姜春霞 ,黎 平 ,李森楠 ,刁曉平, *,黃 煒 ,王道儒,葉翠杏
1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,海南 ???570228;2. 海南大學(xué)南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 570228;3. 熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ???571158;4. 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院,海南 ???570125
抗生素作為養(yǎng)殖業(yè)防治細(xì)菌性疾病和刺激生長(zhǎng)的重要助力,常作為防病藥物及飼料添加劑而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。有研究報(bào)道,抗生素被攝入動(dòng)物體內(nèi)后,有近85%以上的原藥會(huì)隨著動(dòng)物糞便或尿液排除體外,進(jìn)入自然環(huán)境(Hartmann et al.,1998)。殘留在環(huán)境中的抗生素會(huì)對(duì)環(huán)境中微生物產(chǎn)生選擇壓力,從而誘導(dǎo)抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)產(chǎn)生。ARGs可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)遺傳元件(Mobile Genetic Elements,MGEs)在不同菌株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移(Gogarten et al.,2005;Schlüter et al.,2007),從而使得更多微生物獲得抗生素抗性。相關(guān)研究表明,在使用過(guò)抗生素的養(yǎng)殖環(huán)境中,攜帶ARGs的耐藥性菌株的種類(lèi)和數(shù)量日益增加,ARGs將通過(guò)食物鏈最終進(jìn)入人體,這將給人類(lèi)健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)隱患。Pruden et al.(2006)認(rèn)為ARGs是一種新型污染物,世界衛(wèi)生組織(WHO)也已將 ARGs列為21世紀(jì)威脅人類(lèi)健康的最重大挑戰(zhàn)之一(王麗梅等,2010),其污染問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。
針對(duì)磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)抗生素的耐藥菌通常攜帶有一種或多種耐藥機(jī)制的ARGs。包括介導(dǎo)藥物靶位點(diǎn)改變機(jī)制的基因 sul1、sul1、dfrA1,介導(dǎo)抗生素外排機(jī)制基因cmle1、cmle3、tetA、tetC、tetG,介導(dǎo)藥物靶位點(diǎn)保護(hù)機(jī)制基因tetM、qnrS,介導(dǎo)藥物活性位點(diǎn)失活的耐藥基因cata1、cata2。這些基因在人體、畜禽及多重環(huán)境介質(zhì)分離菌中均被定性檢出(李壹等,2016)。研究表明,水產(chǎn)養(yǎng)殖是ARGs的重要來(lái)源,許多ARGs在中國(guó)乃至世界各地的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境或飼養(yǎng)對(duì)象中都有檢出(Muziasari et al.,2016;Stalin et al.,2016)。然而,目前的研究大多針對(duì)畜禽及淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素及ARGs的檢測(cè)(Wang et al.,2016;Qian et al.,2017;Czekalski et al.,2014;Harnisz et al.,2015;Marti et al.,2018),而對(duì)海水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境關(guān)注較少。
海南省抗生素排放在中國(guó)處于中等偏高水平(Zhang et al.,2015),抗生素的高水平排放將會(huì)給當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境帶來(lái)挑戰(zhàn)。東寨港位于海南省東北部,是國(guó)家級(jí)紅樹(shù)林濕地自然保護(hù)區(qū),已列入世界重要濕地保護(hù)名錄,具有重要的生態(tài)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí),東寨港海水養(yǎng)殖區(qū)是海南重要的灘涂養(yǎng)殖基地,其周邊陸地區(qū)域也存在大量的養(yǎng)殖塘,該區(qū)域抗生素及其引起的ARGs污染不容小覷。在以往的研究中,有關(guān)該區(qū)域抗生素及ARGs的研究未見(jiàn)報(bào)道。基于此,本研究將對(duì)該區(qū)域抗生素及ARGs進(jìn)行調(diào)查,具體內(nèi)容包括:(1)分析沉積物和海水中12種 ARGs的豐度、分布特征及;(2)16種抗生素的殘留狀況;(3)比較東寨港海水和沉積物中ARGs的分布差異;(4)初步分析ARGs豐度與抗生素殘留的關(guān)系。本研究旨在為規(guī)范當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖管理和評(píng)估生態(tài)環(huán)境現(xiàn)狀提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
圖1 采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Location of sampling sites
東寨港形似漏斗,屬溺谷型港灣,海岸線總長(zhǎng)84 km,灘涂水域面積5400 hm2(李仕平等,2017)。本研究于2016年6月進(jìn)行樣品采集,采樣點(diǎn)如圖1所示,共設(shè)置 10個(gè)采樣點(diǎn)(S1-S10),采集海水和沉積物樣品。其中,S1靠近內(nèi)陸;S2-S5淺海區(qū)域均有灘涂養(yǎng)殖區(qū),且周?chē)0毒嬖陴B(yǎng)殖塘;S6、S7靠近養(yǎng)殖塘;S8、S9靠近鋪前碼頭;S10靠近外海,是鋪前出海要塞。采樣區(qū)域由內(nèi)港向入??诜较蜓由欤赏暾尸F(xiàn)該區(qū)域內(nèi)港至外港抗生素及ARGs的污染趨勢(shì)及水平。使用采水器采集表層0-0.5 m海水并裝入滅菌采樣瓶中;用采泥器采集表層沉積物并裝入鋁盒(121 ℃濕熱滅菌)中;所采集樣品用于ARGs及抗生素檢測(cè)。樣品采集完畢后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,水樣于4 ℃冷藏,沉積物于-20 ℃保存,盡快進(jìn)行樣品處理。
本研究對(duì)東寨港沉積物及海水中4類(lèi)15種抗生素(磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺異惡唑、四環(huán)素、金霉素、土霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)方法及分析條件如下:
1.2.1 沉積物抗生素檢測(cè)
將沉積物樣品冷凍干燥48 h,過(guò)0.30 mm孔徑篩,準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g沉積物至錐形瓶中,向錐形瓶中加入 V(甲醇):V(EDTA-Mcllvaine緩沖液)=1∶1 混合液(10 mL),振蕩30 min,超聲提取10min,靜置,收集提取液。殘?jiān)蒙鲜龇椒ǚ磸?fù)提取兩次,合并提取液。將提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴40 ℃)、濃縮至約10 mL。將LC-SAX(500 mg/3 mL)與LC-18(500 mg/3 mL)進(jìn)行串聯(lián),固定在萃取儀上,萃取富集。用3 mL甲醇(色譜純)洗脫LC-18小柱,收集洗脫液。氮吹濃縮洗脫液至近干。用流動(dòng)相95%A[0.1%甲酸(1∶1,V/V)-1 g·L-1甲酸銨水溶液]和5%B[甲醇-乙腈(1∶1,V/V)]定容至 1 mL,過(guò) 0.22 μm尼龍濾膜,待測(cè)。
1.2.2 海水抗生素檢測(cè)
取1 L已過(guò)濾水樣,用鹽酸-水溶液(1∶1,V/V)調(diào)節(jié)pH至2.5。依次用20 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL鹽酸對(duì)SPE柱進(jìn)行活化。用已活化的SPE柱對(duì)水樣進(jìn)行富集,流速控制在 10 mL·min-1左右。富集完成后用氮?dú)廨p柔吹干富集小柱,將氮吹干燥后的小柱與填有無(wú)水硫酸鈉的小柱串聯(lián),用 6 mL甲醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液。洗脫液氮吹(水浴40 ℃)濃縮至近干。用流動(dòng)相95%A和5%B定容至1 mL,過(guò)0.22 μm尼龍濾膜,待測(cè)。
1.2.3 抗生素分析條件
色譜柱為:ACQUITY UPLC? BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm,美國(guó)waters公司);進(jìn)樣量:10 mL;柱溫:40 ℃;流速為0.30 mL·min-1。流動(dòng)相A為含0.2%甲酸銨的超純水;流動(dòng)相B為含有甲醇和乙腈的混合物(1∶1,V/V)。梯度洗脫程序?yàn)椋浩鹗?% B 3 min,然后在18 min內(nèi)從5% B線性變化至88% B。質(zhì)譜離子源為:ESI+/ESI-切換,MRM數(shù)據(jù)采集模式。
本研究采用外標(biāo)法對(duì)抗生素進(jìn)行定量,用流動(dòng)相配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線以抗生素濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),所得標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)均在0.998之上。水樣中抗生素的回收率為71.6%-112%,檢出限范圍為0.10-4.20 ng·L-1。沉積物中抗生素的回收率為 62.1%-95%,檢出限范圍為0.12-6.3 ng·g-1。
表1 實(shí)驗(yàn)所用序列及PCR反應(yīng)條件Table1 Sequence of primer and condition of PCR reaction in this study
1.3.1 沉積物
每個(gè)樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)重復(fù)稱(chēng)取0.25-0.35 g新鮮樣品,采用 PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒(MoBio,美國(guó))進(jìn)行沉積物總DNA提取,所得DNA用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))測(cè)其含量及純度。DNA樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 海水
于24 h內(nèi)將獲得的水樣依次過(guò)8 μm、5 μm無(wú)菌濾膜以除去雜質(zhì),之后用0.22 μm濾膜過(guò)濾并收集濾膜,用無(wú)菌鋁箔包裹,-20 ℃下保存。用液氮將濾膜研磨成粉末狀,用PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒(MoBio,美國(guó))提取總DNA,并使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))測(cè)定DNA含量及純度。DNA樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
選取 ARGs(sul1、sul2、dfrA1、tetA、tetC、tetG、tetM、cata1、cata2、cmle1、cmle3、qnrS)和16s rRNA作為目的基因,引物設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。對(duì)樣品中12種ARGs目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。擴(kuò)增體系為:14.5 μL Green Master Mix,上下游引物各1.5 μL,2 μL DNA模板(質(zhì)量濃度范圍:10-50 mg·L-1),5.5 μL 無(wú)酶水。擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,退火溫度(見(jiàn)表1)30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工,上海)對(duì)正確的片段進(jìn)行膠回收。將目的基因連接到PGEM-Teasy載體后導(dǎo)入商品化感受態(tài)Trans5α(全氏金,北京)進(jìn)行克隆。每個(gè)平板挑選 40個(gè)克隆子進(jìn)行培養(yǎng)。裂解細(xì)菌,使用SanPrep柱式質(zhì)粒提取試劑盒(生工,上海)進(jìn)行質(zhì)粒抽提。抽提得到的質(zhì)粒使用微量分光光度計(jì)測(cè)其濃度,保存于-80 ℃下備用。
利用一系列稀釋后的質(zhì)粒作為 RT-PCR模板DNA測(cè)定其每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Cycle threshold,tC),以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo),tC值作為縱坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。RT-PCR 反應(yīng)體系為:5 μL SYBR Green Master Mix,上下游引物(表1)各0.5 μL,2 μL DNA模板(質(zhì)量濃度范圍:10-50 mg·L-1),2 μL 無(wú)酶水。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)孵育10 min,95 ℃變性30 s,退火溫度(表1)30 s,共45個(gè)循環(huán)。溶解條件為:95 ℃ 10 s,65 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s??截悢?shù)計(jì)算公式如下:
式中,C0為質(zhì)粒初始濃度;C為質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies·g-1或 copies·μL-1);3015 為 PGEM-Teasy載體長(zhǎng)度;L代表目的基因長(zhǎng)度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示判定系數(shù)R2均大于0.99,線性關(guān)系良好,可用于各 ARGs拷貝數(shù)計(jì)算。使用RT-PCR對(duì)樣品中12種抗性基因和16S rRNA進(jìn)行絕對(duì)定量。將樣品得到的tC值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終計(jì)算出基因絕對(duì)豐度。
基因豐度表達(dá)有兩種表達(dá)方式:絕對(duì)豐度、相對(duì)豐度。絕對(duì)豐度表示目的基因在某一環(huán)境介質(zhì)中的含量;而相對(duì)豐度表示目的基因的絕對(duì)豐度相對(duì)于內(nèi)參基因16S rRNA的變化,可定量表示抗生素對(duì)ARGs的誘導(dǎo)率(冀秀玲等,2011),同時(shí)ARGs的相對(duì)豐度更能反映ARGs在樣本中的分布狀況。相對(duì)豐度計(jì)算如下:
式中,Ar為抗性基因相對(duì)豐度;Aa為抗性基因絕對(duì)豐度;Aa-16SrRNA為16S rRNA基因絕對(duì)豐度。
所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t檢驗(yàn)及One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析,采用Pearson相關(guān)性分析法分析ARGs間或ARGs與抗生素間的相關(guān)性。
2.1.1 海水中抗生素的殘留及分布
本研究 10個(gè)采樣點(diǎn)總抗生素質(zhì)量濃度范圍為0.168-12.963 ng·L-1。不同點(diǎn)位抗生素質(zhì)量濃度高低順序?yàn)椋篠4 (12.963 ng·L-1)>S5 (7.545 ng·L-1)>S3(6.619 ng·L-1)>S2 (6.274 ng·L-1)>S7 (5.368 ng·L-1)>S9 (5.300 ng·L-1)>S1 (4.910 ng·L-1)>S6 (4.460 ng·L-1)> S8 (3.828 ng·L-1)>S10 (0.168 ng·L-1)。15 種抗生素中有 5種抗生素(諾氟沙星、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺吡啶、磺胺異惡唑)被檢出,檢出率分別為 70%、80%、100%、60%、20%。其中諾氟沙星質(zhì)量濃度范圍為 ND(未檢出)-6.170 ng·L-1;磺胺二甲基嘧啶質(zhì)量濃度為 ND-0.925 ng·L-1;磺胺甲惡唑質(zhì)量濃度范圍為 0.168-5.735 ng·L-1;磺胺吡啶質(zhì)量濃度范圍為 ND-0.375 ng·L-1;磺胺異惡唑質(zhì)量濃度范圍為ND-0.133 ng·L-1。
2.1.2 沉積物中抗生素的殘留及分布
沉積物抗生素檢測(cè)中,各樣點(diǎn)總抗生素質(zhì)量濃度范圍為 ND-1.240 ng·L-1,其中 S5(1.240 ng·L-1)質(zhì)量濃度最高,S1、S7、S8(低于檢出限)最低。15種目標(biāo)抗生素中,僅有磺胺吡啶、磺胺異惡唑兩種抗生素被檢出,檢出率分別為50%、60%,其濃度范圍分別為 ND-0.6、ND-0.64 ng·g-1。
2.2.1 海水中ARGs豐度及分布特征
海水中ARGs及16S rRNA絕對(duì)豐度及分布特征見(jiàn)圖2a。由圖可以看出,海水∑ARGs、16S rRNA絕對(duì)豐度分別為 8.68×103-1.37×109copies·L-1、1.01×1010-1.37×1011copies·L-1;∑ARGs相對(duì)豐度為 8.57×10-7-3.45×10-2,最高∑ARGs 相對(duì)豐度(3.45×10-2)出現(xiàn)在S4號(hào)采樣點(diǎn),S3次之(2.68×10-2),S10 最?。?.57×10-7)。在 12 個(gè) ARGs中,sul1、sul2、dfrA1、tetA、tetC、tetG、tetM、cata2、cmle1、cmle3檢出率為90%,cata1檢出率為80%,qnrS檢出率為100%,在樣點(diǎn)S10處僅有qnrS被檢出。在海水樣品中,sul2絕對(duì)豐度最高(5.13×108copies·L-1),sul1 次之(1.21×108copies·L-1),tetM最低(1.16×105copies·L-1)。
2.2.2 沉積物中ARGs豐度及分布特征
沉積物ARGs絕對(duì)豐度以樣品干重進(jìn)行計(jì)量,詳見(jiàn)圖2c。由圖可知,沉積物中∑ARGs和16S rRNA絕對(duì)豐度分別為 1.13×108-5.34×108copies·g-1、1.33×109-1.24×1010copies·g-1;ARGs 相對(duì)豐度為1.57×10-2-1.08×10-1。由圖 2c、圖 2d 可知,各 ARG在沉積物樣品中均有檢出,且檢出率為 100%,說(shuō)明檢測(cè)的 ARGs在沉積物樣品中廣泛存在。ARGs含量水平表現(xiàn)為:磺胺類(lèi)抗性基因>氯霉素類(lèi)抗性基因>四環(huán)素類(lèi)抗性基因>喹諾酮類(lèi)抗性基因,其中sul2豐度在所有采樣點(diǎn)中均為最高,絕對(duì)豐度高達(dá)5.05×107-2.17×108copies·g-1,cmle3 次之,絕對(duì)豐度為 2.73×107-1.40×108copies·g-1。
各檢出抗生素質(zhì)量濃度差異不明顯(P>0.05)。與高橋紅樹(shù)林區(qū)(Li et al.,2016)、渤海灣(Zou et al.,2011)及珠江(He et al.,2012)、漢江(Hu et al.,2018)相比,東寨港抗生素的質(zhì)量濃度及檢出率都處于較低水平。這可能與東寨港區(qū)域抗生素間斷性輸入有關(guān),同時(shí),抗生素自身性質(zhì)也可能是重要原因之一,比如磺胺類(lèi)及喹諾酮類(lèi)抗生素具有光敏感性(Thiele-Bruhn,2003;Park et al.,2002)而四環(huán)素類(lèi)抗生素存在吸附-解析行為(Tenenbaum et al.,2014)。
抗生素在海水和沉積物中的殘留量均表現(xiàn)為內(nèi)港區(qū)域高于臨海區(qū)域,這可能與內(nèi)灣區(qū)域海水養(yǎng)殖和養(yǎng)殖塘排污有關(guān);對(duì)各點(diǎn)抗生素質(zhì)量濃度進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn),各采樣點(diǎn)抗生素的污染差異不明顯(P>0.05)。此外,海水中抗生素殘留量高于沉積物,可能與抗生素的水溶性有關(guān)。
3.2.1 海水中ARGs豐度及分布特征分析
內(nèi)港區(qū)域∑ARGs絕對(duì)豐度高于入??凇@肙ne-way ANOVA對(duì)海水中不同點(diǎn)ARGs進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)各采樣點(diǎn)之間并無(wú)顯著性差異(P>0.05),這可能是當(dāng)?shù)睾Kl繁交替而加速各樣點(diǎn)微生物擴(kuò)散導(dǎo)致的。采用相對(duì)豐度進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)東寨港的sul1、sul2檢出豐度(圖2b)比山東地區(qū)海水養(yǎng)殖區(qū)高(李壹等,2016),與海河河水檢出豐度相近(Luo et al.,2010),說(shuō)明該地受到了磺胺類(lèi)抗生素抗性基因的污染。高拷貝數(shù)的sul1和sul2可能是微生物受到磺胺類(lèi)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的,同時(shí)也與 sul基因在環(huán)境中代謝速度慢有關(guān)(Mckinney et al.,2010)。此外,sul1經(jīng)常與一類(lèi)整合子結(jié)合在一起(Sk?ld,2000),兩者之間的緊密關(guān)系也可能是sul1基因表現(xiàn)出高豐度的原因之一。
3.2.2 沉積物中ARGs豐度及分布特征分析
就絕對(duì)豐度而言,內(nèi)港區(qū)域∑ARGs豐度高于入??趨^(qū)域;而相對(duì)豐度呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)(圖2c、圖2d)。內(nèi)港區(qū)域高水平的ARGs絕對(duì)豐度可能與該區(qū)域大面積的海水養(yǎng)殖有關(guān);而其較入海口區(qū)域低的相對(duì)豐度說(shuō)明內(nèi)港ARGs在微生物群落中的表達(dá)低于入??趨^(qū)域。對(duì)沉積物中不同采樣點(diǎn) ARGs進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)各采樣點(diǎn)間的ARGs豐度差異并不明顯(P>0.05),這可能與該區(qū)域抗生素的污染源分布及當(dāng)?shù)仡l繁的水流交換有關(guān)。與長(zhǎng)江口(Guo et al.,2018)和北江流域(Ling et al.,2013)的研究結(jié)果相比,東寨港沉積物中ARGs豐度較高,與灞河相當(dāng)(Jia et al.,2018)。在研究區(qū)域,磺胺類(lèi)抗性基因(sul1、sul2)含量較其他基因處于較高水平,這與珠江水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)調(diào)查結(jié)果一致(梁惜梅等,2013)。sul1和 sul2的高水平表達(dá),說(shuō)明這兩種基因的宿主菌對(duì)各種環(huán)境的耐受能力強(qiáng),從而促進(jìn)了這兩種基因在環(huán)境中的擴(kuò)散與傳播。
本研究表明,東寨港海水和沉積物均受到12種ARGs的影響,與前人研究相比,其豐度處于較高水平。氯霉素是一類(lèi)廣譜性藥物,曾被廣泛用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè),而由于其具有誘發(fā)再生障礙性貧血癥和致畸等強(qiáng)毒副作用(Turton et al.,2000),中國(guó)已于1999年禁止此類(lèi)抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的使用。但近年來(lái)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶類(lèi)耐藥基因(cata1、cata2)及編碼氯霉素外排泵蛋白類(lèi)基因(cmle1、cmle3)在海水養(yǎng)殖區(qū)仍屢屢被檢出(Hu et al.,2008;李壹等,2016),說(shuō)明歷史背景誘導(dǎo)產(chǎn)生的 ARGs仍廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境中。在東寨港海水和沉積物中氯霉素類(lèi)抗性基因(cata1、cata2、cmle1、cmle3)分布極為廣泛,與山東地區(qū)海水養(yǎng)殖區(qū)相比(李壹等,2016),該區(qū)域氯霉素類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度較高。四環(huán)素外排基因(tetA、tetC、tetG)及核糖體保護(hù)外排基因(tetM)常常在海水養(yǎng)殖環(huán)境及自然環(huán)境水體中被檢出(Ling et al.,2013;Luo et al.,2010;Mackie et al.,2006),同時(shí)也廣泛存在于東寨港區(qū)域。在東寨港海水和沉積物中,tetC基因含量均比其他四環(huán)素類(lèi)抗性基因豐度高,這一結(jié)果與對(duì)洪澤湖的研究結(jié)果相似(羅方園等,2017)。此外,喹諾酮類(lèi)抗生素是近年來(lái)使用的一類(lèi)抗生素類(lèi)藥物,但喹諾酮類(lèi)耐藥菌已在多種環(huán)境中被檢測(cè)到。喹諾酮類(lèi)抗性基因(qnrS)東寨港海水和沉積物中檢出率均為100%,其帶來(lái)的污染不容小覷。
3.2.3 海水和沉積物中ARGs差異分析
采用t檢驗(yàn)對(duì)兩種介質(zhì)中ARGs進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間存在明顯的差異(P<0.05),其中沉積物的ARGs豐度顯著高于海水。這說(shuō)明抗性基因在沉積物樣品中的污染比海水嚴(yán)重,即沉積物中ARGs在微生物群落中的表達(dá)高于海水。這一現(xiàn)象可能與沉積物對(duì)污染物的強(qiáng)貯存能力和海水的強(qiáng)擴(kuò)散能力有關(guān),同時(shí)也可能與沉積物中較為活躍的微生物基因交流有關(guān)。東寨港生態(tài)環(huán)境復(fù)雜,為全面了解當(dāng)?shù)匚廴厩闆r,還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
圖3 海水及沉積物中ARGs絕對(duì)豐度及抗生素含量的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis of ARGs in seawater and sediment.
對(duì)東寨港海水/沉積物中ARGs進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖3。海水中SA與∑ARGs之間存在顯著的相關(guān)性(r=0.990,P<0.01);海水中16S rRNA與sul1和 drfA1均存在顯著相關(guān)性(r=0.882和 0.799,P<0.01),而與其他基因相關(guān)性較弱。在沉積物中,介導(dǎo)抗生素外排機(jī)制基因tetC、cmle1、cmle3兩兩之間存在顯著相關(guān)性(r=0.731-0.958,P<0.01或P<0.05)。忽略ARGs的作用機(jī)制不談,在海水樣品中,sul1、sul2、tetA、tetG與∑ARGs、SA之間顯著相關(guān)(r=0.657-0.976,P<0.1或P<0.05)。沉積物中sul1及sul2分別與另外5種ARGs(tetC、tetM、cata1、cmle1、cmle3)存在顯著相關(guān)性(r=0.674-0.964,P<0.01或P<0.05)。此外,sul1、sul2、tetC、tetM、cata1、cmle3與∑ARGs、SA、TA、CA 均存在顯著或極顯著相關(guān)性(r=0.756-0.997,P<0.01或P<0.05),∑ARGs、SA、TA、CA兩兩之間呈極顯著相關(guān)(r=0.838-0.986,P<0.01)。根據(jù)以上分析結(jié)果可知,東寨港海水/沉積物中不同或相同類(lèi)別的ARGs之間都可能存在相關(guān)性,這與灞河的結(jié)果類(lèi)似(Jia et al.,2018),而抗生素產(chǎn)生的選擇壓力和 ARGs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移機(jī)制可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的重要原因。為更全面了解各ARG之間的關(guān)系,進(jìn)一步研究環(huán)境中ARGs的轉(zhuǎn)移機(jī)制十分有必要。
對(duì)已檢出的不同類(lèi)型的抗生素分別進(jìn)行加和統(tǒng)計(jì),并與ARGs進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖3所示??股嘏cARGs之間相關(guān)性較弱(P>0.05),這可能與抗生素的物理化學(xué)性質(zhì)及ARGs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)(Jia et al.,2018)。此外,天氣狀況和水溫等環(huán)境因素也對(duì)抗生素及 ARGs造成影響(Cesare et al.,2017;Peak et al.,2007)。同時(shí),抗生素的低水平及ARGs的高水平檢出說(shuō)明:由歷史背景誘導(dǎo)產(chǎn)生的ARGs可進(jìn)行自我擴(kuò)增而持續(xù)存在于環(huán)境中(Ling et al.,2013)。
(1)東寨港海水和沉積物的ARGs豐度處于較高水平,這將給當(dāng)?shù)匚⑸锶郝浞€(wěn)定性帶來(lái)考驗(yàn)。
(2)沉積物中抗性基因污染比海水嚴(yán)重,說(shuō)明沉積物是東寨港區(qū)域重要的ARGs儲(chǔ)存介質(zhì)。
(3)東寨港抗生素檢出率較低,殘留較少,與ARGs相關(guān)性較弱。