們在基因芯片和高通量測序研究的基礎上，對circRNA調(diào)控骨關節(jié)炎的具體機制特別是其在關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）調(diào)控方面也做了進一步的研究。ECM主要由聚集蛋白聚糖（aggregate proteoglycan，AGG）和Ⅱ型膠原（ColⅡ）組成，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）則是細胞外基質(zhì)降解的催化酶。Liu等［28］發(fā)現(xiàn)circRNA-CER能作為miR-136海綿，上調(diào)MMP13表達，從而促進關節(jié)軟骨細胞ECM的降解。Circ-0005105可通過競爭性結(jié)合miR-26a也可促使MMP13表達上調(diào)，同時抑制ColⅡ和AGG的表達，共同參與促進ECM降解過程［16］。眾所周知，炎性因子白介素（IL）、腫瘤壞死因子、煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、內(nèi)脂素等也在骨性關節(jié)炎的進展中起著關鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)Circ-0005105在促進軟骨細胞ECM降解的同時也可促進PGE2、IL-6、IL-8和煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的生成，提示circ-0005105可能參與促進軟骨細胞炎癥反應的發(fā)生。Li等［29］發(fā)現(xiàn)circ-0045714可通過抑制miR-193b的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)miR-193b的靶基因胰島素樣生長因子2受體表達，進而上調(diào)軟骨細胞ColⅡ和AGG表達，提示circ-0045714可抑制軟骨細胞的凋亡，為OA的治療提供了新的思路。

2.2 CircRNAs與骨肉瘤骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是原發(fā)于骨髓腔的高度惡性實體腫瘤，起源于間葉組織，好發(fā)于10～20歲青少年，惡性程度高，易于復發(fā)和肺部轉(zhuǎn)移，預后也較差。近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展、遷移、惡變中發(fā)揮著重要作用。Chen等［14］將骨肉瘤細胞系（MG63，Saos-2及U2OS）與正常成骨細胞（hFOB）對比研究發(fā)現(xiàn)110種circRNAs呈差異性表達，骨髓瘤細胞存在8種circRNAs表達上調(diào)，102種circRNAs表達下調(diào)，通過生物信息分析預測circRNA-101391、circRNA-101139、circRNA-100413可能作為 miR-338-3p及miR-142-5p的分子海綿，進而上調(diào)細胞黏附因子1（cell adhesion molecules 1，CADM1）基因的表達。而CADM1作為一種新的抑癌基因，廣泛參與細胞間黏附及信號轉(zhuǎn)導，常在惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達，因而提示上述circRNAs可能為治療骨肉瘤的新的方向。Zhang等［30］分別將骨肉瘤細胞與正常成骨細胞、30例骨肉瘤患者腫瘤標本與瘤旁正常組織對比研究發(fā)現(xiàn)circRNA-UBAP2在骨肉瘤細胞及骨肉瘤患者腫瘤標本中均存在明顯過量表達，其表達量與腫瘤分級和患者生存時間也顯著相關，進一步研究可知其能作為miR-143的分子海綿，促進細胞凋亡相關基因B淋巴細胞瘤-2的表達，抑制腫瘤細胞的凋亡，因而提示circRNA-UBAP2可能作為一種致癌基因在OS形成生長中起到促進作用。Deng等［31］研究認為circ-009910能作為miR-449a的分子海綿刺激激活IL-6R的表達，并通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號通路來調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的凋亡和壞死，因而提示circRNAs可能作為治療骨肉瘤的潛在靶點。

而在治療上雖然新輔助化療使得骨肉瘤的5年生存率提高到50%以上，但隨著生存期的延長，部分骨肉瘤患者對常規(guī)化療藥物會產(chǎn)生耐藥，會造成腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及生存時間。Zhu等［25］通過比較80例術前采用2周期新輔助化療（MTX，DXR，DDP，IFO）的骨肉瘤患者腫瘤標本及瘤旁正常組織發(fā)現(xiàn)circRNA-PVT1在OS組織中明顯過量表達，并在體外細胞實驗中將3組耐藥骨肉瘤細胞株及非耐藥骨肉瘤細胞株（MG63R vs MG63，U2OSR vs U2OS，KHOSR vs KHOS）及正常成骨細胞（hFOB）進行比較，發(fā)現(xiàn)六種骨肉瘤細胞株中circRNA-PVT1含量均明顯高于正常細胞組，而3種耐藥骨肉瘤細胞株的circRNA-PVT1含量亦明顯高于非耐藥骨肉瘤細胞株。將特異性靶向circRNAPVT1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入耐藥性細胞株中（MG63R，U2OSR），耐藥組骨肉瘤細胞株對化療藥物（DDP、DXR）的IC50值及耐藥組細胞活力均明顯降低，提示circRNA-PVT1能明顯減弱骨肉瘤細胞的耐藥性能。ATP結(jié)合蛋白亞家族1抗體（ATP-binding cassette sub-family B member 1，ABCB1）是 ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在人類多種腫瘤細胞（如卵巢癌、乳腺癌等）細胞中均過度表達并參與多種組織來源的腫瘤多藥耐藥的形成［32］。研究發(fā)現(xiàn)circRNA-PVT1能通過下調(diào)ABCB1基因的表達來削弱多耐藥骨肉瘤細胞的耐藥性能，可為耐藥性骨肉瘤的治療提供新的潛在靶點［25］。

2.3 CircRNAs與腰椎椎間盤退變腰椎間盤退行性疾病是骨科門急診常見的以下腰痛為主要表現(xiàn)的疾病，其終生患病率可高達39%以上。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs也參與椎間盤退變過程，在其疾病的發(fā)生發(fā)展以及治療中也起著至關重要的作用。Zhou等［33］將退變的椎間盤與脊柱側(cè)彎患者正常的椎間盤進行對比研究發(fā)現(xiàn)636種circRNAs出現(xiàn)了差異性表達，其中在退變的椎間盤組中有354種circRNAs表達上調(diào)，282種circRNAs表達出現(xiàn)了下調(diào)，通過RT-qPCR驗證circRNA-103890的差異性表達，并利用生信分析預測circRNA-103890可能通過特異性位點與miR-185-5p結(jié)合進而調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。Song等［34］將脊髓型頸椎病的椎間盤組織與平山病（hirayama disease）患者的椎間盤通過基因芯片技術篩選出792種circRNAs出現(xiàn)了差異性表達，實驗組有428種circRNAs表達上調(diào)，364種circRNAs表達下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)has-circRNA-104670的表達量與椎間盤Pfirmann分級有明顯的線性相關性，也即退變分級越高，circRNA-104670的表達量越多。研究發(fā)現(xiàn)circRNA-104670能作為miR-17-3p分子海綿，競爭性抑制miR-17-3p靶基因的表達，進而使MMP-2的表達上調(diào)、COL-II的表達下調(diào)，因此提示circRNA-104670能競爭性結(jié)合miR-17-3p而促進ECM的降解進而參與椎間盤退變的發(fā)生及發(fā)展。Cheng等［17］發(fā)現(xiàn)circ-VMA21能抑制凋亡相關蛋白酶（caspase-3，caspase-7，caspase-9）以及細胞外基質(zhì)降解酶（MMP-3，MMP-3，ADAMTS-4，ADAMTS-5）在髓核細胞的表達，同時也能促進COL-II及AGG的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)circ-VMA21作為分子海綿競爭性地與miR-200c結(jié)合，從而調(diào)節(jié)XIAP信號通路來參與椎間盤的退變過程。研究還通過向小鼠退變模型注射circ-VMA21驗證其可減緩小鼠椎間盤退變模型椎間盤的退變，為椎間盤退變的相關疾病的治療提供了新的方向。

2.4 CircRNAs與骨質(zhì)疏松癥骨質(zhì)疏松癥是一種老年人尤其是絕經(jīng)后婦女常見的全身性骨代謝障礙性疾病，其特征是骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，從而致使骨脆性增加而極易發(fā)生骨折［35-36］。目前公認的骨質(zhì)疏松癥診斷標準是雙能X線吸收檢測法測量的結(jié)果，其診斷標準為T值≤-2.5。Jin等［37］將骨質(zhì)疏松癥患者與正常人血清樣本進行對比研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者中有106種circRNAs表達上調(diào)，154種circRNAs表達下調(diào)，其中差異性最為顯著的 10種 circRNA分別為 circRNA-0010452、circRNA-0022348、 circRNA-0015566、 circRNA-0003323、circRNA-0013121和circRNA-0021739、circRNA-0011269、 circRNA-0019693、 circRNA-0005245、circRNA-0010349。Zhao等［38］將41例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者與58例絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松癥患者的血液進行分析，發(fā)現(xiàn)381種circRNAs出現(xiàn)差異表達的（203種上調(diào)和178種下調(diào)），并通過RT-qPCR證實circ-0001275在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組內(nèi)呈高表達，線性回歸分析提示circ-0001275與骨密度值呈顯著相關性，其ROC曲線下面積為0.759，特異度和敏感度分別為0.853和0.664，因而circ-0001275可作為一種新型的診斷標記物應用于診斷絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥。

眾所周知，骨代謝是成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收的動態(tài)平衡過程，成骨細胞減少或破骨細胞的增多致使該平衡被打破，易引起骨質(zhì)疏松癥。Dou等［39］研究發(fā)現(xiàn)circRNAs參與破骨細胞形成的過程，在前體期、成熟期和活化期均有不同種類的circRNA呈差異性的上調(diào)和下調(diào)，采用VENN分析發(fā)現(xiàn)在破骨細胞的3種狀態(tài)下有24種相同的circRNAs均出現(xiàn)顯著的差異性表達，并根據(jù)生信分析推測circRNA-010763可能與miR-103表達有關。隨后研究也證實了circRNA-010763在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松組患者中存在明顯差異性表達現(xiàn)象［37］。由此可見circRNAs在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中發(fā)揮著至關重要的作用，同時外周全血中circRNA含量也高于相應線性RNA水平，同時自身環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其擁有良好的穩(wěn)定性，故有望成為骨質(zhì)疏松癥診斷的分子生物標記物。

3 結(jié)語與展望

CircRNAs本身特有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了其獨特的功能，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在很多疾病的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、惡變和轉(zhuǎn)移等過程中都發(fā)揮著重要作用。但當前cirRNA在骨科疾病中的研究主要還是集中在其作為內(nèi)源競爭性RNA（ceRNA）發(fā)揮分子海綿作用吸附miRNA進而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程方面。而cirRNA參與調(diào)控mRNA選擇性剪接或轉(zhuǎn)錄、與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合發(fā)揮蛋白降解功能以及直接翻譯合成蛋白等其他的分子功能是否也參與骨科疾病的調(diào)控尚需進一步研究證實。circRNAs自身環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其具有比miRNA和lncRNA較好的穩(wěn)定性，隨著對circRNAs的研究深入，筆者認為circRNAs終將在骨科疾病的發(fā)病機制、特異性診斷、靶向基因治療等方面發(fā)揮其巨大的潛能。