商洛黃芩葉部黃芩苷的提取及抑菌效果試驗

張曉虎，白亞男，殷佳琦，肖秦箭

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

引言

多年生中草藥黃芩，以根入藥，是中國產(chǎn)地分布較為廣泛的一種傳統(tǒng)大宗植物藥材[1～3]。陜西省商洛地區(qū)適宜黃芩生長，所產(chǎn)黃芩產(chǎn)量大、品質(zhì)佳、市場前景良好，被譽為“五大商藥”之一[4]。目前已從黃芩中分離和鑒別出黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、木蝴蝶素A、二氫木蝴蝶素A、千層紙素A和白楊素等超過120種的黃酮糖苷及苷類化合物[5]。

黃芩苷系黃酮衍生物，在黃芩中以羧酸鹽存在，連有葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)，水解后產(chǎn)生黃芩素和葡萄糖醛酸，在常見脂溶性溶劑中均具有一定的溶解度，但只能微溶于熱水。黃芩苷的提取有水提酸沉提取法、堿醇膠胨提取法、超聲提取法、超濾提取法、雙水相分配提取法、超高壓提取法、微波預(yù)處理提取法等多種方法[6,7]；其精制方法也有很多，如重結(jié)晶法、沉淀分離法、高速逆流分離法、大孔樹脂分離法等[8]。已有研究表明，黃芩苷除常用解毒作用外，還具有清除氧自由基、抗氧化、免疫功能調(diào)節(jié)、抗菌及抗病毒、抗腫瘤、腦組織保護和保肝等功效；此外，黃芩苷具有廣泛的抗菌譜，可以抑制白念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌等[9-12]。

中草藥具有的長期使用不容易引起抗藥性、作用溫和等獨有特性已為公眾所熟知，如今黃芩中的黃酮類物質(zhì)開發(fā)用作高效、安全的天然抗氧化劑、防腐劑在食品科學(xué)領(lǐng)域已引起人們的關(guān)注[13]。黃芩的非藥用部位如黃芩葉，大多被種植者所丟棄，造成資源浪費。筆者以商洛山區(qū)豐富的黃芩葉為原材料，采用操作較為繁瑣但提取得率較高的乙醇回流法提取其中的黃芩苷；并以大腸埃希氏菌作為革蘭氏陰性菌的代表，以金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性菌的代表，采用比濁法研究黃芩苷的抑菌作用效果，以期提高當?shù)攸S芩葉的開發(fā)利用價值，為黃芩苷在食品防腐保鮮中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 主要有:

材料：兩年生黃芩葉(2017年10月采摘于陜西省商洛市商州區(qū)黃芩種植基地)。

試劑：黃芩苷標準品；活性炭；甲醇，95%乙醇，均為分析純；鹽酸，氫氧化鈉等。

菌種：大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌。

1.1.2 儀器設(shè)備 研究所用主要儀器設(shè)備見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 原料預(yù)處理 鮮黃芩葉105℃殺青30 min， 40℃恒溫鼓風(fēng)烘干48h至恒重，粉碎后40目篩過篩處理，備用。

表1 主要儀器設(shè)備

1.2.2 黃芩苷標準曲線的制備 黃芩苷標準溶液：準確稱取黃芩苷標準品0.5 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分搖勻即得5μg·mL-1黃芩苷標準溶液。

標準曲線：分別吸取黃芩苷標準溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至6個10 mL的容量瓶中，以甲醇定容，搖勻即得0.5、1、2、3、4、5 μg·mL-1黃芩苷標準溶液。用甲醇溶液為空白對照，在波長278 nm處用紫外可見分光光度計測定各黃芩苷標準溶液的吸光度值。以吸光度為縱坐標(Y)，以黃芩苷標準溶液濃度為橫坐標(X)，用Excel繪制黃芩苷標準曲線見圖1，得線性回歸方程Y=59.778X+0.0019，R2=0.9949。

圖1黃芩苷標準曲線

1.2.3 黃芩葉黃芩苷的提取 主要有:

(1)準確稱取黃芩葉樣品2 g至試管中，加入70%的乙醇作為提取溶劑。

(2)靜置過夜后置入回流燒瓶，回流提取2次，每次60 min，抽濾并合并兩次提取的濾液。濃縮回收提取溶劑乙醇。

(3)濃縮液水浴加熱至50℃，用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至1～2，保溫30 min后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1離心15 min，取沉淀。

(4)沉淀中加入10倍體積的蒸餾水進行攪拌，至完全溶解，用20%的NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在4 000 r·min-1離心15 min，取上清液。

(5)上清液水浴加熱至40℃后，加入等體積的體積分數(shù)為70%的乙醇，并不斷攪拌，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1離心15 min，取上清液。

(6)用鹽酸將上清液pH調(diào)節(jié)至1～2，在80℃下保溫30 min，靜置后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在4 000 r·min-1離心15 min，取沉淀，在60℃烘干至恒重，即為黃芩苷粗品[14]。

1.2.4 黃芩苷得率的計算 準確稱取40 mg黃芩苷粗品至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后精確移取1 mL樣品液于10 mL容量瓶中，再以甲醇定容并充分搖勻，在278 nm波長處，測其吸光度。黃芩苷含量依1.2.2線性回歸方程計算，見公式(1)；黃芩苷得率計算，見公式(2)。

(1)

(2)

式中：X-黃芩苷含量，%；Y-黃芩苷得率，%；C-樣品溶液質(zhì)量濃度，mg·mL-1；V-樣品液體積，mL；N-樣品液測試前稀釋倍數(shù)；M1-吸光度測定所用黃芩苷質(zhì)量，mg；M2-黃芩苷粗品質(zhì)量，mg；M0-黃芩葉樣品質(zhì)量，mg。

1.2.5 單因素實驗 按1.2.3提取工藝及1.2.4計算方法，分別考察料液比(1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20)、乙醇體積分數(shù)(60%、65%、70%、75%、80%)、提取溫度(70、75、80、85、90℃)、提取時間(30、60、90、120、150 min)等4個因素對對黃芩苷得率的影響。

1.2.6 正交試驗設(shè)計 基于1.2.5實驗，選取影響黃芩苷得率較大的3個因素，每個因素選取較優(yōu)的3個水平，以L9(33)設(shè)計正交試驗，以獲得優(yōu)化提取的有關(guān)工藝參數(shù)。

1.2.7 抑菌效果試驗 以比濁法評價抑菌效果，該方法對菌濁液稀釋或濃縮，使其吸光度值在0.2～1的范圍內(nèi)，此范圍內(nèi)的所測吸光度值與濃度之間呈顯著相關(guān)[15]。包括3個階段：

(1)準備階段?；罨褐苽洌褐苽鋬煞莼罨海Q取葡萄糖每份10 g，用蒸餾水配制成10%的溶液，滅菌備用。

菌濁液制備：分別將2種供試菌接種至活化液內(nèi)，置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)搖床120 r·min-1，30℃下培養(yǎng)活化1 h。

液體培養(yǎng)基制備：取18個錐形瓶，編號1～18，分別稱取牛肉膏2.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、水1 000 mL攪拌加熱至全部溶解，分別倒入18個錐形瓶中，每個60 mL，在121℃高壓滅菌20 min，放入4℃冰箱中備用。黃芩苷純化：采用重結(jié)晶法進行黃芩苷的純化，即準確稱取提取所得黃芩苷粗品質(zhì)量后，以10倍的水量加入，用20%的NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.5～7，不斷攪拌直至全部的黃芩苷溶解，加入適量的活性炭充分混勻，在80℃條件下水浴保溫30 min，抽濾以使活性炭除去，濾液用HCl將pH調(diào)節(jié)至1～2，添加等體積的95%的乙醇，攪拌至均勻，置于50℃水浴鍋中保溫反應(yīng)30 min，靜置并過夜使沉淀自然析出，經(jīng)過抽濾，以少量95%的乙醇沖洗沉淀后，將沉淀刮取下來，在60℃下烘干，即得黃芩苷純品[16]。

經(jīng)純化處理后的黃芩苷溶液的配制：取純化的黃芩苷0.5 g，用甲醇溶解配制成濃度為1、2、4、6、8、10 mg·mL-1的黃芩苷溶液，備用。

(2)接種與培養(yǎng)階段。在無菌操作臺向1～6號錐形瓶內(nèi)各加入1 mL金黃色葡萄球菌的菌濁液，并按次序分別加入6個濃度的黃芩苷溶液；向7～12號錐形瓶內(nèi)各加入1 mL大腸埃希氏菌的菌濁液，并按次序分別加入6個濃度的黃芩苷溶液；向13～18號錐形瓶內(nèi)依次分別加入6個濃度的黃芩苷溶液，置搖床120 r·min-1，37℃下培養(yǎng)24 h。

(3)評價階段。以在無菌的液體培養(yǎng)基中加入相同濃度的黃芩苷溶液作為對照，等比例稀釋菌濁液組與對照組，在278 nm波長處測定吸光度。在同一稀釋濃度下，若吸光度值大于對照組，則說明有菌生長，且差值越大，菌種生長越旺盛；若吸光度值小于對照組，則說明無菌生長；若吸光度值相同，則說明培養(yǎng)基內(nèi)完全無菌種生長的黃芩苷溶液最低濃度即為黃芩苷對該菌種的最低抑制濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比 圖2所示，隨料液比的增大，黃芩苷得率先增大，當料液比為1∶12時，達到最大為2.01%；料液比超過1∶12后，黃芩苷得率反而減小。究其原因是料液過小且抽濾后濾液更少，使提取不夠充分；料液比過大，加熱時的負荷增多，使提取達到完全程度耗時增加，在有限時間內(nèi)提取不完全，致使得率變小。所以，料液比1∶12為宜。

圖2料液比對黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.1.2 乙醇體積分數(shù) 圖3所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，黃芩苷得率先增大后減小。當乙醇體積分數(shù)60%時，黃芩苷得率僅為1.12%；而70%時的黃芩苷得率達到最大為2.02%。這可能是因為乙醇低體積分數(shù)時，溶出的水溶性雜質(zhì)量增加，黃芩苷得率較低；70%乙醇與黃芩苷極性相似，利于黃芩苷的溶出，黃芩苷得率最大；當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大時，黃芩苷得率反而逐漸下降，是由于乙醇溶液極性較小，導(dǎo)致黃芩苷得率下降。因此，選取乙醇體積分數(shù)70%為宜。

圖3乙醇體積分數(shù)對黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.1.3 提取溫度 圖4所示，隨提取溫度的升高，黃芩苷得率有所增加，80℃時黃芩苷在乙醇中的溶出程度最大，所以得率最高；而高于80℃時黃芩苷得率開始下降，是因為黃芩苷在高溫下極不穩(wěn)定，過高的溫度造成黃芩苷部分分解。因此，選取80℃的提取溫度為宜。

圖4提取溫度對黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.1.4提取時間 圖5所示，黃芩苷得率隨提取時間變化趨勢緩慢，總體上隨時間的增加先增大后減小，當提取時間為60 min時，黃芩苷得率達到最大為2.02%；提取時間超過60 min，黃芩苷得率未升而降。這是因為黃芩中的可溶性物質(zhì)如單寧、蛋白質(zhì)、黏液等水溶性和醇溶性雜質(zhì)伴隨提取時間的增加被更多地溶解釋放出來，從而使黃芩苷分子被包裹起來，導(dǎo)致其向溶液中的擴散受阻，以致黃芩苷得率有所下降[17]。但相對其他三個因素而言，提取溫度對黃芩苷得率的影響并不顯著。

圖5提取時間對黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，在固定提取時間60 min的前提下，選取對黃芩苷得率影響較大的料液比(A)、乙醇體積分數(shù)(B)、提取溫度(C)3個因素，每因素選取3個水平，采用L9(33)設(shè)計正交試驗，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由表2直觀分析可知，B的極差較大、其次為A、再次為C，因此，對黃芩苷得率的影響因素排列為：B>A>C，即乙醇體積分數(shù)>料液比>提取溫度；得到的提取黃芩苷最優(yōu)工藝組合為A2B1C2，即在提取時間60 min的條件下為：料液比1∶12、乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度80℃，黃芩葉中黃芩苷得率2.03%。

表2 L9(33)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 驗證實驗結(jié)果與分析

在黃芩苷提取的最優(yōu)工藝下進行驗證實驗，取3次平行實驗的平均值，驗證該條件下黃芩苷得率的穩(wěn)定性。即準確稱取黃芩葉樣品2g，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液浸泡過夜，料液比為1∶12，在80℃下回流提取2次，每次60 min，按1.2.3的方法進行黃芩苷的提取，并按1.2.4的方法計算黃芩苷得率，結(jié)果見表3。

由表3可知，3次實驗的黃芩苷得率穩(wěn)定，表明采用乙醇回流法對黃芩葉中的黃芩苷進行提取的優(yōu)化工藝可行。

2.4 抑菌效果試驗結(jié)果與分析

黃芩葉中的黃芩苷對2種供試菌的抑菌效果試驗結(jié)果見表4。

表3 黃芩苷提取工藝驗證實驗結(jié)果

注: 表中“+ ”表示同稀釋濃度下的吸光度值>對照組；“-”表示吸光度值<對照組，即無菌生長。

由表4可知，在金黃色葡萄球菌的菌濁液添加黃芩苷溶液濃度超過4 mg·mL-1時，表現(xiàn)出抑菌效果；在大腸埃希氏菌的菌濁液添加黃芩苷溶液濃度超過8 mg·mL-1時，表現(xiàn)出抑菌效果。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

研究以采集的商洛黃芩葉片為原料，設(shè)置正交試驗用于探討乙醇回流法提取黃芩苷的工藝條件，試驗得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)為：當料液比1∶12，采用體積分數(shù)70%的乙醇，在80℃下回流提取兩次，每次60 min，黃芩苷得率達2.03%。

分別以革蘭氏陰性菌中的大腸埃希氏菌、革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌為試驗菌種，用最小抑制濃度評價黃芩苷的抑菌效果，試驗表明：菌濁液中添加黃芩苷溶液濃度大于4 mg·mL-1時，對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑制作用；添加黃芩苷溶液濃度大于8 mg·mL-1時，對大腸埃希氏菌表現(xiàn)出抑制作用。

3.2 討論

一般黃芩除藥用部位其干燥根入藥外，其他非藥用部位大多被丟棄，且目前對黃芩葉中活性成分研究又較少，使黃芩葉資源利用不夠充分。筆者對黃芩葉中的有效成分黃芩苷提取并進行抑菌效果研究，其初步成果將能夠作為食品防腐保鮮的技術(shù)參考，有利于促進黃芩葉資源的綜合利用。

試驗得出的優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以及影響黃芩苷提取得率的因素排序為乙醇體積分數(shù)>料液比>提取溫度等，與雷燕妮等人的研究結(jié)果基本一致[18]；黃芩苷對供試菌的抑菌效果與張有志等人試驗結(jié)論基本一致[19]。

試驗對金黃色葡萄球菌抑制作用的黃芩苷溶液濃度大于4 mg·mL-1，而孫冬梅等[20]的研究表明對金黃色葡萄球菌起抑制作用的黃芩苷濃度最低為2 mg·mL-1。這可能是由于黃芩苷的純化過程中加入的活性炭過少，導(dǎo)致純化的不完全，仍含有部分雜質(zhì)，使得出的最低抑菌濃度偏高，也可能是因為選用的黃芩苷溶液濃度梯度過少，導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏差。